使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

本实验的总体目标是通过专为LINC复合物蛋白nesprin-2G设计的生物传感器，利用活细胞中的FRET显微镜技术测定核骨架-细胞骨架连接器（LINC复合物）连接区所受的力学力。该方法有助于解答力传导研究领域中的关键问题，例如作用于活细胞细胞核内蛋白质上的力学力及其在不同条件下的变化规律。该技术的主要优势在于能够精确测量活细胞中蛋白质所受的极微弱作用力。

通常，初次使用该方法的研究人员在图像采集方面会遇到困难。优化显微镜的激光功率和增益，以在所有实验组之间获得良好的信号，这一过程较为复杂。首先，在标准细胞培养箱（具备温度和 CO2 调控功能）中，将 NIH 3T3 成纤维细胞在六孔细胞培养板中培养至 70% 至 90% 汇合度。

在细胞培养超净台中，吸除培养基，并用约1毫升低血清细胞培养基冲洗每个孔。向每个孔中加入800微升低血清细胞培养基，将六孔板放入培养箱中。然后，用移液器吸取700微升低血清细胞培养基加入已标记为L的1.5毫升离心管中，再加入35微升脂质载体溶液，配制成脂质混合液。

用移液器混匀悬浮液。接着，将100微升的低血清细胞培养基分别加入六个已标记为1至6的1.5毫升离心管中。按照文本方案所述，将用于nesprin张力传感器、nesprin无头零力对照、mTFP1和venus的血浆DNA分别加入1至6号管中。

吸取不同类型的DNA时，请勿重复使用移液器吸头。然后，用洁净的移液器将L管中的脂质混合物各100微升加入每个已标记的试管中，并通过反复吹打混匀，每个试管使用新的洁净移液器。将悬浮液孵育10至20分钟。

接下来，从每个标记的离心管中取 200 微升，加入已接种细胞的六孔板各孔中。在每孔上方标记所加入的相应 DNA。然后，将六孔板置于培养箱中孵育 4 至 6 小时。

孵育结束后，吸除培养基，加入一到两毫升低血清细胞培养基进行冲洗。吸除低血清细胞培养基，每孔加入两毫升胰蛋白酶，然后将六孔板放入培养箱中孵育五到十五分钟。在细胞于培养箱中脱附的同时，用浓度为每毫升20微克、溶于磷酸盐缓冲液的纤连蛋白溶液，对六个玻璃底观察培养皿进行包被处理。

在细胞培养罩内让培养皿充分覆盖表面。细胞脱落后，加入两毫升DMEM中和胰蛋白酶。然后，将每孔中的内容物转移至已标记的15毫升离心管中，在摆动转子离心机中以90 × g离心5分钟。

用移液器吸除上清液，并将每份细胞沉淀重悬于 1,000 µL DMEM 中。从玻璃培养皿中吸除纤连蛋白混合液，然后将 1,000 µL 每种细胞悬液移入各培养皿中。待细胞沉降至玻璃培养皿底部后，向每个孔中再加入 1 mL 培养基。

将细胞置于细胞培养箱中孵育至少18至24小时，使其贴壁并表达传感器。为验证转染效率，使用配备激发波长约为462纳米（用于mTFP1）或525纳米（用于venus）的荧光显微镜进行观察。发射滤光片的中心波长应选择约为492纳米（用于mTFP1）或525纳米（用于venus）。

转染完成后约18至24小时，使用倒置荧光显微镜观察转染效率，通过比较视野中荧光细胞数量与细胞总数进行评估。若无法在转染后48小时内对活细胞进行成像，可用4%多聚甲醛固定细胞5分钟。固定前应让细胞表达传感器24至48小时。

将细胞保存在 PBS 中，48 小时后观察。在细胞培养操作台中，用添加了 10% 胎牛血清的成像培养基替换细胞培养基。将观察用培养皿置于温度可控的共聚焦显微镜载物台上。

将转染了 mTFP1 的细胞的玻璃培养皿置于油镜物镜上方，使用 60 倍放大倍数（数值孔径为 1.4）进行观察。在宽场荧光模式下找到表达 mTFP1 的细胞。当视野中出现荧光细胞时，选择光谱检测模式并采集光谱图像。

包含458纳米以上所有波长，以10纳米为增量。在细胞上选择一个明亮的荧光区域。单击“将光谱保存至数据库”，将荧光ROI的平均值作为归一化强度添加到光谱数据库中。

优化激光功率和增益，以获得良好的信噪比。不同设备的设置参数会有所差异。对表达Venus的细胞重复此过程，并保持在光谱模式下。

使用 488 纳米的激发波长，而非 458 纳米。根据需要调整功率设置，但不要更改发射波长。选择一个亮度较高的荧光区域作为感兴趣区域（ROI），半径约为 20 像素。

单击“保存光谱至数据库”，将荧光 ROI 的平均值作为归一化强度添加到光谱数据库中。要获取解混图像，首先将采集模式切换为光谱解混，然后将 Venus 和 mTFP1 的光谱特征添加到解混通道中。

将激发激光器重新设置为458纳米氩离子光源。将nesprin张力传感器观察皿置于60倍油镜物镜上方。聚焦于表达足够明亮荧光的细胞后，调节增益和激光功率以优化信噪比。

使用成像参数相同的设置，对nesprin张力传感器细胞至少采集15至20张亮度相对一致的图像，并避免像素过度饱和。采用相同的成像参数，重复进行nesprin无头细胞的图像采集。此处展示的是通过脂质介导载体将nesprin张力传感器转染至3T3成纤维细胞后获得的代表性10倍放大图像。

通常情况下，在给定视野中只有一小部分细胞被转染。此处展示的是表达nesprin-TS的两个3T3细胞核，在光谱分离后的venus和mTFP通道中的代表性图像。最右侧面板显示了这两个通道的合并彩色图像。

以下是稳定表达 MDCK 细胞在图案化和非图案化基底上，nesprin-TS 掩蔽的细胞核的代表性取样结果。比值图像定义为 venus 通道与 mTFP 通道的比值，可用于进行相对定量的力学比较。一旦掌握该技术，若操作得当，约需八小时即可完成。

在进行该实验操作时，需牢记在转染过程中应仔细标记DNA管，并在采集光谱分辨图像时保持成像参数恒定。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用nesprin张力传感器对细胞进行转染，并采集光谱分辨图像以计算与张力传感器受力相关的FRET指数。尽管本实验中使用的是针对nesprin的FRET传感器，该方法同样可应用于细胞中其他需要测量受力的蛋白质。