定量微量中和试验的优化

本微量中和实验的总体目标是以定量、高通量且高度敏感的方式，对当前流行的所有类型流感病毒以及抗体和抗病毒药物的活性进行表征。该方法有助于回答病毒学领域的一些关键问题，例如流感病毒的抗原特性分析、抗体的定量中和能力以及抗病毒活性检测。该技术的主要优势在于能够对整个感染细胞群体进行表征，包括可见和不可见的蚀斑以及单细胞感染。

微量中和试验将由位于伦敦的世卫组织流感合作中心助理主任林一璞博士演示。以下方案的生物安全水平（BSL）针对季节性流感病毒为BSL 2，针对潜在大流行性流感病毒为BSL 3+。首先，将足够数量的细胞分装至96孔板中。

在37摄氏度、5% CO2条件下培养细胞两至三天，直至细胞汇合。使用70%乙醇对多孔板洗涤器进行灭菌，并用PBS或病毒培养基（VGM）冲洗。随后，用200微升病毒生长培养基（VGM）洗涤汇合的细胞。

吸出细胞中的 VGM，立即向每个孔中加入 50 微升 VGM。接着，向六支无菌试管中每管加入 900 微升 VGM。然后，用移液器将 100 微升病毒液加入第一支试管中，并充分混匀。

从第一管开始进行病毒的连续稀释，每次稀释均需更换枪头。从最高稀释度开始，向96孔板的复孔中各加入50 µL病毒稀释液。随后，将该板置于37 °C环境中2至3小时，以使病毒侵染细胞。

根据文本方案制备覆盖液后，移除各孔中的接种物。然后，向每孔加入 200 微升覆盖液，于 37 摄氏度静置孵育过夜。向各孔中加入 200 微升冰上预冷的含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS A 溶液，于 4 摄氏度孵育 30 分钟，或于室温孵育 20 分钟。

孵育结束后，吸除PFA，每孔加入200 µL PBS A洗涤两次。向孔板中加入100 µL透化缓冲液，室温孵育30分钟。随后用PBS A洗涤孔板两次。

接下来，每孔加入 50 µL 针对 A 型流感病毒的小鼠单克隆抗体，于室温下振荡孵育 1 小时。孵育结束后，用 300 µL 洗涤缓冲液洗涤每孔 3 次。然后，向样本中加入 50 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的 goat 二抗，在室温下孵育 1 小时。

按照之前的方法洗涤反应孔三次后，每孔加入 50 微升底物，在室温下孵育 30 分钟，或直至蓝色显色清晰可见。为终止反应，用 200 微升蒸馏水洗涤反应孔两次。然后将酶标板自然晾干，置于避光处保存。

将培养板放置在平板扫描仪的扫描区域内，使用L形定位限位装置，以确保获得最佳且可重复的成像位置。按照此处所示设置对培养板进行扫描。随后运行培养板读数软件，单击“加载图像”按钮以导入图像，计算所需的病毒浓度。

接下来，在全局阈值选项卡中，拖动直方图中的红色滑块以调整采样阈值。然后，点击更新按钮以查看其对图像的影响。现在，勾选“计算中和/滴定”复选框。

单击“采样”按钮以定量感染细胞群体（ICP）。随后，当系统提示时，单击“保存”按钮以保存采样结果。为获得滴定结果，请加载或输入孔板定义图。

在滴定：最佳病毒种群中指示阈值。选择“滴定过程”选项卡以计算滴定结果。然后，在单击“保存并关闭”按钮保存结果之前，检查滴定结果。

有关该软件的更详细说明，请参见补充文件 S1。为进行病毒中和实验，需提前两到三天制备细胞单层。然后，向板的每个孔中加入 50 微升 VGM。

分别使用第11列和第12列作为病毒对照和细胞对照。将经受体破坏酶（RDE）处理的血清以1:20稀释后的50微升等分试样加入第1至第10列的第A行。通过将50微升从A行逐次倍比稀释至H行，并从H行弃去50微升，完成两倍系列稀释。然后，向细胞对照列的每个孔中加入50微升稀释液。

除细胞对照列外，向板的每个孔中加入 50 微升病毒。将板在 37 摄氏度下孵育 2 至 3 小时。然后，移除接种物，并向每个孔中加入覆盖物。

将培养板在37摄氏度下静置孵育过夜。然后，按照本视频前面演示的方法对培养板进行固定和染色。为了定量分析中和效果，将一块培养板放置在平板扫描仪的扫描区域，具体操作如本视频前面所示。

扫描酶标板并运行酶标仪软件，按之前的方法计算所需的病毒滴度。加载或输入酶标板布局后，在“中和：感染抑制”中设定阈值，然后选择“中和分析”以计算滴度。

最后，检查滴度，然后单击“保存并关闭”按钮以保存中和实验结果。此处显示的是最近对八种输入病毒进行抗原特性分析实验的滴定结果，病毒稀释倍数范围为1.0 × 10⁻¹至1.0 × 10⁻⁶。该图显示，随着病毒稀释倍数的增加，ICP值逐渐降低。

曲线相对于在同一孔内所有细胞中引起感染的相同病毒的ICP进行归一化。表中列出的是产生30% ICP饱和度的病毒稀释度，这些稀释度被选作中和实验的输入病毒稀释度。该图显示了使用一种输入病毒针对五种抗血清进行中和实验的结果。

该图展示了随着血清稀释度增加，感染过程的变化。纵轴上的归一化阳性群体表示相应抗血清反应产生的ICP与参考病毒平均ICP之比。最终，中和滴度被确定为对应于50% ICP减少率的抗血清稀释度的倒数。

该检测方法注重一致性、速度和检测灵敏度，包括输入病毒的定量滴定、高通量成像以及数据处理。该方法成本效益高，操作简便，已常规应用于病毒抗原性研究。