用于微生物光遗传学应用的自动化光照、培养与取样系统的设计与实现

本实验的总体目标是构建一个连续培养装置，用于在多天时间内通过显微镜自动实时测量光遗传微生物在光照下的反应。该方法有助于回答细胞生物学和代谢工程领域的一些关键问题，例如动态基因表达如何引发与静态基因表达不同的生物学响应。该方法的主要优势在于，连续培养可实现持续多天的数据采集。

首先，将数字温度计的接地线、数据线和正电压线焊接到印刷电路板上。从一个三针母头排针上剪掉一个引脚，并修剪剩余的两个引脚。将该排针焊接到标有 R2 的一对孔中，并通过在排针中插入一个 4.7 千欧电阻，将两个焊接的引脚连接起来。

接下来将剩余组件连接到电路板上。将电路板叠加安装到微控制器上。搭建避光 enclosure，并按照随附的文字版实验方案安装所有软件。

首先，将铝制接口的长端穿过垫圈插入培养容器中，并拧紧盖子。用中等直径的硅胶管覆盖一个短铝制接口的出口。通过插入一个雌性鲁尔锁接头，然后连接一个雄性鲁尔锁堵头，将远端密封。

此出口为辅助用途，不会被使用。使用带有公母鲁尔锁扣的中等直径硅胶管短管连接两段。然后将一端连接到短铝制端口出口，并将远端堵住。

将通过此管路对容器进行接种。接下来，将两根中等长度的管路连接到中等直径的蠕动泵管路及其接头的两端。将其中一端连接至一个短铝接口，另一端则用堵头封闭。

随后，将其连接至培养基瓶。将一根中等直径的硅胶管连接至最长的铝制接口。该管的长度应足以到达培养基瓶。

连接另一段几英寸长的短管至末端，然后将其插入培养基瓶的橡胶塞中。夹紧管路。当后续松开夹子时，此连接可使培养物通过进入的气泡进行混合、通气，并维持正压状态。

插入一根中等直径的导管，长度需足以到达烧瓶底部，穿过用于转移培养基的橡胶塞。将另一根中等直径导管与此导管连接，末端再连接一根粗直径导管。将远端导管堵住。

用一段中等直径的短橡胶管插入塞子的第三个孔中，并连接另外两段中等直径的橡胶管，远端用塞子封住。此装置将先连接真空泵，之后连接水族泵。将一个公型鲁尔锁接头插入一段细直径的硅胶管中，然后牢固地插入聚四氟乙烯（PTFE）管。

然后将一个中等直径的管子连接到雌性鲁尔锁上。将雌性锁沿PTFE管穿入，以连接锁具，并将另一端连接到一个短的铝制接口上。确保培养容器内的PTFE管悬垂在第二长的铝管下方，且高于容器底部。

根据需要进行修剪。此处将用于向成像通道输送培养基，细管可最大限度减少中间体积。接下来，将暴露的细硅胶管连接至细蠕动泵管及接头。

将三段窄径管和两段聚四氟乙烯（PTFE）管交替连接至此处，并通过中等直径管连接至流出液烧瓶。然后，将一段中等直径硅胶管的一端连接至流出液烧瓶另一端铝接口中最长的第二根管。

该铝管用于设定培养液体积，多余的培养液将溢流至废液容器中。用铝箔包裹锥形瓶的瓶盖，然后在121摄氏度、15 PSI条件下高压灭菌30分钟。将真空滤器连接至一个100毫升的瓶子上。

取下乳头盖，然后用无菌镊子从真空滤器的乳头处取出白色塞子。将粗的硅胶管连接到乳头上，将培养基瓶的另一根游离管连接至真空泵，并确保连接培养基瓶与培养容器的第三根管路被夹紧关闭。用培养基填充滤器，开启真空泵，然后过滤剩余的培养基。

夹紧连接真空泵的中等硅胶管，关闭真空泵。将连接真空泵的中等硅胶管中间段的鲁尔接头拔下，插入无菌注射器空气过滤器的蓝色端。然后夹紧粗硅胶管，断开其上的雄性鲁尔接头。

将插头从培养容器的培养基入口管的雌性鲁尔接头断开。连接这些鲁尔接头，以使培养基能够被泵入培养容器。然后，从100毫升瓶子上取下滤器，并安装瓶盖。

使用该培养基制备种子培养物。将连续培养装置放置在显微镜附近，使培养基瓶的位置高于培养容器，流出液瓶的位置低于培养容器，以防止倒流。用胶带将培养基瓶和流出液瓶的橡胶塞牢固固定。

接下来，将PTFE管的两端从连接它们的细硅胶管上拔下，并将这两端插入已准备好的微流控装置的入口和出口。然后，通过将注射器空气过滤器的白色端连接到水族泵上，将培养基推入培养容器中。当培养基达到流出端口的水平时，将培养基入口管路及连接头缠绕在慢速蠕动泵上，将细的样品出口管路及连接头缠绕在快速蠕动泵上。

通过松开培养基瓶与培养容器之间的通气管来对培养基进行通气。然后，将加热垫和温度计用胶带固定在培养容器上，以便控制其温度。将培养基导管盘绕在培养容器周围，使流入的培养基与容器温度保持一致。

然后将培养容器插入LED矩阵上方的黑色泡沫外壳中，并确保管路未被夹住。使用生物反应器控制器插件，设置缓慢培养基泵每30秒开启一次，每次持续十分之一秒。流速会非常低，但应高于蒸发速率。

夹住连接培养基瓶与培养容器之间的进气管。用移液器从预培养物中取1毫升接种至培养容器中。然后夹紧该管的蒸馏端，并松开进气管。

让培养物过夜生长。遮盖培养容器以避免光线进入。第二天，使用生物反应器控制器插件将蠕动泵的运转时间设置为更长的比例，以对应所需的培养基流速和取样流速。

让培养物密度过夜平衡。第二天，在显微镜载物台位置列表和显微管理器中设置一组不重叠的位置，使泵入微流控通道的细胞处于焦平面。然后打开生物反应器控制器插件。

根据提示选择所需的LED矩阵时间序列、成像通道及其他实验设置，然后开始采集数据。该装置用于刺激一培养物酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），该酵母通过可诱导的光遗传转录系统在蓝光照射下表达黄色荧光蛋白。已获取微流控通道的明场对比图像和荧光图像。

通过相差图像识别细胞轮廓，并将其映射到荧光图像上，同时实时记录荧光图像。此处的热图显示了由于光遗传系统激活后产生黄色荧光蛋白，导致培养物中荧光信号的分布情况。分析来自70小时、28个载物台位置采集的超过30,000张图像，共检测约170,000个细胞的荧光信号。

在本研究中，培养物被暴露于不同强度的蓝光下，每次持续六小时，随后进行六小时的完全黑暗处理。由于在首次测量前细胞已接受过光照，因此在第一个黑暗阶段其荧光强度呈现下降趋势。只要操作得当，掌握该技术后可在三天内完成，总计耗时八小时。

在进行该实验操作时，使用无菌技术至关重要。完成该操作后，还可采用其他方法（如实时反馈控制）来调控蛋白质浓度。该技术将能够实现对携带光遗传学构建体的生物体进行动态研究，并且研究时间可长于使用培养皿或批量培养方法所能达到的时间。

观看本视频后，您应能够充分理解如何整合连续培养装置、光源和显微镜，以刺激并研究光遗传微生物。