Name: 在Active ERK的时空分析℃。线虫生殖系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习利用免疫荧光成像技术对秀丽隐杆线虫生殖系中的活性ERK进行时空定位分析。该方法可定量检测ERK信号模式与强度，为研究RAS-ERK通路在生殖细胞发育中的作用提供可靠的体内实验手段。

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Arur实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIHGM98200）、德克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT RP160023）、美国癌症协会研究学者奖（ACS RSG014-044-DDC）以及安娜·富勒基金的资助。

本文所述方案主要针对无脊椎动物模型系统 C. elegans，并遵循机构制定的所有伦理准则。
1. 动物饲养
<ol>
	<li>维持 秀丽隐杆线虫 线虫生长培养基上的工作储备菌种20,21 （NGM，参见 材料表接种有 E. coli OP50</li>
	<li>将线虫品系保存在16 °C至25 °C的温度范围内。 
	注意：在较高温度下培养线虫会加快其生长速度，但通常会导致生殖系发育异常以及子代数量减少。此外，温度敏感型基因型在不同温度下会表现出不同的表型。</li>
	<li>根据线虫的生长速度，每2至3天将其转移至新的NGM平板，以维持充足且营养状态良好的线虫供应。 
	注意：涉及 dpERK 水平的任何实验中，线虫不应取自饥饿或拥挤的培养板。拥挤或饥饿会影响线虫的胰岛素信号传导22，且胰岛素信号通路调控ERK12 因此，来自饥饿或过度拥挤培养板的蠕虫将导致染色模式不稳定且难以重复。</li>
</ol>
2. 获取性腺的成虫解剖
<ol>
	<li>选取100 - 150条处于所需特定发育阶段（L1、L2、L3、L4、成虫）的野生型（N2）或目标基因型线虫， 等等在1.5 mL微量离心管中，加入100 µL M9缓冲液。</li>
	<li>用900 µL M9缓冲液填充微量离心管（参见 材料表). 在常温下，将离心管于微量离心机中以 1,000 x g 离心 1 分钟。</li>
	<li>轻轻移除 900 µL 的 M9 缓冲液并弃去。在体视显微镜下移除缓冲液，以确保不会意外移走线虫。</li>
	<li>重复步骤 2.2 - 2.3 两次，每次使用新鲜的 M9 缓冲液。此操作可有效去除随线虫带入的任何细菌。</li>
	<li>最后一次洗涤后，从离心管中移除900 µL M9缓冲液并弃去。</li>
	<li>将剩余的100 µL M9缓冲液（含100–150条线虫）用200 µL移液器吸头转移至平底玻璃培养皿中。使用前需确保移液器吸头已在10 µL刻度处剪断。若不剪断吸头，会导致线虫被剪切损伤。</li>
	<li>向含有线虫的M9缓冲液的玻璃培养皿中加入1 - 3 µL的0.1 M左旋咪唑。轻轻摇晃，使左旋咪唑与M9缓冲液充分混匀，直至线虫停止运动。 
	注意：左旋咪唑储备液可于 -20 °C 长期保存。此处使用的浓度为 1 - 3 mM，高于文献中所述浓度。23 使用0.2–0.25 mM的左旋咪唑可使动物迅速丧失运动能力。若动物在液体悬浮液中剧烈翻滚时间过长，可能导致性腺中dpERK的表达模式出现差异（可能由于应激或营养缺乏，或二者共同作用）。在解剖过程中，采用1–3 mM左旋咪唑可获得更可重复的染色模式。</li>
	<li>将两支25 G针头分别连接到两个1 mL注射器上（注射器的大小无关紧要，针头的规格至关重要）。每只手各持一支注射器，图2).</li>
	<li>在解剖显微镜下，将每根针按图示位置分别置于每条线虫的下方和上方 图2 用剪刀样动作在蠕虫的第二咽球附近进行精细切割。每只蠕虫切割一次后，立即转向下一只动物，直至培养皿中的所有个体至少被切割一次。 
	注意：步骤 2.8–2.9 对时间敏感。应在五分钟内完成培养皿中所有线虫的解剖，以获得可重复的 dpERK 表达模式。解剖时间过长将导致 dpERK 信号减弱，尤其是在第 1 区。请根据每轮解剖的线虫数量进行调整（即，50 条蠕虫 与&#160;如有必要，可调整至150）以保持在规定的时间范围内。
	<ol>
		<li>如果在解剖过程中未观察到外翻的性腺，则不要在同一动物个体上尝试再次切割。通常这只会导致线虫被剪断，而无法使性腺外翻。此时应继续使用下一个动物个体。在第6步制备的载玻片中，性腺未外翻的线虫将清晰可见，成像时可予以忽略。 
		注意：在整个解剖和处理过程中，需始终注意性腺将保持与身体/尸体相连。切勿使用解剖针强行将性腺与身体分离，因为试图将性腺从身体上切断时可能导致性腺组织异常撕裂，从而引起非特异性抗体信号。在成像步骤（第6节）中可忽略身体/尸体部分，仅对性腺进行成像。此外，有时肠道细胞也可作为所检测抗体的内参对照/体细胞对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 性腺固定
<ol>
	<li>解剖完成后，向含有100 μL M9缓冲液和已解剖动物的玻璃培养皿中直接加入2 mL 3%多聚甲醛（PFA），并用封口膜（Parafilm）密封。将密封后的培养皿置于化学通风橱中。 
	注意：PFA为危险化学品，因此固定步骤必须在化学通风橱中进行。</li>
	<li>在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>使用一次性9&#34;玻璃巴斯德吸管，向含有已解剖动物的培养皿中加入3 mL 1× PBS-T（见材料表）。通过用巴斯德吸管吸取PFA溶液和1× PBS-T混合液（含已解剖动物），然后轻轻释放回培养皿中，进行混匀。洗涤过程中切勿涡旋振荡。</li>
	<li>使用新的玻璃巴斯德吸管，将培养皿中的5 mL液体（含已解剖线虫、PFA和1× PBS-T）吸入吸管中，并转移至一个新的5 mL玻璃锥形管中。</li>
	<li>将锥形管在临床离心机中以1,000 × g离心30秒。请使用玻璃巴斯德吸管和玻璃锥形管，因为已解剖的性腺容易黏附于塑料器皿表面。</li>
	<li>小心移除并弃去上清液，注意不要扰动已解剖的动物。每次洗涤后，均应在体视显微镜下小心吸除锥形管中的液体，以避免影响已解剖的性腺，并尽量减少样本损失。</li>
	<li>使用新的巴斯德吸管，向锥形管中加入5 mL 1× PBS-T。将锥形管在临床离心机中以1,000 × g离心30秒。小心移除并弃去上清液，注意不要扰动已解剖的动物。</li>
	<li>重复步骤3.7，共进行三次。</li>
	<li>使用新的巴斯德吸管，向管中加入2 mL 100%甲醇，并通过反复吸取使性腺与甲醇充分混匀。将管置于-20 °C孵育至少1小时。 
	注：已解剖的性腺可在甲醇中保存最多2天，适用于dpERK染色。若保存时间超过2天但不超过2周，则适用于其他抗体染色（如抗核纤层蛋白抗体染色），但不适用于dpERK抗体染色。</li>
	<li>达到所需孵育时间后，重复步骤3.7，共洗涤三次。洗涤过程中切勿涡旋振荡。最后一次洗涤后，在5 mL锥形管中保留500 μL 1× PBS-T。</li>
	<li>使用新的巴斯德吸管，将玻璃锥形管中的内容物转移至一个新的1 mL玻璃管（6 mm × 50 mm）。让已解剖的动物在重力作用下自然沉降5–10分钟。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用新的巴斯德吸管小心吸除1 mL玻璃管中的大部分洗涤液，注意不要扰动已解剖的性腺。</li>
</ol>
4. 封闭与一抗孵育
<ol>
	<li>在1 mL玻璃管中，向已解剖的样本加入100 µL用1× PBS-T稀释的30%正常山羊血清（NGS）（参见材料表）。30% NGS作为封闭缓冲液。用Parafilm封口以防止液体蒸发。在室温下孵育1小时，或在4 °C下过夜孵育。</li>
	<li>完成预定孵育时间后，使用新的巴斯德吸管移除封闭缓冲液，并尽可能吸尽液体。使用解剖显微镜观察，确保性腺未被吸入巴斯德吸管中。</li>
	<li>将MAPKYT抗体（参见&#160;材料表，本方法中称为dpERK）用30% NGS按1:400比例稀释。每管准备100 µL抗体稀释液。未使用完的稀释抗体可在4 °C保存一周。</li>
	<li>向含有已解剖样本的1 mL玻璃管中加入100 µL稀释后的抗-dpERK抗体溶液。用Parafilm密封管口，在4 °C下过夜孵育。</li>
	<li>过夜孵育后，在室温下向各管中加入800 µL 1× PBST。</li>
	<li>用新的玻璃巴斯德吸管吸取样本，轻柔释放，确保性腺在1× PBS-T中均匀悬浮。让性腺依靠重力沉降至管底，然后移除上清液。此步骤可确保已解剖的性腺被充分洗涤，同时避免操作过程中造成损伤。</li>
	<li>重复步骤4.5至4.6，共进行三次洗涤。洗涤过程中禁止涡旋震荡。第三次洗涤后，务必在不扰动已解剖样本的前提下，尽可能彻底移除并弃去上清液。每次操作均须使用新的巴斯德吸管。</li>
</ol>
5. 二抗处理
<ol>
	<li>在孵育一抗的同时，配制二抗的稀释液。将抗小鼠二抗用30% NGS按1:500比例稀释。与一抗相同，每管加入100 µL。未用完的抗体可于4 °C保存一周。</li>
	<li>向含有解剖后动物的1 mL玻璃管中加入100 µL二抗溶液。用Parafilm封口，再用铝箔纸包裹各管，避光孵育。室温孵育2小时，或4 °C过夜。</li>
	<li>孵育至所需时间后，向各管中加入800 µL 1x PBS-T，重复步骤4.5–4.6，共洗涤三次。最后一次洗涤后，在体视显微镜下用新的巴斯德吸管尽可能吸除并弃去上清液。</li>
	<li>在二抗孵育的洗涤步骤期间配制 DAPI 溶液。取 1 µL DAPI（来自保存在 -20 °C 的 1,000 倍浓缩液，浓度为 1 mg/mL），加入 1 mL 1x PBST 中稀释。</li>
	<li>向含有解剖后动物的离心管中加入 800 µL 稀释后的 DAPI 溶液。用 Parafilm 封住管口，并用铝箔包裹每根离心管。在室温下孵育&#160;20分钟。</li>
	<li>孵育 DAPI 后，在解剖显微镜下用新的巴斯德吸管尽可能吸除 DAPI 溶液，注意不要扰动已解剖的样本。</li>
	<li>加入1滴封片液至各管中。用铝箔包裹每根管子。 
	注意：为了观察dpERK染色，染色后的性腺应立即封片进行显微镜观察。对于其他抗体应用，如磷酸化组蛋白H3丝氨酸10（phosphorylated serine 10 Histone H3），性腺可在4 °C避光条件下保存于封片剂中长达2周。</li>
</ol>
6. 装配载玻片与成像
<ol>
	<li>如图3所示，将一层实验室胶带沿长度方向贴在两张载玻片（25 mm × 75 mm × 1 mm）的顶部。将一张新的洁净载玻片插入两张已贴胶带的载玻片之间。 
	注意：胶带的厚度有助于在中间载玻片上形成琼脂糖垫。琼脂糖垫的厚度几乎与胶带相同，因为胶带在此起到间隔物的作用，用于形成琼脂糖垫。</li>
	<li>在中间的载玻片上滴加约 200 µL 已融化的 2% 琼脂糖（用蒸馏水配制）。迅速将一张新的洁净载玻片垂直放置于琼脂糖之上。&#160;</li>
	<li>让琼脂糖凝固（1 - 2 分钟）。</li>
	<li>非常轻柔地移除顶部的载玻片，以避免破坏琼脂糖垫。琼脂糖垫可附着在顶部或底部的载玻片上，只要其表面光滑即可，附着在哪一侧并不重要。</li>
	<li>使用巴斯德移液管将解剖好的样本转移至琼脂糖垫上。在解剖显微镜下，用巴斯德移液管吸除载玻片上的多余液体。</li>
	<li>使用睫毛毛或精细拉制的毛细管，将性腺和肠道彼此推开，以便在载玻片上充分展开性腺。</li>
	<li>用 24 mm × 50 mm 的盖玻片覆盖载玻片。操作时应小心，确保盖玻片被轻柔地放下，尽量减少盖玻片与载玻片之间产生气泡。</li>
	<li>将载玻片放入不透明的载玻片盒中，于 4 °C 过夜保存（载玻片平放，盖玻片朝上），以使多余液体蒸发，并使性腺因盖玻片的重量而略微压平。性腺的轻微压平有助于更好地成像原本呈圆形的性腺管。
	<ol>
		<li>盖玻片安装后，切勿用手指按压其顶部。这种操作常会导致性腺变形并丧失 dpERK 信号。</li>
		<li>仅为了获得更有效的成像效果，才需过夜压平性腺&#160;。载玻片组装完成后即可进行观察。若需立即成像，可用干净的实验纸巾从盖玻片与载玻片的边缘轻轻吸除多余液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过夜&#160;后，在盖玻片的四个角及盖玻片与载玻片的边界处涂抹透明指甲油封固。指甲油/盖玻片密封可确保成像过程中盖玻片不会移动，并保护样本免受破坏。</li>
	<li>使用复式显微镜在 63X 下对性腺进行成像。然而，物镜和显微镜的选择可根据可用设备和用户需求进行调整。由于整个性腺从增殖区到卵母细胞的尺寸大于单张图像所能捕获的范围，因此图像应以拼接图形式采集，各图像间保留重叠边界，如图4所示。11-14, 18。
	<ol>
		<li>在最终成像和拼接完成后，可在不影响生殖系图像主要结构的前提下对组织残余部分进行编辑。应同时保存原始图像和拼接后的图像，以便比较拼接/编辑前后的图像差异。 
		注意：在拼接图像过程中，不得对显微图像的信号强度或饱和度进行任何修改。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

活化的ERK（dpERK）在 C. elegans 生殖系中表现出典型的时空定位模式。这种模式化的dpERK空间分布（图5）以及在成年 C. elegans 性腺中的信号强度，可有效关联到ERK所调控的多种生物学过程。例如，在第2区无法激活ERK会导致卵母细胞停滞于减数分裂的前期，这一表型可见于不产生精子的雌性生殖系，因而这些卵母细胞中ERK无法在成熟阶段被激活（图5）。与雄性交配后，雌性生殖系中的第2区会出现dpERK的有效积累11,13，并伴随卵母细胞成熟和排卵的启动。因此，通过分析特定遗传扰动（如RNA干扰介导的基因失活）或化学处理条件下dpERK的空间分布模式及其时间动态变化，可鉴定出调控ERK信号通路及其依赖性生物学过程的相关因子。此类分析还有助于发现信号通路之间新的遗传相互作用。
对于任何基于成像的分析而言，一个关键瓶颈在于缺乏适用于特定实验的功能性试剂，例如特异性的抗体。如果存在此类试剂，则上述方法可轻松地被调整用于分析任何目的蛋白的定位模式。因此，该方法的应用受限于功能性抗体的可获得性。此外，由于该方法描述的是在特定发育时间点进行的解剖与染色操作，它仅能捕获单一时间点的信息，无法实时揭示蛋白质动态变化、调控机制或蛋白质周转速率。
上述方法改编自 Francis 等23，这与Seydoux和Dunn方法不同24 用于性腺挤出和抗体染色。该方法基于 Francis 等 将被称为 &#34;悬浮法&#34; 以及Seydoux和Dunn方法称为的 &#34;冷冻裂解法&#34; 作为对照。在我们看来，悬浮法在获取信号分子（如dpERK）可重复的定位模式方面非常有效，这类分子本身对剧烈处理条件更为敏感。以dpERK定位为例，据我们的经验，采用冰冻裂解法时，1区的信号几乎无法检测。此外，冰冻裂解法常导致样品干燥，从而产生非特异性的抗体信号。而悬浮法由于在整个过程中 gonads 始终悬浮于液体中，可最大限度减少样品干燥。我们还发现，悬浮法适用于在同一张载玻片上对多种不同基因型进行成像。例如，若需比较两种基因型（如雌雄同体） 与 若需直接比较雌性个体中dpERK的定位情况，则可将两种基因型样本混合后一同处理。此方法可行的原因在于两种表型特征明显，可明确区分。 通过 DAPI形态学分析。将不同基因型的性腺组织在同一管中染色后，置于同一载玻片上成像，可实现不同基因型间性腺的直接比较。若DAPI形态难以区分，则可采用两步抗体染色法：首先，针对每种基因型分别使用两种不同的特异性抗体，即抗体A用于野生型（WT），抗体B用于突变体（两种抗体的宿主须与dpERK抗体的宿主不同）。在完成两种基因型样本的初级抗体孵育并洗涤后，可将它们混合于同一管中，随后共同进行dpERK抗体染色，再经二抗孵育以同时可视化管内所有抗体信号。该方法使得不同基因型样本可在同一载玻片上进行比较，尤其在推断激活模式时，可避免因染色条件差异而带来的干扰，确保结果解读的准确性。

关键词：DAPI形态学，基因型比较，共染色，抗体染色，dpERK，性腺，野生型，突变体
尽管该悬浮法具有优势，但其操作过程中有多步需要谨慎处理。解剖过程必须高效地进行，尤其应注意解剖时间不应超过5分钟。过长的解剖时间会导致dpERK信号出现变异，这种变异常被误认为是ERK激活的调控性变化，而实际上可能是技术操作失败所致。每次解剖应至少准备100至150只动物，因为在后续的多次洗涤步骤中，由于移液操作误差，生殖腺容易从离心管中丢失。为减少生殖腺丢失，可采用分多个小批次解剖（例如每次50只动物，共三个批次）后再合并的方式，或一次性解剖150只动物的大批次方法。另一个挑战是如何使生殖腺在载玻片上均匀分散排列，以便能够完整成像远端生殖腺。为此，可使用绑在火柴棒上的睫毛毛或拉制的移液毛细管来分散生殖腺。但在此过程中需格外小心，避免损伤生殖腺。通常情况下，掌握这些解剖及生殖腺在载玻片上的排列技术需要多次尝试和练习。
一旦掌握了该技术，它便成为一种强大的方法，可用于多种生物学分析，而不仅限于检测dpERK水平。例如，该方法可用于可视化活性p38水平、活性CDK水平，或任何存在特异性抗体试剂的蛋白质。此外，该方法还可与整体动物中的化学抑制筛选相结合，用于检测通路中新的抑制剂或激活剂。 通过 检测dpERK水平。这将使得能够进行 体内 可同时读取反应结果以及对可能与RTK-RAS-ERK信号通路相互作用的抑制剂的敏感性。此外，该方法可联合使用多种抗体，同时检测并可视化多个信号输出。通过使用多种抗体，可在同一样本组织内实现多条信号通路之间、其活化状态与生物学结果的相关性分析，从而更深入理解这些通路间的相互作用。以上仅为该方法进一步应用的若干示例，该系统亦可根据不同研究需求进行调整，用于探索多种科学问题。

受体酪氨酸激酶（RTK）-大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（RAS）-细胞外信号调节激酶（ERK）通路通过一个保守的激酶级联反应传递胞外信号，最终导致ERK的磷酸化和活化1-3ERK蛋白是保守的脯氨酸导向丝氨酸/苏氨酸MAP（有丝分裂原活化蛋白）激酶家族的成员，可被MEK直接激活 通过 在保守的TEY基序中的苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）上发生双重磷酸化。活化的ERK（称为双磷酸化ERK，dpERK）随后通过磷酸化一系列下游底物，调控多种细胞和发育过程。1-3因此，异常的ERK活性会导致多种细胞和发育缺陷4-7.
ERK 活性的严格调控对于正常发育至关重要：在哺乳动物系统中，过高的 ERK 活性会导致细胞过度增殖，从而引发癌性生长；而活性过低则会导致细胞死亡4,6。此外，ERK 活性持续时间的变化也会导致不同的结果：在 PC12 细胞中，ERK 激活持续 30 分钟或更短时间会诱导细胞增殖，而激活持续 60 分钟或更长时间则会诱导神经元分化8,9。因此，对 ERK 活性进行严密调控对于正常的发育和稳态显然至关重要。
C. elegans 是一个功能强大且遗传上易于操作的模型系统，可用于解析 RTK-RAS-ERK 信号通路的功能与调控机制3,10-15。与包含多个 RAS 和 ERK 基因的哺乳动物系统相比，C. elegans 仅含有一个 RAS 基因（let-60）和一个 ERK 基因（mpk-1），使其成为研究该信号通路功能时遗传操作更为简便的系统3,10-14。C. elegans 的生殖腺本质上是一个管状结构，其远端为有丝分裂的干细胞，近端为成熟的卵母细胞（图 1）16。生殖细胞在远端有丝分裂区近端开始进入减数分裂，并经历一个较长的减数分裂前期（粗线期），随后在环形区域开始形成卵母细胞，最终在近端区域完成卵母细胞的成熟过程16。
多个实验室（包括我们自己的实验室）的遗传学研究已表明，RTK-RAS-ERK 信号通路在生殖系发育过程中至关重要 秀丽隐杆线虫12,13,15,17-19具体而言，我们发现ERK在生殖系发育过程中调控并协调至少九种不同的生物学过程，范围涵盖发育转换（如生殖细胞凋亡）和细胞生物学过程（如卵母细胞生长）等11,18与哺乳动物系统相似，过多的ERK活性在 秀丽隐杆线虫 生殖系中活性过高会导致产生多个小型卵母细胞，而活性过低则导致形成一个大型卵母细胞11因此，dpERK 的严格调控对于正常的生殖系发育至关重要。通过特异性识别 dpERK 的抗体所显示的 ERK 活性形式呈现出典型的、动态的双相定位模式：在中期粗线期，dpERK 水平较高（第1区，图1），在环区较低，而在成熟卵母细胞中再次升高（第2区，图1）。最近，我们发现营养通过胰岛素样生长因子受体-1（Insulin-like Growth Factor receptor-1, IGF-1R）发挥作用daf-2) 以在1区激活ERK12；先前的研究表明，精子信号（通过 Ephrin 受体酪氨酸激酶在2区激活ERK13.
鉴于活化的ERK在生殖系中作为调节因子调控卵母细胞生长，&#160;dpERK 的空间和时间定位及其振幅对于理解其正常的信号转导结果至关重要。通过本文所述方法，可便捷地监测 dpERK 典型定位模式的变化，并据此预测环境或遗传扰动对 ERK 活性及其功能的影响。因此，检测 dpERK 有助于全面理解其在生殖系发育过程中的作用。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Inc.</td><td>A9539</td><td>将2 g溶于100 mL水中，配制成2%溶液</td></tr><tr><td>平底玻璃培养皿</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4161</td><td>我们使用玻璃器皿，因为解剖后的性腺常会粘附在塑料上</td></tr><tr><td>25 G针头</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>注射器（可使用1或5 mL）</td><td>BD Syringes</td><td>1 mL: BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（25 × 75 × 1.0 mm）</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（24 × 50 mm）</td><td>Corning</td><td>2935-245</td><td></td></tr><tr><td>5 mL玻璃锥形管</td><td>Corning</td><td>8060-5</td><td></td></tr><tr><td>9&quot;一次性巴斯德吸管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>临床台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃&amp;nbsp;管（6 × 50 mm）</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-A</td><td></td></tr><tr><td>*M9溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>3%多聚甲醛（PFA）</td><td>电子显微镜服务公司</td><td>17500</td><td>以安瓿瓶装16%溶液购得，用磷酸钾缓冲液稀释至3%</td></tr><tr><td>1× PBS-T</td><td>含0.1% Tween 20的1× PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>电子显微镜服务公司</td><td>18510</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Cell Signaling</td><td>5425</td><td>用1× PBS-T稀释至30%</td></tr><tr><td>MAPKYT（dpERK）抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma Inc.</td><td>M9692</td><td>在30% NGS中按1:400稀释</td></tr><tr><td>二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>在30% NGS中按1:500稀释</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>*M9缓冲液配方</td><td></td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，5 g NaCl，1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，加H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至1 L。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>**PBS（1×）</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.133 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.10 g MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，加H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至1 L</td></tr><tr><td>线虫生长培养基（NGM）</td><td></td><td></td><td>3 g NaCl，17 g琼脂，2.5 g蛋白胨，975 mL水加入2 L锥形瓶中。高压灭菌50分钟。冷却后加入1 mL 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mL 5 mg/mL胆固醇，1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，以及25 mL 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

空间与时间上对 c. elegans 生殖系中活性 erk 的分析

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

进化上保守的&#160;细胞外信号转导RTK-RAS-ERK通路是一种重要的激酶信号级联途径，主要调控多种细胞和发育过程 通过 ERK 是该通路的终末激酶，其激活至关重要。ERK 活性的严格调控对于正常发育和稳态维持必不可少；ERK 活性过高会导致细胞过度增殖，而活性不足则引发细胞死亡。 秀丽隐杆线虫 是一种强大的模式系统，已帮助阐明发育过程中RTK-RAS-ERK信号通路的功能与调控机制。特别是，RTK-RAS-ERK通路对于 秀丽隐杆线虫 生殖系发育，这是本方法的重点. 使用特异性识别 ERK 活性双磷酸化形式（dpERK）的抗体，可在生殖系中观察到典型的定位模式。由于该模式在空间和时间上均受到精确调控，因此能够可重复地检测 dpERK 信号，有助于鉴定影响 dpERK 信号持续时间与强度进而调控生殖系发育的通路调节因子。本文展示了如何成功地对生殖系中的 dpERK 进行解剖、染色和成像 秀丽隐杆线虫 性腺。该方法可适用于任何信号蛋白或结构蛋白在空间上的定位 秀丽隐杆线虫 性腺，前提是存在适用于免疫荧光的抗体。

在野生型成年雌雄同体动物中，dpERK 通常在双线期中期区域（第1区）以及最成熟的卵母细胞（从-1到-4或-5，第2区）中可见。该激活模式的改变反映了信号通路的变化。雌性生殖系不产生精子，因此在第2区不显示ERK激活，仅在第1区有微弱激活。这些结果如图5所示。
<img alt="秀丽隐杆线虫性腺示意图，显示卵母细胞、粗线期、胚胎，用于发育生物学研究。" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：C. elegans 生殖系形态学。成年雌雄同体线虫的微分干涉差（DIC）图像，其中一个U形性腺臂由白线标出。成年雌雄同体性腺在远端顶端含有有丝分裂细胞。这些有丝分裂细胞进入减数分裂，并经过减数分裂前期（粗线期），在近端性腺中发育为成熟的卵母细胞。区域1和区域2标记了成年雌雄同体性腺中dpERK的典型定位。比例尺：20 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="解剖显微镜、注射器、线虫、实验装置、显微成像、生物学研究。" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：解剖过程中针头位置示意图。 左图：正在进行解剖操作的实物照片。右图：相对于线虫的针头位置示意图。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用琼脂和胶带制备载玻片；显微观察的实验室设置。" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：琼脂糖载玻片制备示意图。（A） 将一条胶带沿长度方向贴在两张干净的显微载玻片上。如图所示，在带胶带的两张载玻片之间插入一张新的干净载玻片，使三张载玻片沿长度方向并列排列。（B） 将融化的琼脂糖加入中间的载玻片上。（C） 将一张新的显微载玻片垂直放置在中间载玻片的上方，覆盖在琼脂糖液滴上。（D） 让琼脂糖凝固。（E） 移去上方的载玻片，留下凝固的琼脂糖垫。使用带有琼脂糖垫的底部载玻片来封片已解剖并染色的生殖腺组织。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微图像，DAPI 和 dpERK 染色样本，蛋白质定位分析，细胞结构。" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：以拼接方式对载玻片成像。 野生型生殖腺的拼接图像，显示 DAPI（上方）和 dpERK（下方）通道。图像以 63X 倍率拍摄，相邻视野间具有重叠区域，白色方框表示 A 和 B 面板，绿色方框表示 B 和 C 面板。每个面板的 DAPI 和 dpERK 图像均通过两个不同通道同时采集。组装后的图像见图 5A。比例尺：20 μm。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="减数分裂进程；生殖细胞中的dpERK与DNA染色；荧光显微镜观察，fog-2突变研究。" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：ERK的动态时空激活。（A-C）野生型（N2）成虫（发育至L4中期后24小时）雌雄同体生殖腺，经DNA染色（B，DAPI，白色）和dpERK染色（C，红色）。Zone 1（即粗线期区域）和Zone 2（成熟卵细胞区域）中的dpERK信号被突出显示。（D-F）fog-2(oz40) 雌性个体生殖腺（发育至L4中期后8小时）经DNA染色（E，DAPI）和dpERK染色（F）。年轻雌性生殖腺在Zone 1中dpERK信号较弱，并以不依赖精子的方式在单个卵细胞中出现信号；Zone 2依赖精子存在，因此在雌性生殖腺中缺失。比例尺：20 μm。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍一种基于免疫荧光&#160;成像的方法，用于在分离的 C. elegans 性腺中对活性ERK进行时空定位。此处描述的实验方案可适用于 C. elegans 性腺中任何信号或结构蛋白的可视化，前提是具备合适的抗体试剂。

空间与时间上对 C. elegans 生殖系中活性 ERK 的分析

进化上保守的细胞外信号转导 RTK-RAS-ERK 通路是一种重要的激酶信号级联途径，可调控多种……

本实验的总体目标是在体内检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）性腺中活性ERK的水平。该方法有助于解答ERK信号通路与生殖细胞研究领域中的关键问题，例如药物处理或基因扰动对RAS-ERK通路以及由此影响生殖细胞发育的作用。该技术的主要优势在于能够对体内ERK信号的分布模式和强度进行定量分析。挑选100至150条处于所需发育阶段的线虫，收集至含有100 µL M9缓冲液的1.5 mL微量离心管中。随后，向微量离心管中再加入900 µL M9缓冲液，于室温下以1000 × g离心1分钟。在解剖显微镜下，轻柔地移除900 µL的M9缓冲液。然后重复洗涤两到三次，以去除大部分附着的细菌。接下来，使用带有宽口端的200微升移液枪头，将虫体转移至含有100微升M9缓冲液的平底玻璃培养皿中。随后，向培养皿中加入1至3微升0.1摩尔的左旋咪唑（Levamisole），并轻轻旋转混匀。现在，将两支25号针头分别连接到两个注射器上，制成左右手各用的解剖工具。在解剖显微镜下，将每根针分别置于线虫的上方和下方，使用类似剪刀的动作，在靠近第二咽部球的位置对每条线虫进行精细切割。所有个体均需至少切割一次，且全部操作须在五分钟内完成，以确保左旋咪唑（Levamisole）保持有效作用。在培养皿中对动物进行解剖时，必须在五分钟内完成。如果未观察到外翻的性腺，则直接跳过该样本。此处可见正常的外翻性腺。解剖完成后，在通风橱内向玻璃培养皿中直接加入 2 毫升 3% 多聚甲醛，并用封口膜封盖。然后等待 10 分钟。接着，使用 9 英寸玻璃巴斯德吸管向培养皿中加入 3 毫升 PBS-T 溶液，并用吸管混匀。然后，使用一支新的玻璃移液管吸取含有线虫的5毫升液体，并转移至一个新的5毫升玻璃锥形管中。接着，将该管在临床离心机中以1000 g离心30秒。现在，在解剖显微镜下小心移除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀中的组织。然后，用 5 毫升 PBS-T 溶液重复洗涤步骤两次，每次均保留少量溶液于离心管中。接着，使用玻璃移液管加入 2 毫升 100% 甲醇，并用新的巴斯德移液管轻轻吹打组织进行混匀。随后，将离心管置于 -20 °C 下孵育至少 1 小时。甲醇处理后，用 PBS-T 缓冲液洗涤三次，最后保留约 500 微升 PBS-T。现在，使用一支新的巴斯德移液管，将组织转移至一个新的 1 毫升玻璃管中，静置使其自然沉降。5 到 10 分钟后，在显微镜辅助下使用新的移液管尽可能吸除管内洗涤液，注意不要扰动组织。开始封闭步骤时，加入100 µL的30%正常山羊血清（封闭缓冲液）。然后用Parafilm封住管口，在室温下孵育1小时。1小时后，在显微镜下用新的移液枪尽可能吸除全部液体。接下来，将 MAPKYT 抗体用 30% NGS 稀释至 1:400，配制 100 微升，并将其加入组织中。然后，用 Parafilm 封口膜密封管子，在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将管子升温至室温，加入 800 微升 PBS-T。 然后，用一支新的玻璃移液管吸取样品，轻轻吹打以制成均匀的悬液。待组织沉降到管底后，小心吸去上清液，并重复洗涤共三次，每次均使用新的移液管，切勿使用涡旋振荡器。二抗的孵育步骤与一抗相同，唯一需要注意的是从此时起应始终避免光照，直至组织可用于成像。加入二抗孵育后，在最后一次洗涤去除液体后，向组织中加入800微升稀释的DAPI溶液。用封口膜封住管口，在室温下孵育20分钟。随后，在解剖显微镜下，用新的移液枪头尽可能吸除DAPI溶液。除去最后一次染色或洗涤后，向管中加入一滴封片液。现在，准备一个带有琼脂糖垫的封片载玻片。将一滴融化的2%琼脂糖加到干净的玻璃载玻片上，然后迅速将另一张干净的载玻片垂直放置在琼脂糖上并叠加其上。最后，非常轻柔地取下上方的载玻片。接着，将解剖好的样本转移到垫片上，并借助显微镜去除垫片上所有多余的液体。最后，盖上一块 24 × 50 毫米的盖玻片，注意避免产生气泡。盖上盖玻片后，切勿施加额外压力，否则常会导致信号丢失。野生型成年雌雄同体动物的代表性图像显示，双磷酸化活性形式的ERK通常在粗线期中期（Zone 1）以及Zone 2中最成熟的卵母细胞中可见。这种激活模式的改变反映了信号通路的变化。雌性生殖系不会指定生成精子，因此在第2区不显示ERK激活，仅在第1区有微弱激活。一旦掌握，该技术最多需要两天时间，其中第一天耗时最长，约需一小时，若操作得当。在完成此操作后，还可使用其他方法（如RNA荧光原位杂交）来定量分析RNA转录水平等指标，从而补充蛋白质丰度信息。该技术自1995年建立以来，为生殖细胞发育领域的研究人员提供了在体内检测蛋白质丰度水平以及观察秀丽隐杆线虫染色体形态的途径。

spatial-and-temporal-analysis-of-active-erk-in-the-c-elegans-germline

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在Active ERK的时空分析<em&gt;℃。线虫</em&gt;生殖系

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RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。...

一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

一种通过CRISPR/Cas9显微注射流程在Caenorhabditis...

利用CRISPR/Cas9介导的内源性荧光标记技术标记生殖系特异性基因 秀丽隐杆线虫

学习利用免疫荧光成像技术对秀丽隐杆线虫生殖系中的活性ERK进行时空定位分析。该方法可定量检测ERK信号模式与强度，为研究RAS-ERK通路在生殖细胞发育中的作用提供可靠的体内实验手段。

空间与时间上对 C. elegans 生殖系中活性 ERK 的分析

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