设计和自动照明，培养和取样系统实现微生物光遗传学的应用
February 19th, 2017
我们设计用于光遗传学系统一起使用，照亮微生物的培养，并定期图像细胞出水倒置显微镜连续培养装置。培养，取样，成像和图像分析完全自动化，使得光照动态响应可以在几天进行测量。
该程序的总体目标是组装一个连续培养容器，其中可以用显微镜自动实时和多天地测量对光遗传学微生物照明的反应。这种方法可以帮助回答细胞生物学和代谢工程中的关键问题，例如动态基因表达如何引发不同于静态基因表达的反应。这种方法的主要优点是连续培养可以收集多天的测量值。
首先，将数字温度计的接地线、数据线和正电压线焊接到印刷电路板上。从母 3 针接头上剪下一个引脚，并修剪其余两个引脚。将其焊接在标记为 R2 的一对孔中，并通过在引脚接头中插入一个 4.7 千克欧姆的电阻器来连接两个焊接的引脚。
接下来，将其余组件连接到电路板。将电路板覆盖到微控制器上。设置防光外壳，并按照随附的文本协议中的说明安装所有软件。
首先，将铝端口的长端穿过垫圈放入培养容器中，然后拧上盖子。用中等直径硅胶管盖住一个短的铝制端口出口。插入母鲁尔锁，然后连接公鲁尔锁塞，塞住蒸馏端。
此插座是补充的，不会使用。将两短段中等直径硅胶管与公头和母头鲁尔锁连接。然后将一端连接到一个短的铝制端口出口，并塞住蒸馏端。
该容器将通过该管接种。接下来，将两根中型管连接到中等直径蠕动管和连接器的末端。将一端连接到短铝制端口，然后插入另一端。
稍后，这将连接到介质烧瓶。将中等直径的硅胶管连接到最长的铝制端口。试管应足够长，以便能够到达培养基培养瓶。
将另一个几英寸长的短段连接到末端，然后将其插入培养基培养瓶上的橡胶塞中。夹住管子。当稍后松开夹持时，这种连接允许培养物混合、通气，并通过进入的气泡保持正压。
将一根长度足以到达培养瓶底部的中等直径试管插入塞子中，培养基将通过塞子转移。将另一根中等直径的管子连接到这根管子上，然后在末端连接一根宽口径的管子。塞住蒸馏端。
用一小段中等直径的管子填充塞子上的第三个孔，连接到另外两段中等直径的管子，并在蒸馏端塞住。这将连接到真空泵，然后连接到水族泵。将公鲁尔锁插入一段窄直径硅胶管中，然后牢固地插入 PTFE 管。
然后将母鲁尔锁连接到中等直径的管子上。沿 PTFE 管穿入母锁，将锁和另一个连接到短铝制端口。确保培养容器内的 PTFE 管悬挂在第二长的铝管下方和底部上方。
根据需要修剪。培养基将从这里采样到成像通道，窄管可最大限度地减少中间体积。接下来，将裸露的窄硅胶管连接到窄蠕动管和连接器。
为此，将三段窄直径管和两段 PTFE 管交替连接。通过中等直径的管路将其连接到流出物瓶。然后将中等直径硅胶管的一端连接到流出物瓶另一端铝制端口的第二长管。
该铝管设置培养物体积，多余的培养物溢出到流出物容器中。用铝箔包裹烧瓶盖，然后在 121 摄氏度和 15 PSI 的压力下高压灭菌组件 30 分钟。将真空过滤器安装到 100 毫升瓶子上。
取下奶嘴盖，然后用无菌镊子从真空过滤器的奶嘴上取下白色塞子。将宽硅胶管连接到奶嘴，将培养基培养瓶的另一根自由管连接到真空泵，并确保将培养基培养瓶连接到培养容器的第三根管子夹紧。用介质填充过滤器，打开真空泵，然后过滤其余介质。
夹住连接到真空装置的中型硅胶管，然后关闭真空泵。从连接到真空泵的中型硅胶管的中间段上取下鲁尔接头，然后将无菌注射器空气过滤器的蓝色端插入该管中。然后夹住宽硅胶管并断开公鲁尔接头与它的连接。
从培养容器培养基入口管的母鲁尔接头上拔下插头。连接这些鲁尔接头，以便将培养基泵入培养容器中。然后，从 100 毫升瓶子中取出过滤器，并盖上瓶盖。
使用此培养基制备发酵剂。将连续培养组件放在显微镜附近，使培养基培养瓶高于培养容器，流出物瓶低于培养容器，以防止回流。将橡胶塞牢固地粘在培养基和流出物瓶上。
接下来，从连接它们的狭窄硅胶管上拔下 PTFE 管的末端，并将这些末端插入准备好的微流体装置的入口和出口。然后将注射式空气过滤器的白色端连接到水族泵，将培养基推入培养容器中。当介质达到流出口的水位时，将介质介质入口管路和接头缠绕在慢速蠕动泵周围，将狭窄的样品出口管路和接头缠绕在快速蠕动泵周围。
通过松开培养基培养瓶和培养容器之间的空气管来给培养基充气。然后，将加热垫和温度计贴在培养容器上，以便控制其温度。将培养基管缠绕在培养容器周围，使进入的培养基与容器处于相同的温度。
然后将培养容器插入 LED 矩阵上方的黑色泡沫外壳中，确保试管没有被夹住。使用生物反应器控制器插件将慢速培养基泵设置为每 30 秒间隔的十分之一。流速将非常低，但大于蒸发速率。
夹住培养基培养瓶和培养容器之间的进气管。使用移液管用 1 毫升发酵剂接种培养容器。然后夹住这根管的蒸馏端，松开空气管。
让文化在一夜之间成长。盖上外壳，使光线无法进入。第二天，使用生物反应器控制器插件将蠕动泵设置为根据所需的培养基和采样流速旋转更长的时间。
让培养密度平衡过夜。第二天，用一组不重叠的位置填充载物台位置列表和微管理器，其中泵入微流体通道的细胞将位于焦平面中。然后打开 bio reactor controller 插件。
从提示中选择所需的 LED 矩阵时间进程、成像通道和其他实验设置，然后开始收集数据。该装置用于刺激酿酒酵母培养物，通过诱导型光遗传学转录系统在蓝光下表达黄色荧光蛋白。获取微流体通道的基础对比度和荧光图像。
从相差图像中识别细胞轮廓，映射到荧光图像，并实时记录荧光图像。此处的热图显示了光遗传学系统激活后由于产生黄色荧光蛋白而产生的培养物的荧光分布。从 70 小时内从 28 个阶段位置获取的 30， 000 多张图像中分析了大约 170， 000 个细胞的荧光。
在这项研究中，培养物每隔 6 小时暴露于不同强度的蓝光下，然后是 6 小时的完全黑暗。细胞在第一次测量之前已经暴露在光线下，这就是为什么在第一次黑暗期间它的荧光强度会降低。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 8 小时内完成，为期三天。
在尝试此程序时，使用无菌技术非常重要。按照此程序，可以使用其他方法（如实时反馈控制）来控制蛋白质浓度。该技术将使具有光遗传学构建体的生物体能够动态地进行研究，研究时间更长，比使用平板或批量培养的时间更长。
看完这个视频后，您应该对如何整合连续培养设备、灯和显微镜来刺激和研究光遗传学微生物有一个很好的了解。
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概述
本研究介绍了一种为光遗传学系统设计的连续培养装置，能够照明微生物培养物并在数天内自动成像细胞。该系统允许对光暴露的动态响应进行实时测量。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 代谢工程
- 光遗传学
背景
- 理解动态基因表达对细胞生物学至关重要。
- 静态基因表达反应可能与动态反应显著不同。
- 连续培养系统便于长期观察微生物反应。
- 自动成像提高了数据收集的效率。
研究目的
- 测量光遗传学微生物对照明的响应。
- 研究动态和静态基因表达之间的差异。
- 开发完全自动化的培养和成像系统。
使用的方法
- 连续培养容器的组装。
- 集成数字温度计进行温度监测。
- 使用倒置显微镜进行成像。
- 自动化培养、取样和图像分析过程。
主要结果
- 该装置成功照明了培养物并自动成像细胞。
- 对照明的动态响应可以在多天内进行测量。
- 收集的数据为基因表达动态提供了见解。
- 该方法在研究微生物行为方面显示出优势。
结论
- 连续培养装置适用于实时研究。
- 自动化系统可以增强细胞生物学研究。
- 该方法为探索代谢工程开辟了新途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
This automated culturing system enables prolonged, real-time monitoring of optogenetic microbial responses, addressing a key challenge in metabolic engineering: linking dynamic gene expression to phenotypic outcomes over extended periods. By integrating programmable illumination with continuous culture and automated imaging, the platform supports mechanistic de-risking of synthetic biology constructs before scale-up. The ability to quantify fluorescence and morphology across thousands of cells over multiple days enhances predictive confidence in strain performance under industrially relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking optogenetic induction to dynamic protein production in yeast.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time, quantitative fluorescence tracking of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Measures how temporal patterns of illumination affect cellular output, informing dose-response modeling for inducible systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated microbial systems for downstream screening by stabilizing culture conditions in a chemostat format.
- Quantitative Output: Generates standardized, time-resolved fluorescence and morphology data from effluent sampling for assay optimization.
- Scalability: Automated sampling and imaging enable high-content, reproducible data collection across multiple conditions without manual intervention.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses Saccharomyces cerevisiae as a disease-relevant system for studying conserved eukaryotic signaling pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing dynamic phenotypic data not accessible in batch or plate-based assays.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how dynamic versus static gene expression influences metabolic burden and product yield, reducing uncertainty in strain selection.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and phenotypic validation in translational research through real-time, longitudinal data capture.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking optogenetic stimulation to temporal changes in gene expression and cellular morphology.
- Screening: Ensures assay reproducibility through automated effluent sampling and standardized imaging of cells in microfluidic channels.
- Analytics: Enables comparison of conditions via quantitative fluorescence intensity measurements from over 30,000 images across 70 hours.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating optogenetic induction with measurable changes in YFP expression as a proxy for pathway activity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for testing various optogenetic constructs, promoters, or metabolic pathways under controlled dynamic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how dynamic stimuli affect microbial cell factories.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through fully automated culturing, sampling, and image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early identification of strains with favorable dynamic response profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing longitudinal data that better predict performance in fed-batch or industrial fermentation settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culturing, optogenetics, and microfluidic integration.
- Needs instrumentation including peristaltic pumps, LED matrix, microscope, and bioreactor control software.
- Demands cross-team standardization for consistent setup of light exposure regimes and sampling intervals.
- Involves adaptation considerations when applying the system to different microbial hosts or optogenetic tools.
- Includes practical limitations such as the need for sterile technique and careful tubing configuration to prevent contamination or backflow.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:41
Electronics Setup and LED Calibration
1:23
Prepare the Culturing Vessel
2:25
Prepare the Media Flask
5:01
Media Flask Filling
6:16
Apparatus Assembly at the Microscope
7:55
Culture Vessel Inoculation and Microbe Imaging
9:05
Results: Optogenetic Activation of S. cerevisiae
3:30
Prepare the Effluent Flask
10:19
Conclusion
