Name: 诱导多能干细胞的快速神经元分化有关微电极阵列测量网络活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习利用微电极阵列技术将人诱导多能干细胞快速分化为功能性神经元网络的方法。该技术可在三到四周内生成成熟神经元，用于研究神经生物学机制及神经系统疾病的电生理特性。

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作者感谢Jessica Classen完成了全细胞膜片钳实验。本研究中使用的人诱导多能干细胞（hiPSCs）由奈梅亨拉德堡德大学的Huiqing Zhou和Willem van den Akker惠赠。本实验方案所用的转移载体由波恩大学医学中心的Oliver Brüstle、Philipp Koch和Julia Ladewig惠赠。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们采用了Zhang发表的一种高效的hiPSC分化方案 等 (2013)12 用于测量在微电极阵列上由人诱导多能干细胞衍生的神经元网络的网络活性。我们通过创建一种改良方案对原始方案进行了调整。 rtTA/Ngn2阳性hiPSC细胞系，再诱导其神经元分化。这一额外步骤使我们能够控制MEA上的神经元细胞密度。对神经元密度的控制是将本方案适配于MEA技术并确保实验一致性的关键前提。为了利用MEA测量神经元网络的活性，神经元需在MEA电极表面直接形成密集的网络。17,18. 这必然要求对神经元的铺板密度进行严格控制。 rtTA/Ngn2阳性 hiPSC 细胞系可实现对神经元密度的调控，因为该策略不依赖于在分化前对 hiPSC 进行急性慢病毒转导；该方法 rtTA/Ngn2阳性hiPSC细胞系因此几乎消除了由慢病毒毒性及感染效率差异等因素导致的最终产量波动。
实验流程中的另一个关键步骤是与正在分化的 hiPSC 共培养的大鼠星形胶质细胞的数量。星形胶质细胞通过调控突触的形成、维持和消除，积极参与发育中神经回路的精细化过程，而这些过程对神经元功能至关重要。本文所介绍的方案高度依赖星形胶质细胞：神经元需要星形胶质细胞的支持，才能完全成熟并形成具有自发性活动的功能性突触。我们发现，星形胶质细胞的数量应大致等于 hiPSC 来源神经元的数量，以支持神经元的成熟以及能够表现出自发性活动的神经网络的形成。由于我们的星形胶质细胞培养方案所获得的是具有有限生命周期的原代细胞培养物，因此需要定期分离大鼠星形胶质细胞。
我们对 Zhang et al. (2013)12 发表的实验方案进行的改进，使其适用于微电极阵列（MEA）技术，有望显著提升研究由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生神经网络的网络活动能力。此前，利用MEA技术研究hiPSC来源神经元网络的实验方案依赖于耗时较长的分化流程13-16。Zhang et al. (2013) 提出的方案提供了一种更快速的替代方法，而我们的修改进一步消除了一个变异来源，使得hiPSC来源神经元与MEA技术结合的应用变得更加可行，尤其适用于高通量或药理学研究。此外，由于Zhang et al. (2013)12发表的方法能够获得均一的上层皮层神经元群体，我们改进后的方案使得针对这一特定神经元亚群的网络活动开展集中研究成为可能。
尽管如此，这种方法也存在一些局限性。首先，培养物的均一性也可能被视为一种缺点，因为这种均一性使得培养物更难以模拟 体内 网络，其中不同类型的神经元（即&#160;抑制性和兴奋性神经元）构成了一个异质性网络。为了进一步提升将hiPSC来源神经元与MEA技术结合的应用，开发针对其他神经细胞群体的快速（基于转基因）分化方案将至关重要。如果相关方案得以建立， 体外 网络将模拟 在体内 更紧密地研究神经网络。其次，目前必须将大鼠星形胶质细胞添加到hiPSC来源的神经元中以提供生长支持，因此所形成的神经网络并非完全的人类神经元网络 狭义上 可靠的将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为星形胶质细胞的实验方案，未来可能解决这一问题26第三，正如本文所述，二维神经网络在研究复杂的三维结构时具有一定的局限性 体内 神经元网络。幸运的是，已有描述大鼠原代神经元三维培养与MEA技术结合的实验方案可供参考27,28前瞻性地，将快速分化方案获取hiPSC来源的神经元和星形胶质细胞，与三维培养技术及MEA技术相结合，有望为揭示神经系统疾病潜在的生物学机制提供新的见解。

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）向人类神经元分化的培养方案开发 体外 为研究神经系统疾病提供了一种强大的新工具。在最近之前，由于缺乏使用人类神经元的模型系统，这些疾病的研究受到严重阻碍。尽管可以利用啮齿类动物研究神经系统疾病，但此类研究的结果难以直接转化为人类应用1鉴于这些局限性，由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元是一种颇具前景的替代模型，可用于阐明神经系统疾病的分子机制，并用于 体外 药物筛选
在过去十年中，已开发出多种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）转化为神经元的实验方案2-8。然而，这些方案在许多方面仍存在局限性。首先，这些方案通常耗时较长：获得充分成熟（即&#160;形成突触）并具备功能性活性的神经元需要数月的培养过程，这使得大规模研究难以开展9。此外，hiPSC向神经元转化的效率较低。这些方案常常产生异质性的神经元群体，因而无法用于特定神经元亚群的研究。而且，这些方案的可重复性差，对不同的iPSC细胞系往往得到不同的结果10,11。最后，所获得神经元的成熟阶段和功能特性也存在较大变异性10。
为了解决这些问题，Zhang et al. (2013)12 开发了一种通过过表达转录因子 neurogenin-2 快速且可重复地从 hiPSCs 生成人类神经元的实验方案。作者报道，该方法的分化过程相对较快（在诱导 neurogenin-2 表达后仅需 2 至 3 周），具有良好的可重复性（神经元特性不依赖于起始的 hiPSC 细胞系），且 hiPSC 向神经元的转化效率极高（接近 100%）。采用该方案生成的神经元群体具有高度均一性（类似于上层皮层神经元），可用于研究特定细胞类型在神经疾病中的作用。此外，这些由 hiPSCs 分化而来的神经元在培养仅 20 天后即表现出成熟特征（例如，形成突触的能力以及显著的功能性电活动）。
在利用人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术研究人类疾病之前，表征hiPSC来源神经元在神经网络水平上的电生理特性是一项重要的前提条件。因此，近年来许多研究团队已开始使用微电极阵列（MEA）装置（Multichannel Systems，德国雷特林根）在神经网络水平上研究干细胞来源的神经元13-16MEA 的电极嵌入在一种基底材料中，该基底可用于培养神经元细胞。MEA 可用于研究神经网络的电生理特性以及 体外 其活性的发育。目前，微电极阵列（MEAs）仅与需要数月时间才能形成成熟神经网络的分化方案联合使用。因此，将MEAs与快速分化方案相结合，将有助于推动该技术在神经系统疾病大规模研究中的应用。
本文中，我们对 Zhang et al. (2013)12 的实验方案进行了改进，并将其适配用于多电极阵列（MEA）。具体而言，我们并未采用急性慢病毒转导，而是在诱导分化前，构建了稳定表达 rtTA/Ngn2 的人诱导性多能干细胞（hiPSC）细胞系。我们这样做的主要目的是为了可重复地控制神经元细胞密度，因为神经元细胞密度对神经网络的形成以及神经元与MEA电极之间的良好接触至关重要17,18。尽管 Zhang et al. 的方案在转导的 hiPSC 转化效率方面非常高，但其最终获得的神经元产量相对于初始接种的 hiPSC 数量具有固有的变异性（参见 Zhang et al. 中的图2E）12。使用稳定细胞系可消除许多导致变异性的因素，例如慢病毒毒性及感染效率的差异。随后，我们优化了在 MEA 上可靠生成 hiPSC 来源神经元网络的各项参数，并在第三周即观察到网络成熟（例如，涉及大多数通道的同步化放电事件）。这一快速且可靠的实验方案将有助于对来自不同（即&#160;患者特异性）hiPSC 系的神经元进行直接比较，并为药理学研究提供高度一致的实验平台。

<table><tbody><tr><td>Lebovitz 的 L-15 培养基</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸 (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>无 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 HBSS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>高糖 DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 慢病毒包装载体</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 慢病毒包装载体</td><td>Addgene</td><td>质粒 #12259</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 培养基</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂</td><td>Gibco</td><td>A2644501&amp;nbsp;</td><td>也可使用如硫唑维林等其他 ROCK 抑制剂。</td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>玻连蛋白</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6 孔微电极阵列板 (MEAs)</td><td>Multi Channel Systems</td><td>60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸 (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>强力霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3，人重组蛋白</td><td>Promokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF，人重组蛋白</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷&amp;beta;-D-呋喃型阿拉伯糖苷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>直头精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>精细弹簧剪&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的神经元为研究神经系统疾病提供了一种极具前景的新工具。在过去十年中，已开发出多种将hiPSCs分化为神经元的实验方案。然而，这些方案通常耗时较长，且存在变异性高、可重复性低和效率不高的问题。此外，通过这些方案获得的神经元通常不够成熟，在单细胞和神经网络水平上的功能活性均不充分，除非进行数月的培养。部分由于这些局限性，目前对hiPSC来源神经元网络的功能特性仍缺乏充分表征。本文中，我们采用了一种近期发表的方案，该方案通过强制表达转录因子neurogenin-212，实现由hiPSCs高效生成人类神经元。该方案快速（3周内即可获得成熟神经元）且高效，转导细胞的转化效率接近100%（DAPI阳性细胞中&#62;95%为MAP2阳性）。此外，该方案可获得同质性的兴奋性神经元群体，有助于研究特定细胞类型在神经系统疾病中的作用。我们对原始方案进行了改进，构建了稳定转导的hiPSC细胞系，从而能够精确控制神经元的总数。随后，利用这些细胞在微电极阵列上构建hiPSC来源的神经元网络。通过该方法，可在保持实验间细胞密度一致的前提下，对hiPSC来源神经元网络的自发性电生理活动进行测量与表征。本方案具有广泛的适用性，尤其适用于针对人类神经元网络的机制性与药理学研究。

本文中，我们成功改进了一种通过过表达转录因子 neurogenin-212 将 hiPSC 直接分化为皮层神经元的实验方案，并将其优化用于微电极阵列（MEA）检测。该方法快速高效，可在诱导分化后的第三周内即获得具有功能的神经元及神经网络活动。
在分化方案过程中，细胞在形态上开始呈现神经元特征：形成细小突起，并开始相互连接（图 1A）。我们通过测量神经元在发育过程中的形态学特征和突触特性，建立了来源于健康对照 hiPSC 系的神经元的神经生理学特征。在分化开始后的不同时间点，对 hiPSC 来源的神经元进行 MAP2 以及 synapsin-1/2 染色（图 2A）。结果表明，分化诱导仅 3 周后，所获得的神经元已表现出成熟的神经元形态。基于 synapsin-1/2 免疫细胞化学染色，对 synapsin-1/2 斑点数量（反映突触数量的指标）进行了定量分析。随着时间推移，synapsin-1/2 斑点数量逐渐增加，提示神经元连接水平也在上升（图 2B）。在两个独立的 IPS 细胞系中，分化诱导 23 天后 synapsin-1/2 斑点数量相似（图 2C）。在 23 天体外培养（DIV）时，大多数 synapsin-1/2 斑点与 PSD-95 斑点相邻分布，表明形成了具有功能的突触（图 2D）。
与 Zhang 所描述的结果一致 等我们生成了一群兴奋性上层皮层神经元，并通过泛神经元标记物及亚型特异性皮层标记物（如BRN2和SATB2（II/III层））确认了其身份。我们未观察到表达深层皮层神经元标记物CTIP2（V层）或Foxp2（VI层）的神经元。图 2E 和 F)
为表征hiPSC来源神经元的电生理活性，我们采用了全细胞电流钳和电压钳记录技术， 即 发育过程中测量了这些神经元的固有特性和兴奋性输入。神经元在分化后一周即可产生动作电位，且放电细胞的比例随时间逐渐增加（图2G 和 H）。此外，神经元在诱导分化仅一周后便已接收到兴奋性突触输入：随着发育的进行，兴奋性突触输入的频率和幅度均有所增加（图 2I - K).
为了更好地理解单个细胞的活动如何协同形成网络水平的功能，研究神经元如何协同工作至关重要。 体外 在MEA上培养的神经元网络是研究神经元动力学的宝贵实验模型。我们记录了源自健康对照组hiPSC细胞系的神经元在6孔MEA上培养时20分钟的电生理网络活动图 2M分化诱导数周后，源自健康对照组hiPSCs的神经元形成了具有功能活性的神经网络，表现出自发性放电事件（0.62 ± 0.05 疋/秒； 图2N）。在此发育阶段（即 分化开始后16 d，未检测到涉及MEA所有通道的同步事件（图 2O）。网络活动水平随着发育而增加：在诱导分化后的第四周，神经元网络表现出较高的自发活动水平（2.5 ± 0.1 簇发/秒； 图2N) 在装置的所有孔中。这些网络还表现出同步性网络簇状放电（4.1 ± 0.1 次/分钟， 图2O持续时间较长（2,100 ± 500 毫秒）。
<img alt="细胞生长进程，第1、3、7天，显微镜图像A；微流控芯片装置B，细胞密度C。" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： hiPSC向神经元的分化。 A. hiPSC在盖玻片上向神经元分化的三个时间点。 B. hiPSC在多电极阵列（MEAs）上的接种。 C. T75培养瓶中达到100%汇合度的星形胶质细胞（注意细胞形成镶嵌状单层）。比例尺：150 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="神经元分化过程；体外 MAP2/突触素、PSD-95/突触素；荧光图像、电生理学。" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 由 hiPSC 分化的神经元的表征。 A. 在开始分化后的不同时间点，对由 hiPSC 分化的神经元进行 MAP2（绿色）和突触素-1/2（红色）染色。比例尺：10 µm。 B. 两次独立实验中突触素斑点的定量分析。每次实验至少分析了 10 个细胞。 C. 在两个独立的 iPSC 细胞系来源的神经元中，于 DIV23（分化后第 23 天）对突触素斑点进行定量分析。D. 在开始分化 23 天后，对由 hiPSC 分化的神经元进行 PSD-95（绿色）和突触素-1/2（红色）染色。突触素斑点与 PSD-95 斑点相邻。 E. 在开始分化 23 天后，对由 hiPSC 分化的神经元进行 MAP2（绿色）与 BRN2（红色）或 SATB2（红色）的染色。 F. 表达指定标志物的 MAP2 阳性细胞所占百分比。 G. 典型的电流钳记录显示，在开始分化后 7 天即可产生动作电位。H. 在诱导分化后的不同时间点，能够产生一个或多个动作电位的细胞所占百分比。 I. 由 hiPSC 分化的神经元在分化后不同时间点接收到的兴奋性突触后电流（EPSCs）的代表性轨迹。 J. 发育过程中兴奋性突触后电流的频率。 K. 发育过程中兴奋性突触后电流的幅度。 L. 在无（对照）和有 CNQX（CNQX）条件下 EPSC 记录的代表性轨迹。 M. 来自一个 hiPSC 细胞系的神经元被培养在 6 孔 MEA 上，显示了在诱导分化后 16 天和 23 天时 hiPSC 来源神经元网络的网络活动。每个孔记录到的活动（采样率为 10 kHz）以不同颜色表示（显示 20 分钟记录中的 5 分钟）。 N. 诱导分化后 16 天和 23 天的放电率。 O. 诱导分化后 16 天和 23 天的簇状放电率。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
根据上述结果，可通过建立细胞的神经生理学特征来评估所获得的hiPSC分化神经元的质量。即在分化开始后三至四周，可对神经元的形态、突触素-1/2表达以及电生理特性进行评估。在此时间点，预期hiPSC分化的神经元应呈现类似神经元的形态，在免疫细胞化学检测中表现为MAP2、突触素/PSD-95阳性，并表现出自发性电生理活动（包括单细胞水平和网络水平）。

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人&#160;诱导&#160;多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。

由人类诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的神经元为研究神经系统疾病提供了一种极具前景的新工具。在过去十年中，……

本神经元分化方案的总体目标是以快速且可控的方式，利用生长在微电极阵列上的人诱导性多能干细胞生成神经元网络。该方法可用于解决神经科学领域中的关键问题，既可用于研究神经系统疾病背后的生物学机制，也可用于探讨更为基础的神经生物学问题。该技术的主要优势在于能够以受控方式快速将诱导性多能干细胞分化为神经元。第一天，将DMEM/F12、CDS和含1%青霉素-链霉素的E8培养基恢复至室温。接着，向E8培养基中加入多西环素，使其终浓度为4 µg/mL，然后向该混合物中加入ROCK抑制剂。吸除RTTANGN2阳性hiPSCs的旧培养基，并向细胞中加入1毫升CDS。随后，在湿润的37°C培养箱中孵育细胞3至5分钟。在显微镜下观察细胞是否相互脱离。然后，向孔中加入 2 毫升 DMEM/F12 培养基。用 1,000 微升移液器轻轻重悬细胞，并将其转移至 15 毫升离心管中。随后，向细胞悬液中加入 7 毫升 DMEM/F12 培养基，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。五分钟后，吸除上清液，加入两毫升配制好的 E8 培养基。将 1,000 微升移液器枪头抵住 15 毫升离心管管壁，轻轻吹打重悬细胞，使 hiPSCs 解离。在显微镜下观察细胞是否已充分解离。然后，使用血细胞计数板测定每毫升的细胞数量。对于六孔微电极阵列（MEA），将细胞稀释至浓度为7.5 × 10⁵ 个细胞/毫升的细胞悬液。对于盖玻片，将细胞稀释至浓度为4 × 10⁴ 个细胞/毫升的细胞悬液。吸出盖玻片和六孔MEA中的稀释层粘连蛋白溶液。对于六孔MEA，将100微升细胞悬液加入每孔的活性电极区域进行接种。然后向24孔板的每孔中加入500微升细胞悬液进行接种。接着，将六孔MEA板或24孔板置于37°C、加湿的培养箱中。两小时后，向六孔MEA板的每个孔中小心加入500 µL已配制好的E8培养基。随后，将六孔MEA板在37°C、加湿的培养箱中过夜培养。第3天，将0.05%胰蛋白酶-EDTA预热至室温，将含1%青霉素-链霉素的DPBS和DMEM/F12培养基预热至37摄氏度。随后，吸除大鼠星形胶质细胞培养物中的旧培养基。加入 5 mL DPBS 轻柔晃动以洗涤细胞。随后吸除 DPBS，加入 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。轻柔晃动使胰蛋白酶-EDTA均匀分布。然后将细胞置于37摄氏度、湿润的培养箱中孵育5到10分钟。随后在显微镜下观察，检查细胞是否已脱落。通过轻轻敲击培养瓶数次使剩余细胞脱落。然后，向培养瓶中加入 5 mL DMEM/F12。用 10 mL 移液管轻轻吹打培养瓶内的细胞。随后，将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中。将离心管在200 × g条件下离心8分钟。随后吸除上清液，并将细胞重悬于1毫升DMEM/F12培养基中。使用血细胞计数板测定每毫升细胞数量。接下来，向六孔微电极阵列（MEAs）的每孔中加入 7.5 × 10⁴ 个星形胶质细胞，向24孔板的每孔中加入 2 × 10⁴ 个星形胶质细胞。将细胞置于37 °C、湿润的培养箱中过夜培养。使用MCS数据采集卡，在1,200倍放大倍数下以10千赫兹的采样频率采集数据。记录人诱导多能干细胞衍生的神经元在微电极阵列（MEA）上培养时20分钟的电生理活动。记录过程中，保持温度为37摄氏度，并通过向MEA持续输送湿润的慢速气体，防止培养基蒸发和pH值变化。随后，使用自定义软件包分析数据。该图显示了分化过程中突触素（synapsin）中神经元标志物MAP2的表达变化，表明神经元成熟。该图显示，在分化过程中，单个细胞的突触素表达量逐渐增加。细胞在分化三周后表达的突触素与PSD-95共定位，表明存在功能性的突触。在此，于分化过程的不同时间点进行全细胞膜片钳记录，以检测细胞的电生理活性。在各个时间点，细胞均能够产生动作电位。随着时间推移，产生动作电位的细胞比例逐渐增加，表明大多数细胞即使在分化的早期阶段也能够生成动作电位。同时采用膜片钳技术检测细胞接收到的兴奋性突触后电流。在分化过程中，细胞接收的输入数量逐渐增加。在分化过程中，兴奋性突触后电流的频率和幅度均增加。通过微电极阵列记录细胞分化过程中的电生理活性。在此，神经网络活动在分化过程中逐渐增强，并在第23天后出现同步化放电事件。一旦掌握，该技术可在三到四周内将诱导性多能干细胞分化成功能性的神经元网络。在进行该操作时，务必注意保持无菌操作，并轻柔处理细胞。在完成该操作后，可采用其他方法（如药理学检测）来挽救在患者细胞系中观察到的表型。该技术问世后，为神经科学领域的研究人员正式研究神经系统疾病中的网络活动缺陷铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何快速且可控地将诱导性多能干细胞分化为神经元的方法。

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