Name: 定量微中和试验的优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习定量微中和试验方法，用于分析流感病毒抗原特性及抗体中和活性。该技术采用平板扫描仪进行高通量检测，可全面表征感染细胞群体，为病毒学研究和疫苗评估提供高灵敏度工具。

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作者感谢 M. Matrosovich 博士提供了亲本 MDCK 和 MDCK-SIAT1 细胞系，感谢罗氏制药公司提供了奥司他韦羧酸盐。我们还感谢 Anne Weston 博士对本文稿提出的宝贵建议。本研究依赖于世界卫生组织全球流感监测与应对系统（WHO GISRS）中的世卫组织国家流感中心和世卫组织合作中心的宝贵合作，这些机构提供了研究所用的流感病毒。本工作由医学研究理事会通过项目编号 U117512723 资助。

注意：以下实验方案的生物安全等级（BSL）针对季节性流感病毒为 BSL 2，针对潜在大流行性流感病毒为 BSL 3+。在进行中和实验之前，需预先测定病毒滴度，以确定病毒对照（VC）的病毒浓度。
1. 病毒滴定
注意：根据病毒种类数量和重复次数，可灵活设置孔板：（1）病毒稀释方向可沿行或列进行（图1），每种病毒应占据独立的行或列；（2）病毒稀释梯度可灵活设定，但最高病毒浓度应始于左上角；（3）重复次数无限制。
注意：Madin Darby 犬肾（MDCK）细胞和 MDCK-SIAT1（SIAT）细胞由德国马尔堡的 M. Matrosovich 博士惠赠10。SIAT 细胞是稳定转染了人源 CMP-N-乙酰神经氨酸：β-半乳糖苷 α-2,6-唾液酸转移酶基因的 MDCK 细胞，可增强表达以唾液酸（SA）α2-6Gal 为末端的寡糖。
<ol>
	<li>分装足够的 MDCK 细胞或 MDCK-SIAT 细胞8 加入96孔板（每孔200 µl）。在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 培养2至3天至细胞融合。使用添加了10%热灭活胎牛血清（FCS）及抗生素（100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素）的DMEM培养基进行细胞传代。将SIAT细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。2 1 mg/ml G418硫酸盐。 
	注意：稀释倍数取决于操作经验及所用细胞系。细胞单层必须达到融合状态（即， 无细胞壁或明显轮廓的MDCK细胞，以及呈紧密排列布局的MDCK-SIAT1细胞）在病毒接种时的状态。基于MDCK或MDCK-SIAT1细胞融合培养瓶传代的稀释示例见于 表1.</li>
	<li>用 200 µl 病毒生长培养基（VGM）每孔洗涤细胞 3 次。使用 70% 乙醇对多通道板清洗仪灭菌 30 分钟，然后在洗涤前用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或 VGM 冲洗。</li>
	<li>吸出VGM，立即向每孔加入50 µl VGM。</li>
	<li>向6支无菌试管（或根据待测病毒数量及重复次数相应减少）中每支加入900 µl VGM。取100 µl病毒液加入第一支试管，充分混匀，并依次进行系列稀释，每次稀释均需更换吸头。每种待滴定病毒均重复上述操作。 
	注意：这将得到病毒的稀释度为10-1 至 10-6.</li>
	<li>从最高稀释度（1 x 10）开始，向每个病毒稀释液中加入 50 µl-5 在 图1），加入至重复孔（第9和第10列） 图196孔板的孔</li>
	<li>将培养板置于37 °C孵育2-3小时，使病毒侵染细胞。 
	注意：接种物中的病毒需要 2 至 3 小时的孵育时间，以确保其有足够时间到达单层细胞。</li>
	<li>制备覆盖层（每板10 ml） 
	注意：覆盖液包含 5 ml 2x DMEM、胰蛋白酶（终浓度 2 µg/ml，20 µl 1 mg/ml 储存液）和 5 ml 纤维素棉短绒（参见材料列表）。</li>
	<li>移除接种物。</li>
	<li>加入覆盖液（每孔200 µl），在37 °C下静置孵育过夜。 
	注意：病毒出芽大约在4小时后开始，因此此后不应扰动培养板。</li>
	<li>吸出孔板中的覆盖液。</li>
	<li>加入冰冷的4%多聚甲醛PBS溶液A（每孔200 µl），4 °C孵育30分钟或室温孵育20分钟。 
	注意：PBS A 是自然 pH 值的磷酸盐缓冲盐水，含 10 g NaCl、0.25 g KCl、1.437 g Na2HPO4，0.25 g KH2PO4，以及1 L蒸馏水（参见材料列表）。 
	注意：吸入多聚甲醛有害，吞咽可导致灼伤。此外，有有限证据表明其具有致癌作用，且皮肤接触后可能引起致敏反应。</li>
	<li>吸去多聚甲醛，用 PBS A 洗涤 2 次（每孔 200 µl）。</li>
	<li>将培养板置于4 °C的PBS A中保存以备后续使用，或继续进行以下步骤。</li>
	<li>加入破膜缓冲液（100 µl/孔），室温孵育30分钟。</li>
	<li>用 PBS A 溶液洗涤平板 2 次（每孔 200 µl）。</li>
	<li>每孔加入50 µl第一抗体（鼠抗流感病毒A型单克隆抗体，用ELISA缓冲液按1:1,000稀释），室温振荡孵育1小时（或4 °C过夜）。</li>
	<li>每孔用 100 µl 洗涤缓冲液（PBS A 中含 0.05% Tween 80，v/v）洗涤 3 次，每次洗涤之间于室温孵育 5 分钟。或者，每孔使用 300 µl 洗涤缓冲液，不孵育，洗涤 3 次。</li>
	<li>每孔加入50 µl二抗（山羊抗小鼠IgG（H+L）HRP偶联物，用ELISA缓冲液按1:1,000稀释），室温振荡孵育1小时。</li>
	<li>按照步骤1.17所述方法清洗3次。</li>
	<li>加入底物（50 µl/孔）。室温孵育30分钟，或直至蓝色显色清晰可见。</li>
	<li>为终止反应，每孔加入 200 µl 蒸馏水洗涤两次，每次洗涤之间在室温下孵育 2–3 分钟。</li>
	<li>风干培养板并将其置于暗处保存（例如， 用铝箔包裹。</li>
</ol>
2. 滴定定量法
<ol>
	<li>将一块孔板放置在平板扫描仪的扫描区域内，如图2a所示。使用L形定位限位装置，以确保成像位置处于最佳且可重复的状态。 
	注意：一次扫描中可同时对两块孔板进行成像。</li>
	<li>扫描图像。 
	注意：相关设置见表2。</li>
	<li>运行&#34;Wellplate Reader&#34;软件以计算所需的病毒浓度（图3）。
	<ol>
		<li>点击&#34;Load image&#34;按钮加载图像。在&#34;Global Threshold&#34;选项卡的直方图中，滑动红色条以调整采样阈值。点击&#34;Update&#34;按钮查看其对图像的影响。</li>
		<li>勾选&#34;Calculate Neutralization/Titration&#34;复选框。点击&#34;Sampling&#34;按钮以量化ICP。当系统提示时，点击&#34;Save&#34;按钮保存采样结果。 
		注意：若已勾选&#34;Calculate Neutralization/Titration&#34;复选框，则采样过程完成后，将自动弹出一个名为&#34;Neutralization &amp;#38; Titration Calculation&#34;的新窗口。</li>
		<li>加载或输入孔板定义图。在&#34;Titration: Optimal Virus Population (%)&#34;中注明阈值（例如，30%）。选择&#34;Titration Process&#34;选项卡以计算滴定结果。检查滴定结果。点击&#34;Save &amp;#38; Close&#34;按钮保存滴定结果。 
		注意：有关该软件的更详细操作说明，请参见补充材料S1。定制软件副本可根据请求提供。 
		注意：通常情况下，空斑减少实验中最适宜的病毒稀释度应使每孔内总细胞的ICP值约为50%（20–85%）11。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 病毒中和
注意：计算中和试验所需的培养板数量。每块培养板可容纳一种病毒和多种抗血清。
注意：根据抗血清的数量和重复次数，可灵活设置孔板：（1）血清稀释可在行或列方向进行（图4），每种血清应占据单独的行或列。（2）血清稀释的梯度可灵活设定，但应从孔板左上角开始设置最高血清浓度。（3）重复孔的数量需与抗血清数量相平衡，增加重复次数有助于减少实验变异。（4）病毒对照（VC）和细胞对照（CC）的重复数量可灵活调整，但也应分别占据独立的行或列。通常VC的重复数量应明显多于抗血清。
<ol>
	<li>提前2至3天按照步骤1.1-1.3制备细胞单层。</li>
	<li>向板的每孔中加入50 µl病毒生长培养基（VGM）。</li>
	<li>分别使用第11列和第12列作为病毒对照（VC）和细胞对照（CC）。将经1:20稀释的受体破坏酶（RDE）处理的血清各50 µl加入第1至第10列的第一行（A行）。 
	注意：每种病毒与血清组合均设复孔，因此一块板可例如用于一种病毒与五种抗血清的检测。</li>
	<li>通过将50 µl从A行转移至H行（第1至第10列，参见图4）进行2倍系列稀释，并从H行弃去50 µl。</li>
	<li>向CC列（第12列，参见图4）每孔中加入50 µl稀释液。</li>
	<li>除CC列外（第1至第11列，A至H行，参见图4），向板中每孔加入50 µl病毒液。</li>
	<li>于37 °C孵育2-3小时，移除接种物。每孔加入覆盖层（200 µl），于37 °C静置过夜孵育。随后按照病毒滴定步骤（1.11-1.22）对板进行固定和染色。</li>
</ol>
4. 中和作用定量分析
<ol>
	<li>将培养板放置在平板扫描仪的扫描区域内，如图所示 图2a使用L形位置限位器以确保成像位置的最佳性和可重复性。 
	注意：一次扫描中可对两个培养板进行成像。</li>
	<li>按照步骤 2.2 中所述方法扫描平板。</li>
	<li>运行 &#34;酶标仪&#34; 用于计算所需病毒滴度的软件（图3，步骤 2.3。
	<ol>
		<li>点击 &#34;加载图像&#34; 按钮以加载图像。滑动红色滑块 &#34;全局阈值&#34; 调整采样阈值。点击 &#34;更新&#34; 按钮以观察效果。</li>
		<li>勾选 &#34;计算中和/滴定&#34; 盒。单击 &#34;采样&#34; 单击按钮以量化颅内压（ICP）。单击 &#34;保存&#34; 当系统提示时，点击按钮以保存采样结果。 
		注意：采样过程结束后，将弹出一个名为 &#34;中和作用 &amp;#38; 滴定计算&#34; 如果该条件满足，则自动出现 &#34;计算中和/滴定&#34; 复选框已勾选。</li>
		<li>加载或输入孔板图谱。设定阈值（例如， 50%) 在 &#34;中和作用：感染抑制率（%）。&#34;</li>
		<li>选择 &#34;中和过程&#34; 计算滴度。检查滴度并点击 &#34;保存 &amp;#38; 关闭&#34; 单击按钮以保存中和实验结果。 
		注意：中和效价报告为血清最高稀释倍数的倒数，该稀释倍数可使针对病毒对照（VC）的预定义 ICP 减少率（如 50% 或 80%）达到规定水平（以第 11 列的平均值为准） 图4在代表性结果中采用了50%的颅内压降低。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li>
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<li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们描述了一种基于成像的微量中和（MN）检测方法，用于量化病毒之间真实的抗原关系。与其他蚀斑减少试验相比，该方法强调测量整个孔的感染细胞百分比（ICP），从而确保完全覆盖感染性病毒群体。该方法不依赖于蚀斑形成，因此可应用于主要形成微小不可见蚀斑或仅能引起单细胞感染的病毒，拓宽了检测的应用范围。因此，该检测方法能够检测的病毒种类以及抗体作用范围均超过血凝抑制（HI）试验，并能更全面地反映病毒之间的抗原相似性或差异性12。例如，当加入奥司他韦羧酸盐时，MN检测受神经氨酸酶（NA）依赖性结合的影响较小，因而能更准确地反映抗原差异。在方法开发过程中，我们通过定量滴定控制输入病毒量、使用平板扫描仪进行高通量成像，以及建立用户友好的数据处理平台，显著提高了实验的一致性、速度和检测灵敏度。检测结果总体上与HI试验结果一致，并得到了验证。值得注意的是，该方法还揭示了近期甲型和乙型疫苗病毒抗原漂移变异株之间的抗原差异，以及由培养选择或偶发突变引起的抗原变化，例如某些A(H1N1)pdm09病毒HA1蛋白中的G155E取代12。
该方案将病毒类型或亚型与能产生最强感染的细胞系选择相匹配，从而显著增强了成像信号。通过设计重复实验并平衡测试抗血清的数量，有效减小了实验变异。不确定性也可能来源于图像质量，而图像质量主要受成像设备的影响。一台性能良好的彩色平板扫描仪可显著提高图像对比度并降低噪声。中和反应中所用病毒的输入量必须在病毒仍保持相似状态时，通过相应的滴定实验预先定量确定。在中和过程中，抗血清对感染的反应以参考病毒（VC）与背景水平（CC）之间的差异作为归一化基准。准确测定VC和CC对于中和实验至关重要。建议设置更多重复（在代表性结果中使用了八个重复）。最后，充分理解软件操作对实验成功至关重要。该软件已在英国世界卫生组织流感中心用于常规病毒表征超过两年。针对各种情况的详细操作说明见补充文件S1。
该显微镜检测法适用于样本覆盖极大视野但仅需中等成像分辨率的应用场景。由于成本低廉且装置简单，该系统可轻易为大多数病毒学实验室所采用。同一样本测量值的变异小于3%，这大致定义了扫描过程中引入的不确定性11。此类重复性在许多病毒学研究中已足够，且可通过多幅扫描图像取平均值进一步提高。
综上所述，本研究展示了一种可靠的微中和试验方法，可常规用于抗原性研究，并支持血凝抑制（HI）数据，对当前流行流感病毒进行详细分析，特别是在每半年一次的人用流感疫苗病毒株筛选过程中具有重要应用价值。

微量中和（MN）试验在病毒学中用于定量中和抗体及抗病毒活性。作为血凝抑制（HI）试验的替代方法，MN试验能够克服流感病毒受体结合亲和力变化所引起的非抗原性效应，这些效应可能使HI结果的解读变得复杂1,2,3。直到最近，大多数MN试验仍基于细胞病变效应（CPE）或酶联免疫吸附试验（ELISA）4,5。基于病灶和蚀斑减少的MN试验于1990年建立6,7,8。蚀斑减少试验依赖于对可见蚀斑进行计数以量化感染性。然而，肉眼观察仅能识别较大且可分辨的蚀斑，而目前许多流行病毒产生的蚀斑多数较小且不可见。这种不完整的覆盖范围会导致不同检测者之间以及不同实验之间的显著差异，从而造成结果不可比。此外，当某些病毒在单个细胞中引起流产性感染或形成非常小的蚀斑时，该方法也无法使用。
通过引入基于成像的方案，可以改善较差的计数分辨率。随着技术的进步，光学显微镜和高通量微孔板读数仪能够提供准确计数感染细胞的方法9。在透射照明显微镜下，带有特定标记的感染细胞可通过其在亚细胞分辨率下的吸收或荧光对比被可视化。随后可在计算机屏幕上对样品进行分析。
由于视野范围有限，覆盖单个孔通常需要上百张拼接图像。分析一块96孔板则需要成像和处理约一万张图像。这种繁琐的过程耗时且昂贵，而获得的分辨率对于常规的病毒感染表征通常并无必要。预算有限的实验室可能会发现，基于平板扫描仪的方法提供了一种经济高效、高通量的替代方案。
本文介绍了一种改进的蚀斑减少中和试验（MN），适用于大量病毒的抗原特性分析，以及抗病毒活性和中和抗体的定量检测。该方法具有多项优势：首先，这是一种基于成像的检测方法，能够在细胞水平上测量病毒感染情况，不受蚀斑大小的影响。通过计数每个孔内的全部感染细胞群体（ICP），显著提高了检测灵敏度，使得对低感染性病毒的表征成为可能。其次，在中和反应之前引入了更精确的定量滴定步骤，以确定输入病毒的量。输入病毒的精确定量显著减少了不同实验之间的变异，增强了不同实验室之间结果的可比性。第三，中和滴度可直接通过图像分析确定，使定量过程快速且操作简便。最后，该方案以平板扫描仪和免费的数据处理软件为基础，提供了具备所需分辨率和准确性的低成本、高通量替代方法。整个系统占用空间小，可在大多数实验室中部署使用。
本文所述方案包含四个主要步骤：病毒滴定、滴度定量、病毒中和及中和效果定量。病毒滴定是一项预实验，用于确定中和反应中所需的病毒输入量。在滴定过程中，将多种浓度的病毒液分别加入96孔板中的细胞单层。随后在第2部分中对感染细胞进行定量。产生20%–85% ICP的病毒稀释度将作为相应中和反应的输入病毒量 第3节。中和实验的滴度通过第4节进行定量。遵循上述方案的实验结果展示在代表性结果部分。在过去两年中，该检测方法已针对当前流行的主要流感病毒株（如A(H1N1)pdm09、A(H3N2)和B型病毒）进行了充分验证。流感病毒的鉴定结果已被纳入向世界卫生组织（WHO）咨询会议提交的报告中，为2016年南半球及2016-2017年北半球流感疫苗的选用提供了建议依据。

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429，P0781</td><td>500 ml DMEM + 5 ml 青霉素/链霉素&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH 磷酸盐缓冲液：NaCl 10&amp;nbsp;g，KCl 0.25&amp;nbsp;g，Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.437 g，KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 0.25 g，加蒸馏水至1 L</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2.4 g 溶于 100 ml 蒸馏水中，使用磁力搅拌器搅拌 1 小时至溶解。经高压灭菌器灭菌。</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>覆盖液（10 ml/板）：</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM，胰蛋白酶 2&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml 终浓度，Avicell 5&amp;nbsp;毫升</td></tr><tr><td>Triton X-100&lt;sup&gt;e&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T8787</td><td>透化缓冲液：PBS A 中含 0.2%（v/v）</td></tr><tr><td>吐温 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>洗涤缓冲液：PBS A 中含 0.05% Tween 80（v/v）</td></tr><tr><td>马血清</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>ELISA 缓冲液：PBS A 中含 10% （v/v） + 0.1% Tween 80</td></tr><tr><td>小鼠抗流感病毒A型单克隆抗体</td><td>伯乐（Biorad）</td><td>MCA 400</td><td>1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; 抗体：ELISA 缓冲液中 1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP 结合物</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2&lt;sup&gt;nd&lt;/sup&gt; 抗体：ELISA缓冲液中1:1,000稀释</td></tr><tr><td>True Blu 过氧化物酶底物</td><td>KPL&amp;nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>底物：True blue +0.03% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;g&lt;/sup&gt; (30% 溶液的 1:1,000 稀释)</td></tr><tr><td>96孔平底微量滴定板</td><td>Costar&amp;nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>8通道多孔板洗板机及歧管</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>完美板扫描仪</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>成像软件可免费下载自 &lt;a href=&quot;http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;&infoType=Downloads&quot;&gt;http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;&infoType=Downloads&lt;/a&gt;.</td></tr><tr><td>软件运行环境：LabVIEW</td><td>国家仪器公司</td><td>基于窗口的 NI Vision Builder</td><td>版本：LabVIEW2012 或更高版本</td></tr></tbody></table>

定量微量中和试验的优化

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

微型中和（MN）实验是测定流感病毒的感染性及病毒复制抑制作用的标准技术。本研究中，我们介绍了一种基于成像的MN实验方案，用于量化病毒之间真实的抗原关系。与依赖可见蚀斑的传统蚀斑减少实验不同，该方法可定量每个孔中的全部感染细胞群体。该方案通过将病毒类型或亚型与细胞系的选择相匹配，以实现最大感染效率，从而在成像和图像处理过程中增强样本对比度。引入定量滴定步骤可明确定义中和反应中输入病毒的量，从而使不同实验之间的结果具有可比性。采用平板扫描仪和可免费下载的软件进行成像设置，使该方法具有高通量、低成本、操作简便等优点，易于在大多数实验室中推广应用。我们的研究表明，改进后的MN实验对当前流行的流感A(H1N1)pdm09、A(H3N2)和B型病毒均具有良好适用性，且不受A(H3N2)病毒神经氨酸酶（NA）中氨基酸替换的显著影响。该方法特别适用于对那些在细胞培养中增殖水平低、血凝素（HA）滴度低，或发生流产感染而无法形成蚀斑的病毒进行表征分析。

根据上述步骤，我们展示了近期抗原特性鉴定实验中获得的一些结果。滴定实验设计用于检测八种输入病毒，每种稀释度设置两个重复。病毒稀释梯度范围为 1.0 × 10-1 至 1.0 × 10-6，以涵盖不同病毒之间的变异情况。测试病毒属于 H3N2 亚型，包括 A/Cameroon/15V-3538/2015、A/Vladivostok/36/2015、A/Moscow/103/2015、A/Tomsk/5/2015、A/Moscow/101/2015、A/Moscow/100/2015、A/Moscow/133/2015 和 A/Bratislava/437/2015。滴定结果如图5所示。图5d展示了随着病毒稀释倍数增加，感染细胞百分比（ICP）下降的趋势。曲线以同种病毒在孔内所有细胞均被感染时的 ICP 值（定义为 ICP 饱和值）为基准进行归一化处理12。若最高病毒浓度下 ICP 未达到饱和，则采用相应重复样本的 ICP 平均值代替（如图5d中的 A/Moscow/103/2015）。选择能够产生 30% ICP 饱和度的病毒稀释度作为中和实验的输入病毒稀释度（表3）。
中和试验设计为每种病毒与五种抗血清进行反应，每块板上设双复孔。所示参考病毒为 H3N2 A/Stockholm/63/2015。五种抗血清分别为 A/HK 4801/14 Egg F12/15、A/HK 7295/14 MDCK F02/15、A/South Africa R2665/15 SIAT F50/15、A/Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18/15 和 A/Dutch 525/14 SIAT f23/15。中和试验结果如图所示 图6. 图6d 随着血清稀释度的增加，展示了感染进程。纵轴上的归一化阳性群体表示相应抗血清反应产生的ICP与参考病毒的平均ICP之比12未感染细胞对照组的背景ICP在归一化过程中被扣除。中和滴度确定为对应于50% ICP降低的抗血清稀释度的倒数。表4采用线性插值法估算介于两个相邻血清稀释度之间的滴度。
<img alt="病毒稀释微孔板实验、连续稀释、病毒定量、实验结果展示。" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1： 病毒滴定实验中微孔板设置示例。 测试病毒分别分配至不同的行（A 至 H）。各列为不同病毒稀释度设计（1 至 12），每种病毒稀释度使用两列进行重复。比例尺 = 10 mm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="扫描仪上的96孔板设置；L形限位示意图；扫描过程的尺寸标注。" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2： 样品扫描系统的示意图。 （a）置于平板扫描仪成像位置的96孔板（经Elsevier B.V.许可转载自 参考文献11），以及（b）(a) 中所示L形定位限位的尺寸示意图。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="凝胶电泳分析软件界面；识别DNA条带；阈值设置；数据分析。" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： “Wellplate Reader”定量分析软件的桌面示意图。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫分析实验中用于抗体检测的血清稀释 ELISA 板示意图。" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： 中和实验中微孔板设置示例。 每种抗血清分配至两列，设两个重复（1 至 10 列）。行用于设置不同血清稀释度（A 至 H 行）。病毒对照设在第 11 列，共八个重复孔（A11 至 H11）。细胞对照设在第 12 列，共八个重复孔（A12 至 H12）。比例尺 = 10 mm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="滴定板设置、病毒稀释在孔板中、滴定结果图表；比色法检测。" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：滴定实验结果。（a）孔板设置，（b）扫描获得的孔板图像，（c）以颜色编码显示的定量病毒感染细胞群体示意图，以及（d）病毒感染细胞群体归一化后相对于病毒稀释度的变化。以30% ICP作为阈值。（d）中的误差线表示样本重复实验的标准差（± 1 SD）。图（b）和（c）中的比例尺 = 10 mm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="中和实验布局、孔板图像及显示血清稀释对病毒滴度影响的图表。" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6： 中和实验结果。 （a）孔板设置，（b）扫描获得的孔板图像，（c）定量测定的病毒感染细胞群体示意图，以及（d）病毒感染细胞群体相对于血清稀释倍数的归一化结果。所用输入病毒（VC）为 A/Stockholm/63/2015。使用50% ICP计算滴度。图（d）中的误差棒表示样本重复测定的标准差（SD）（±1 SD）。图（b）和（c）中的比例尺 = 10 mm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充文件 S1：<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">典型稀释倍数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MDCK 细胞</td>
			<td>MDCK-SIAT1 细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 天</td>
			<td>1:5 (1 + 4)</td>
			<td>1:10 (1 + 9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 天</td>
			<td>1:10 (1 + 9)</td>
			<td>1:20 (1 + 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">每毫升典型细胞数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MDCK 细胞</td>
			<td>MDCK-SIAT1 细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 天</td>
			<td>2 x 105</td>
			<td>1 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 天</td>
			<td>1 x 105</td>
			<td>5 x 104</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：MDCK或MDCK-SIAT1细胞融合培养瓶传代培养中的典型稀释比例。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>模式</td>
			<td>专业模式</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>文档类型</td>
			<td>胶片（含胶片区域指南）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>自动曝光类型</td>
			<td>照片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>图像类型</td>
			<td>24位彩色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分辨率</td>
			<td>1,200 dpi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存的图像格式</td>
			<td>TIFF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：平板扫描仪的典型设置。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>行</td>
			<td>病毒</td>
			<td>推荐稀释度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>A/Cameron/15V-3538/2016</td>
			<td>1.0 x 10-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>A/Vladivostok/36/2015</td>
			<td>1.0 x 10-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>A/Moscow/103/2015</td>
			<td>1.1 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>A/Tomsk/5/2015</td>
			<td>5.9 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>A/Moscow/101/2015</td>
			<td>8.3 x 10-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>A/Moscow/100/2015</td>
			<td>1.4 x 10-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>A/Moscow/133/2015</td>
			<td>1.3 x 10-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>A/Bratislava/437/2015</td>
			<td>1.3 x 10-4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：根据30% ICP群体计算的病毒稀释度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>列</td>
			<td>抗血清</td>
			<td>推荐滴度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 - 2</td>
			<td>A/HK4801/2014</td>
			<td>110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 - 4</td>
			<td>A/HK7295/2014</td>
			<td>213.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 - 6</td>
			<td>A/South Africa/R2665/2015</td>
			<td>2155.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 - 8</td>
			<td>A/Switzerland/9715293/2013</td>
			<td>89.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 - 10</td>
			<td>A/Netherlands/525/2014</td>
			<td>78.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：A/Stockholm/63/2015 对抗血清在50% ICP时的滴度。

本研究描述了一种 基于成像的微量中和试验用于分析病毒间的抗原关系。该方案采用平板扫描仪，包含四个步骤：滴定、滴定定量、中和及中和定量。该方法适用于当前流行的人甲型H1N1pdm09、甲型H3N2和乙型流感病毒。

微量中和（MN）实验是用于测定流感病毒的感染性及病毒复制抑制情况的标准技术。

本微中和试验的总体目标是以定量、高通量且高度敏感的方式，对当前流行的所有类型流感病毒以及抗体和抗病毒活性进行表征。该方法有助于回答病毒学领域的关键问题，例如流感病毒的抗原特性分析、抗体的定量中和能力以及抗病毒活性检测。该技术的主要优势在于能够对整个感染细胞群体进行表征，包括可见和不可见的蚀斑以及单个细胞的感染情况。微量中和试验将由位于伦敦的世卫组织流感合作中心副主任林一璞博士演示。以下方案的生物安全水平（BSL）针对季节性流感病毒为BSL 2，针对潜在大流行性流感病毒为BSL 3+。首先，将足够数量的细胞分装至96孔板中。在37摄氏度、5% CO2条件下培养细胞两至三天，直至细胞汇合。使用70%乙醇对多孔板洗涤仪进行灭菌，并用PBS或病毒培养基（VGM）冲洗。随后，用200微升病毒培养基（VGM）洗涤汇合的细胞。吸弃细胞中的VGM，立即向每孔加入50微升VGM。接着，向六个无菌试管中各加入900微升VGM。然后，用移液器将100微升病毒液加入第一支试管中，并充分混匀。从第一管开始进行病毒的连续稀释，每次稀释均需更换枪头。从最高稀释度开始，向96孔板中每个稀释度的两个复孔分别加入50微升病毒稀释液。然后将该板置于37摄氏度环境中2至3小时，使病毒侵染细胞。根据文本方案制备覆盖液后，移除各孔中的接种物。然后每孔加入 200 微升覆盖液，在 37 摄氏度下静置孵育过夜。向各孔中加入 200 微升预冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS A 溶液，在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，或在室温下孵育 20 分钟。孵育结束后，吸除PFA，每孔加入200微升PBS A，洗涤平板两次。每孔加入100微升通透化缓冲液，室温孵育30分钟。随后用PBS A洗涤平板两次。随后，向各孔中加入 50 µL 针对 A 型流感病毒的小鼠单克隆抗体，室温下振荡孵育 1 小时。孵育结束后，用 300 µL 洗涤缓冲液洗涤各孔 3 次。然后，向样品中加入 50 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的 goat 二抗，室温孵育 1 小时。按照之前的方法洗涤各孔三次后，每孔加入 50 µL 底物，在室温下孵育 30 分钟，或直至蓝色显色清晰可见。为终止反应，用 200 µL 蒸馏水洗涤各孔两次。然后将板自然晾干后，置于避光处保存。将一个孔板放置在平板扫描仪的扫描区域内，使用L形定位限位装置，以确保获得最佳且可重复的成像位置。使用此处所示设置对孔板进行扫描。然后，运行孔板读取软件，通过点击“加载图像”按钮导入图像，以计算所需的病毒浓度。接下来，在全局阈值选项卡中，拖动直方图中的红色滑块以调整采样阈值。然后，点击更新按钮以查看其对图像的影响。现在，勾选“计算中和/滴定”复选框。单击“采样”按钮以定量感染细胞群体（ICP）。随后，当系统提示时，单击“保存”按钮以保存采样结果。为获得滴定结果，请加载或输入孔板定义图。在滴定：最适病毒种群中指示阈值。选择“滴定过程”选项卡以计算滴定结果。然后，在单击“保存并关闭”按钮保存结果之前，检查滴定结果。有关软件的更详细说明，请参阅补充文件 S1。为进行病毒中和实验，需提前两到三天制备细胞单层。然后，向板的每孔中加入 50 微升 VGM。分别使用第11列和第12列作为病毒对照和细胞对照。将50 µL经受体破坏酶（即RDE）处理过的血清按1:20稀释后的样品加入第1至第10列的第A行各孔中。通过将50 µL液体从A行逐孔倍比稀释至H行，并在H行弃去50 µL，完成两倍系列稀释。然后，向细胞对照列的每孔中加入50 µL稀释液。除细胞对照列外，向板的每个孔中加入 50 微升病毒。将板在 37 摄氏度下孵育 2 至 3 小时。然后，移除接种物，并向每个孔中加入覆盖物。在37摄氏度下静置孵育平板过夜。随后，按照本视频前面演示的方法对平板进行固定和染色。为定量中和效果，将微孔板置于平板扫描仪的扫描区域，操作方法如本视频前面所示。扫描酶标板并运行酶标仪软件，按之前的方法计算所需的病毒滴度。加载或输入酶标板布局后，在“中和作用：感染性扣除”中设定阈值。然后选择“中和过程”以计算滴度。最后，检查滴度，然后单击“保存并关闭”按钮以保存中和实验结果。此处显示的是最近对八种输入病毒进行抗原特性分析实验的滴定结果，病毒稀释倍数范围为1.0 × 10⁻¹至1.0 × 10⁻⁶。该图显示，随着病毒稀释倍数的增加，感染性病毒颗粒（ICPs）数量减少。曲线以同种病毒在孔内所有细胞中引起感染的ICP为基准进行归一化。本表列出的是产生30% ICP饱和度的病毒稀释度，该稀释度被选作中和实验的输入病毒稀释度。该图显示了一种输入病毒与五种抗血清进行中和实验的结果。该图展示了随着血清稀释度增加，感染过程的变化情况。纵轴上的归一化阳性群体表示相应抗血清反应产生的ICP与参考病毒平均ICP的比值。最终，中和滴度被确定为引起50% ICP降低时对应抗血清稀释度的倒数。该检测方法注重一致性、速度和检测灵敏度，包括输入病毒的定量滴定、高通量成像以及数据处理。该方法成本效益高，操作简便，已常规应用于病毒抗原性研究。

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