利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

本神经元分化方案的总体目标是以快速且可控的方式，利用生长在微电极阵列上的人诱导性多能干细胞生成神经元网络。该方法可用于解决神经科学领域中的关键问题，既可用于研究神经系统疾病背后的生物学机制，也可用于探讨更为基础的神经生物学问题。

该技术的主要优势在于能够以受控方式快速将诱导性多能干细胞分化为神经元。第一天，将DMEM/F12、CDS和含1%青霉素-链霉素的E8培养基恢复至室温。接着，向E8培养基中加入多西环素，使其终浓度为4 µg/mL，然后向该混合物中加入ROCK抑制剂。

吸除RTTANGN2阳性hiPSCs的旧培养基，并向细胞中加入1毫升CDS。随后，在湿润的37°C培养箱中孵育细胞3至5分钟。在显微镜下观察细胞是否相互脱离。

然后，向孔中加入 2 毫升 DMEM/F12 培养基。用 1,000 微升移液器轻轻重悬细胞，并将其转移至 15 毫升离心管中。随后，向细胞悬液中加入 7 毫升 DMEM/F12 培养基，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。

五分钟后，吸除上清液，加入两毫升配制好的 E8 培养基。将 1,000 微升移液器枪头抵住 15 毫升离心管管壁，轻轻吹打重悬细胞，使 hiPSCs 解离。在显微镜下观察细胞是否已充分解离。

然后，使用血细胞计数板测定每毫升的细胞数量。对于六孔微电极阵列（MEA），将细胞稀释至浓度为7.5 × 10⁵ 个细胞/毫升的细胞悬液。对于盖玻片，将细胞稀释至浓度为4 × 10⁴ 个细胞/毫升的细胞悬液。

吸出盖玻片和六孔MEA中的稀释层粘连蛋白溶液。对于六孔MEA，将100微升细胞悬液加入每孔的活性电极区域进行接种。然后向24孔板的每孔中加入500微升细胞悬液进行接种。

接着，将六孔MEA板或24孔板置于37°C、加湿的培养箱中。两小时后，向六孔MEA板的每个孔中小心加入500 µL已配制好的E8培养基。随后，将六孔MEA板在37°C、加湿的培养箱中过夜培养。

第3天，将0.05%胰蛋白酶-EDTA预热至室温，将含1%青霉素-链霉素的DPBS和DMEM/F12培养基预热至37摄氏度。随后，吸除大鼠星形胶质细胞培养物中的旧培养基。

加入 5 mL DPBS 轻柔晃动以洗涤细胞。随后吸除 DPBS，加入 5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。轻柔晃动使胰蛋白酶-EDTA均匀分布。

然后将细胞置于37摄氏度、湿润的培养箱中孵育5到10分钟。随后在显微镜下观察，检查细胞是否已脱落。通过轻轻敲击培养瓶数次使剩余细胞脱落。

然后，向培养瓶中加入 5 mL DMEM/F12。用 10 mL 移液管轻轻吹打培养瓶内的细胞。随后，将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中。

将离心管在200 × g条件下离心8分钟。随后吸除上清液，并将细胞重悬于1毫升DMEM/F12培养基中。使用血细胞计数板测定每毫升细胞数量。

接下来，向六孔微电极阵列（MEAs）的每孔中加入 7.5 × 10⁴ 个星形胶质细胞，向24孔板的每孔中加入 2 × 10⁴ 个星形胶质细胞。将细胞置于37 °C、湿润的培养箱中过夜培养。

使用MCS数据采集卡，在1,200倍放大倍数下以10千赫兹的采样频率采集数据。记录人诱导多能干细胞衍生的神经元在微电极阵列（MEA）上培养时20分钟的电生理活动。记录过程中，保持温度为37摄氏度，并通过向MEA持续输送湿润的慢速气体，防止培养基蒸发和pH值变化。

随后，使用自定义软件包分析数据。该图显示了分化过程中突触素（synapsin）中神经元标志物MAP2的表达变化，表明神经元成熟。该图显示，在分化过程中，单个细胞的突触素表达量逐渐增加。

细胞在分化三周后表达的突触素与PSD-95共定位，表明存在功能性的突触。在此，于分化过程的不同时间点进行全细胞膜片钳记录，以检测细胞的电生理活性。在各个时间点，细胞均能够产生动作电位。

随着时间推移，产生动作电位的细胞比例逐渐增加，表明大多数细胞即使在分化的早期阶段也能够生成动作电位。同时采用膜片钳技术检测细胞接收到的兴奋性突触后电流。在分化过程中，细胞接收的输入数量逐渐增加。

在分化过程中，兴奋性突触后电流的频率和幅度均增加。通过微电极阵列记录细胞分化过程中的电生理活性。在此，神经网络活动在分化过程中逐渐增强，并在第23天后出现同步化放电事件。

一旦掌握，该技术可在三到四周内将诱导性多能干细胞分化成功能性的神经元网络。在进行该操作时，务必注意保持无菌操作，并轻柔处理细胞。在完成该操作后，可采用其他方法（如药理学检测）来挽救在患者细胞系中观察到的表型。

该技术问世后，为神经科学领域的研究人员正式研究神经系统疾病中的网络活动缺陷铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何快速且可控地将诱导性多能干细胞分化为神经元的方法。