定量微中和试验的优化
December 14th, 2016
这项研究描述了一个 成像基于微中和测定来分析病毒之间的抗原关系。该协议采用平板扫描仪，有四个步骤，包括滴定，滴定定量，中和，中和定量。该法与目前流行的流感A（H1N1）pdm09，A（H3N2）和乙型流感病毒效果很好。
这种微量中和测定的总体目标是以定量、高通量和高灵敏度的方式表征所有类型的当前流行的流感病毒以及抗体和抗病毒测量的活性。这种方法可以帮助回答病毒学领域的关键问题，例如流感病毒的抗原表征、抗体的定量中和以及抗病毒活性。该技术的主要优点是它表征了整个受感染的细胞群，包括可见和不可见的斑块以及单细胞感染。
该微量中和试验将由伦敦 WHO 流感合作中心助理主任 Yipu Lin 博士演示。以下方案的生物安全级别 （BSL） 是季节性流感病毒的 BSL 2 和潜在大流行性流感病毒的 BSL 3+。首先，将足够的细胞分装到 96 孔板中。
将细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 2 到 3 天以达到汇合。使用 70% 乙醇，对多孔洗板机进行消毒，并使用 PBS 或 VGM 冲洗。然后，使用 200 μL 病毒生长培养基或 VGM 洗涤汇合细胞。
从细胞中吸出 VGM，并立即向每个孔中加入 50 μL VGM。接下来，向六个无菌管中的每个管中加入 900 微升 VGM。然后，将 100 微升病毒移液到第一管中并充分混合。
从第一管开始准备病毒的连续稀释液，在每次稀释之间更换吸头。从最高稀释度开始，每种病毒稀释液加入 50 微升，以重复 96 孔板的孔。然后，将板在 37 摄氏度下放置 2 到 3 小时，让病毒感染细胞。
根据文本协议准备覆盖层后，从孔中取出接种物。然后，向每个孔中加入 200 μL 覆盖层，并在 37 摄氏度下孵育过夜，不受干扰。向孔中加入 200 微升冰冷的 4% PFA 的 PBS A 溶液，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟或室温下孵育 20 分钟。
孵育后，吸出 PFA，并使用每孔 200 微升 PBS A 洗涤板两次。向板中加入 100 μL 透化缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。然后，使用 PBS A 洗涤板两次。
接下来，向孔中加入每孔 50 μL 的抗 A 型流感小鼠单克隆抗体，并在室温下振荡孵育 1 小时。孵育后，使用 300 微升洗涤缓冲液将孔洗涤 3 次。然后，向样品中加入 50 μL HRP 偶联的山羊二抗，并在室温下孵育 1 小时。
像以前一样洗涤孔 3 次后，每孔加入 50 μL 底物，并在室温下孵育 30 分钟或直到清晰可见蓝色。为了停止反应，请使用 200 微升蒸馏水清洗孔两次。然后，风干板后，将其存放在黑暗的地方。
将孔板放置在平板扫描仪的扫描区域，使用 L 形位置限制，以确保可以获得最佳且可重复的成像位置。使用此处显示的设置扫描板。然后，运行孔板阅读器软件，通过单击"加载图像"按钮加载图像来计算所需的病毒浓度。
接下来，在 global threshold 选项卡中，滑动直方图中的红色条以调整采样阈值。然后，单击 更新 按钮以检查对图像的影响。现在，勾选 Calculate Neutralization/Titration 框。
单击 Sampling 按钮以定量感染的细胞群或 ICP。然后，在出现提示时，单击 Save 按钮以保存采样结果。要获得滴定结果，请加载或输入孔板定义图。
滴定：最佳病毒种群表示阈值。选择 Titration Process（滴定过程）选项卡以计算滴定结果。然后，检查滴定结果，然后单击 Save and Close（保存并关闭）按钮以保存结果。
有关软件的更详细说明，请参阅补充 S1。要进行病毒中和，请提前两到三天准备细胞单层。然后，向板的每个孔中加入 50 微升 VGM。
将第 11 列和第 12 列分别用于病毒对照和细胞对照。将 50 微升等分试样的 1：20 稀释的受体破坏酶或 RDE，处理过的血清添加到第 1 至 10 列的第一行中。通过将 50 μL 从 A 行转移到 H 行并从 H 行丢弃 50 μL 来进行两次连续稀释，然后向细胞对照柱的每个孔中加入 50 μL 稀释剂。
向板的每个孔中加入 50 μL 病毒，细胞对照柱除外。将板在 37 摄氏度下孵育 2 到 3 小时。然后，去除接种物，并将覆盖层添加到每个孔中。
将板在 37 摄氏度下孵育过夜，不受干扰。然后，按照本视频前面所示对板进行固定和染色。为了定量中和作用，将孔板放在平板扫描仪的扫描区域，如本视频前面所示。
扫描板并运行孔板阅读器软件，以像以前一样计算所需的病毒滴度。加载或输入孔板图后，在 Neutralization：Infection Deduction 中表示阈值。然后，选择 Neutralization Process 以计算滴度。
最后，检查滴度，然后单击 Save and Close 按钮保存中和结果。此处显示的是 8 种输入病毒的近期抗原表征实验的滴定结果，稀释度在 1.0 乘以 10 至负 10 至 1.0 倍至负 6 之间。该图表明 ICP 随着病毒稀释度的增加而减少。
根据在孔内所有细胞中产生感染的相同病毒的 ICP 对曲线进行标准化。下表列出了产生 30% ICP 饱和度的病毒稀释液，这些稀释液被选为用于中和的输入病毒稀释液。该图显示了使用一种输入病毒对抗五种抗血清的中和实验的结果。
该图说明了血清稀释度增加的感染过程。纵轴上的标准化阳性群体表示来自相应抗血清反应的 ICP 与参考病毒的平均 ICP 的比率。最后，将中和滴度确定为对应于 50% ICP 降低的抗血清稀释液的倒数。
该检测侧重于一致性、速度和检测灵敏度，包括输入病毒的定量滴定、高通量成像和数据处理。它具有成本效益、用户友好性，并已常规用于病毒抗原研究。
概述
本研究提出了一种微中和试验，旨在分析流行的流感病毒之间的抗原关系。该协议使用平板扫描仪，涉及四个主要步骤：滴定、滴定定量、中和和中和定量。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 免疫学
- 传染病
背景
- 该试验旨在表征当前流行的流感病毒。
- 它定量测量抗体活性和抗病毒效果。
- 该方法是高通量和高度敏感的。
- 它解决了病毒学领域的关键问题。
研究目的
- 表征流感病毒的抗原性质。
- 定量抗体的中和能力。
- 以系统的方式评估抗病毒活性。
所用方法
- 在96孔板中制备细胞单层。
- 病毒的系列稀释以进行滴定。
- 使用平板扫描仪定量感染的细胞。
- 应用特定抗体进行检测和分析。
主要结果
- 该试验有效地表征了整个感染的细胞群体。
- 结果表明，随着病毒稀释的增加，感染的细胞群体减少。
- 成功定量了中和和滴定结果。
- 视觉数据支持了该试验在分析流感病毒方面的有效性。
结论
- 微中和试验是病毒学研究的宝贵工具。
- 它提供了关于流感病毒抗原关系的见解。
- 该方法增强了我们对抗体反应和抗病毒活性的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This imaging-based micro-neutralization assay enables quantitative, high-throughput characterization of influenza virus antigenic relationships by measuring the entire infected cell population. It supports antiviral and antibody activity assessment in a cost-effective, scanner-based format suitable for most laboratories. The method enhances predictive confidence in target validation by providing reproducible titration and neutralization data across virus subtypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of virus infectivity and antibody-mediated neutralization.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing antigenic properties of circulating influenza strains without reliance on plaque formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral and antibody screening workflows.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs via imaging and software-based analysis.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and scalability for influenza antiviral and immunogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity from discovery through preclinical evaluation of antibody and antiviral candidates.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions via consistent titration and neutralization readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from early virus characterization to lead identification in antiviral and antibody development programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus-cell interactions and immune interference.
- Screening: Enables assay readiness through standardized virus titration and infected cell population quantification.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of infected cell populations and neutralization titers for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by supporting antigenic characterization relevant to vaccine and therapeutic evaluation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging-based platform for influenza virus studies across multiple seasons and strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in virus-antibody interactions.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability through fixed imaging protocols and automated software analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable antigenic and neutralization data for portfolio prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through consistent, quantitative assessment of antibody and antiviral candidates.
Implementation Considerations
- Requires virology and immunology expertise for virus handling, antibody preparation, and assay interpretation.
- Depends on flatbed scanner accessibility and compatible software for image acquisition and infected cell population quantification.
- Necessitates cross-team standardization of virus titration protocols and well plate mapping for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-influenza viruses or alternative cell lines based on infectivity optimization.
- Practical limitations include dependency on sufficient virus infectivity in selected cell lines for reliable imaging contrast.
