诱导多能干细胞的快速神经元分化有关微电极阵列测量网络活动

该神经元分化方案的总体目标是以快速和可控的方式从微电极阵列上生长的人诱导多能干细胞生成神经元网络。这种方法可用于解决神经科学领域的关键问题。它可用于研究神经系统疾病的生物学机制，但也可用于解决更基本的神经生物学问题。

该技术的主要优点是诱导的多能干细胞以受控方式快速分化为神经元。第一天，将含 1% 青霉素链霉素的 DMEM/F12、CDS 和 E8 培养基加热至室温。接下来，将多西环素添加到 E8 培养基中，使终浓度为 4 μg/mL，然后在混合物中加入岩石抑制剂。

吸出 RTTANGN2 阳性 hiPSC 的用过培养基，并向细胞中加入 1 mL CDS。随后，将细胞在 37 摄氏度加湿培养箱中孵育 3 到 5 分钟。在显微镜下，检查细胞是否彼此分离。

然后，在孔中加入 2 mL DMEM/F12。用 1， 000 微升移液管轻轻悬浮细胞，然后转移到 15 毫升试管中。然后，向细胞悬液中加入 7 mL DMEM/F12，并以 200 x g 的离心速度离心细胞 5 分钟。

5 分钟后，吸出上清液并加入 2 mL 制备好的 E8 培养基。通过将 1， 000 微升移液管的尖端靠在 15 毫升试管的侧面并轻轻重悬细胞来解离 hiPSC。在显微镜下，检查细胞是否解离。

然后，使用血细胞计数器测定每毫升的细胞数。对于六个孔 MEA，稀释细胞以获得 7.5 倍 10 至第 5 个细胞/毫升的细胞悬液。对于盖玻片，稀释细胞以获得每毫升 4 乘以 10 至 4 个细胞的细胞悬液。

从盖玻片和六个孔 MEA 中吸出稀释的层粘连蛋白。对于六个孔 MEA，通过向每个孔的活性电极区域添加 100 微升细胞悬液来铺板细胞。然后向 24 孔板的每个孔中加入 500 μL 细胞悬液，对细胞进行铺板。

接下来，将 6 孔 MEA 或 24 孔板放入加湿的 37 摄氏度培养箱中。两小时后，小心地将 500 微升制备的 E8 培养基添加到 6 孔 MEA 的每个孔中。随后，将 6 孔 MEA 置于加湿的 37 摄氏度培养箱中过夜。

第 3 天，将 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 加热至室温。将 DPBS 和 DMEM/F12 与 1% 青霉素链霉素加热至 37 摄氏度。然后，吸出大鼠星形胶质细胞培养物的用过的培养基。

加入 5 毫升 DPBS 洗涤培养物并轻轻漱口。然后，吸出 DPBS 并加入 5 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。轻轻晃动胰蛋白酶-EDTA。

然后将细胞在 37 摄氏度的加湿培养箱中孵育 5 到 10 分钟。随后，在显微镜下检查细胞是否脱落。敲击培养瓶几次，分离最后的细胞。

然后，向培养瓶中加入 5 mL DMEM/F12。尝试用 10 毫升移液器轻轻评估培养瓶内的细胞。然后，将细胞悬液收集在 15 毫升试管中。

以 200 x g 的离心力离心试管 8 分钟。之后，吸出 supernatent，并将细胞重悬于 1 ml DMEM/F12 中。使用血细胞计数器确定每毫升的细胞数。

接下来，将 7.5 乘以 10 添加到六个孔 MEA 的每个孔中的第四个星形胶质细胞中。并向 24 孔板的每个孔中加入第四个星形胶质细胞的 2 乘以 10。将细胞在加湿的 37 摄氏度培养箱中孵育过夜。

以 1， 200 倍放大率采集数据，并使用 MCS 数据采集卡以 10 kHz 的频率对信号进行采样。记录在 MEA 上培养的 hiPSC 衍生神经元的 20 分钟电生理活性。在记录过程中，将温度保持在 37 摄氏度，并通过向 MEA 提供恒定缓慢的加湿气体流来防止介质蒸发和 pH 值变化。

之后，使用自定义软件数据包分析数据。该图显示了分化过程中突触蛋白中神经元标志物 MAP2 的表达变化，这表明神经元成熟。该图显示，测量分化过程中增加的单个细胞的突触蛋白表达。

分化 3 周后在细胞中表达的突触蛋白与 PSD-95 共定位，表明存在功能性突触。在这里，在分化过程中的不同时间点进行全细胞膜片钳，以测量细胞的电生理活性。细胞能够在不同的时间点产生动作电位。

随着时间的推移，加标细胞的百分比增加表明，即使在分化的早期阶段，大多数细胞也能够产生动作电位。膜片钳也用于测量细胞接收到的兴奋性突触后电流。在分化过程中，细胞接收到的输入数量增加。

在分化过程中，兴奋性突触后电流的频率和振幅均增加。在分化过程中测量在微电极阵列上分化的细胞的电生理活性。在这里，神经元网络活动在分化过程中增加，并在 23 天后显示同步事件。

一旦掌握，该技术可用于在 3 到 4 周内将诱导多能干细胞分化为功能性神经元网络。在尝试此程序时，重要的是要记住无菌工作，并温和地处理细胞。在此程序之后，可以使用其他方法（如药理学测试）来挽救在患者细胞系中观察到的表型。

开发后，这项技术为神经科学领域的研究人员正式研究神经系统疾病中的网络活动缺陷铺平了道路。看完这个视频后，你应该对如何快速、可控地分化、诱导多能干细胞进入神经元有一个很好的了解。