在Active ERK的时空分析℃。线虫生殖系

本实验的总体目标是测定秀丽隐杆线虫性腺体内的活性 ERK 水平。这种方法可以帮助回答 ERK 信号传导和生殖细胞领域的关键问题，例如药物治疗或基因扰动对 RAS-ERK 通路的影响，从而对生殖细胞发育的影响。该技术的主要优点是 ERK 信号模式和强度可以在体内量化。

挑选 100 至 150 条处于所需发育阶段的蠕虫，并将它们收集在含有 100 微升 M9 缓冲液的 1.5 毫升微量离心管中。然后，在微量离心管中再加入 900 微升 M9 缓冲液，并在室温下以 1000 次 g 离心 1 分钟。在解剖显微镜下，轻轻去除 900 微升 M9 缓冲液。

然后再重复洗涤两次以去除大部分附着的细菌。接下来，使用带有宽端孔的 200 微升微量移液器吸头，将 100 微升 M9 缓冲液中的蠕虫转移到平底玻璃表皿中。然后，在培养皿中加入 1 至 3 微升 0.1 摩尔左旋咪唑，轻轻旋转。

现在，将两个 25 号针头连接到两个注射器上，为每只手制作一个解剖工具。在解剖显微镜下，将每根针放在每条蠕虫的下方和上方，并使用类似剪刀的动作在第二咽球附近的每条蠕虫上进行精细切割。在五分钟内至少切掉所有动物一次，以使左旋咪唑保持有效。

五分钟内完成对培养皿中动物的解剖非常重要。如果看不到突出的性腺，只需跳过该动物即可。在这里可以看到适当的挤压性腺。

解剖完成后，在通风橱下，将两毫升 3% 多聚甲醛直接加入玻璃表盘中，并用封口膜覆盖。然后，等待 10 分钟。然后，使用 9 英寸玻璃巴斯德移液器，将 3 毫升 PBS-T 添加到手表玻璃中，并使用移液器混合溶液。

然后，使用新的玻璃移液管，吸取含有蠕虫的 5 毫升液体，并将它们转移到新鲜的 5 毫升玻璃锥形管中。然后，在临床离心机中以 1000 g 的离心力将试管离心 30 秒。现在，在解剖显微镜下，去除并丢弃上清液，而不会干扰解剖的组织。

然后，使用 5 毫升等分试样的 PBS-T，再重复洗涤步骤两次，并在少量溶液中完成蠕虫。然后，使用玻璃移液管加入两毫升 100% 甲醇，并用新鲜的巴斯德移液管上下抽动组织，轻轻混合组织。现在，将试管在零下 20 摄氏度下孵育至少 1 小时。

甲醇处理后，进行 3 次 PBS-T 洗涤，并以约 500 微升 PBS-T 结束。现在，使用新鲜的巴斯德移液器，将组织转移到一个新的 1 毫升玻璃管中，并让它们在重力作用下沉降。5 到 10 分钟后，使用新鲜移液器和显微镜的帮助下，在不干扰组织的情况下从试管中去除尽可能多的洗涤液。

要开始阻滞，请添加 100 微升 30% 正常山羊血清，这是封闭缓冲液。然后，用 Parafilm 盖住试管，让它在室温下静置一小时。一小时后，使用显微镜，用新移液器去除尽可能多的液体。

接下来，在 30% NGS 中以 400 分之一的比例稀释 100 微升 MAPKYT 抗体，并将其添加到组织中。然后，用 Parafilm 密封试管并在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将试管加热至室温并加入 800 微升 PBS-T。

然后，将样品吸入新鲜的玻璃移液器中，轻轻释放，使悬浮液均匀。一旦组织沉降到底部，小心地去除上清液并重复洗涤总共 3 次，始终使用新鲜移液器，切勿使用涡旋。二抗的涂抹方式与一抗一样，只是额外考虑了从现在开始将组织保持在黑暗中，直到它们可以成像。

与二抗孵育后，去除最后一次洗涤液后，向组织中加入 800 μL 稀释的 DAPI 溶液。用 Parafilm 盖住管口，并在室温下孵育 20 分钟。稍后，在解剖显微镜下，用新移液器尽可能多地去除 DAPI 溶液。

去除最后的污渍或洗涤液后，向试管中加入一滴封固液。现在，准备带有琼脂糖垫的安装载玻片。将一滴熔化的 2% 琼脂糖加入干净的载玻片中，然后迅速将第二张干净的载玻片垂直于琼脂糖并放在琼脂糖上。

最后，非常轻轻地取下顶部显微镜载玻片。现在，将解剖的动物转移到垫子上，并在显微镜的帮助下从垫子中去除所有多余的液体。最后，涂上 24 x 50 毫米的盖玻片，不要形成气泡。

盖上盖玻片后，不要施加任何额外的压力。这通常会导致信号丢失。野生型成年雌雄同体动物的代表性图像显示，ERK 的二磷酸化活性形式通常在厚膜中区、1 区和 2 区最成熟的卵母细胞中可见。

这种激活模式的扰动反映了信号通路的变化。雌性种系不指定精子，因此在区域 2 中不显示 ERK 的激活，在区域 1 中仅显示微弱的激活。一旦掌握，这项技术最多需要两天时间，如果执行得当，第一天花费的时间最多，只有一个小时。

按照这个程序，除了蛋白质丰度信息外，还可以使用 RNA 鱼等其他方法来量化 RNA 转录水平等内容。在 1995 年开发后，该技术为生殖细胞开发领域的研究人员铺平了道路，以测定体内蛋白质丰度水平并跟踪秀丽隐杆线虫的染色体形态。