Name: 一种利用共振能量转移（FRET）的生物传感器-force议定书衡量所有核LINC复杂的机械力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解利用FRET生物传感器测量活细胞中核LINC复合物机械力的方法。该技术使用Nesprin-2G特异性探针和NIH 3T3成纤维细胞，为研究细胞力学和机械转导过程提供新见解。

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本工作由托马斯·F·和凯特·米勒·杰弗里斯纪念信托基金（资助编号：DEC）和美国国立卫生研究院资助项目 R35GM119617（资助编号：DEC）支持。共聚焦显微镜成像在弗吉尼亚联邦大学纳米材料表征核心（NCC）设施完成。

1. 获取Nesprin-2G传感器DNA及其他质粒DNA
<ol>
	<li>从商业来源获取Nesprin-2G TS（张力传感器）、Nesprin-2G HL（无头型）对照、mTFP1、venus和TSmod。使用标准的大肠杆菌（E. coli）菌株（如DH5-α）扩增所有DNA质粒并进行纯化，具体操作如前所述12,13。</li>
</ol>
2. 用Nesprin-2G及其他质粒DNA转染细胞
<ol>
	<li>在标准细胞培养箱中（温度 37 °C，CO2 浓度 5%），将 NIH 3T3 成纤维细胞培养至 6 孔细胞培养板中细胞融合度达到 70–90%。细胞生长培养基使用添加了 10% 胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	<li>在细胞培养超净台中，吸除培养基，并用约 1 mL 低血清细胞培养基冲洗每个孔。向每孔中加入 800 µL 低血清细胞培养基，然后将 6 孔板放回培养箱中。</li>
	<li>用移液器将 700 µL 低血清细胞培养基加入 1.5 mL 离心管中，再加入 35 µL 脂质载体溶液，配制成 &#34;脂质混合物&#34;。通过反复移液混匀。在管壁上标记 &#34;L.&#34; 以标识。</li>
	<li>准备六个 1.5 mL 离心管，分别标记为 1 至 6 号。向每管中加入 100 µL 低血清细胞培养基。
	<ol>
		<li>根据第 1 步获得的质粒 DNA 浓度，向 1 和 2 号管中各加入 2 µg Nesprin 2G-TS；向 3 和 4 号管中各加入 2 µg Nesprin-HL；向 5 号管中加入 1 µg mTFP；向 6 号管中加入 1 µg mVenus。移取不同类型 DNA 时，不得重复使用同一移液器吸头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从标记为 &#34;L&#34; 的管中吸取 100 µL 脂质混合物，分别加入已标记的 1–6 号管中，通过反复移液混匀。每管使用新的洁净移液器吸头。室温孵育 10–20 分钟。</li>
	<li>将每管中的 200 µL 混合液分别加入 6 孔板中细胞融合度为 70–90% 的对应孔中。在每孔边缘标记所加入的相应 DNA 名称。将 6 孔板放入培养箱中孵育 4–6 小时。</li>
	<li>吸除培养基，加入 1–2 mL 低血清细胞培养基进行冲洗。吸除低血清培养基后，向每孔加入 2 mL 胰蛋白酶，并将 6 孔板放回培养箱中孵育 5–15 分钟。</li>
	<li>在细胞于培养箱中解离的同时，在细胞培养超净台中用浓度为 20 µg/mL 的纤连蛋白磷酸盐缓冲液（PBS）溶液对 6 个玻璃底成像培养皿进行包被处理。静置包被约 20 分钟。</li>
	<li>待细胞完全解离后，加入 2 mL DMEM 以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将每孔中的细胞悬液转移至对应标记的 15 mL 离心管中，在水平转子离心机中以 90 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，用移液器将每管中的细胞沉淀重悬于 1,000 µL DMEM 中。</li>
	<li>吸除玻璃培养皿中的纤连蛋白溶液，用移液器将每种细胞悬液各 1,000 µL 分别加入对应的玻璃底培养皿中。</li>
	<li>待细胞沉降至玻璃底培养皿底部（约 15 分钟）后，向每孔中再加入 1 mL 含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基，并放回细胞培养箱中。让细胞贴壁并表达传感器至少 18–24 小时。 
	注意：本实验使用商业化的阳离子脂质转染试剂进行细胞转染（参见 材料表）。此外，也可通过使用携带毒素抗性基因的质粒构建稳定表达细胞系（例如，Nesprin-TS 和 -HL 的 pcDNA 质粒可在 DNA 共享数据库网站获取（参见 材料表），其携带遗传霉素抗性基因）。对于难以转染的细胞，还可采用病毒转导方法（如慢病毒、逆转录病毒或腺病毒）实现传感器的表达。</li>
	<li>除 Nesprin-TS 外，还需按照步骤 2.1–2.12 所述方法，对其他细胞共转染 Nesprin HL 作为零力对照；TSmod 也可作为零力对照使用，其 FRET 信号应与 Nesprin-HL 相似。</li>
	<li>对细胞共转染 mTFP1 和 venus 以生成光谱指纹图谱（参见步骤 4）。 
	注意：mTFP1 和 venus 的表达水平通常高于 Nesprin-TS，因此可能需要减少转染 DNA 用量，以获得与 Nesprin-TS 相当的表达水平。</li>
</ol>
3. 验证转染效率
<ol>
	<li>转染完成后约 18–24 小时，使用倒置荧光显微镜通过比较视野中荧光细胞数量与总细胞数量来评估转染效率（通常为 5–30%）。
	<ol>
		<li>使用配备激发波长约为 462 nm（mTFP1）或 525 nm（venus）、发射滤光片中心波长约为 492 nm（mTFP1）或 525 nm（venus）的荧光显微镜。 
		注：也可使用 GFP 滤光片组，其可同时捕获 mTFP1 和 venus 的发射信号，从而确认转染效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后 48 小时内对活细胞进行成像。
	<ol>
		<li>或者，用含钙镁的 PBS 配制的 4% 多聚甲醛固定细胞 5 分钟，随后置于 PBS 中保存，并在 48 小时后观察8。 
		注：超过 48 小时后，信号质量和强度会下降。固定细胞可保存其状态，包括所表达的 FRET 信号8；然而，固定后的细胞只能在 PBS 中成像，因为封片介质可能影响 FRET14。固定细胞仅可与其它固定细胞进行比较，因为表达水平可能存在变化。 
		注意：多聚甲醛具有毒性，操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 为光谱解混采集 mTFP1 和 Venus 荧光蛋白的光谱指纹
<ol>
	<li>在细胞培养超净台中，将细胞培养基更换为添加了10%胎牛血清的成像培养基（HEPES缓冲）。</li>
	<li>将观察培养皿置于温度可控（37 °C）的共聚焦显微镜载物台上。</li>
	<li>将转染了mTFP1的细胞的玻璃观察皿置于60倍油镜下，物镜数值孔径为1.4。 
	注意：在激光扫描显微镜的60倍物镜上使用镜油，以使其折射率与玻璃基底接近。镜油应滴加在物镜镜头顶部，并直接接触玻璃盖玻片。</li>
	<li>使用458 nm激发光源和中心波长为500 nm的发射带通滤光片，定位表达mTFP1的细胞。</li>
	<li>当视野中出现荧光细胞时，选择光谱检测模式（本文所用软件中的“&#34;Lambda Mode&#34;”），并采集光谱图像（图3-1）；采集波长范围应覆盖458 nm以上，以10 nm为增量步长（图3-3）。在细胞上选择一个明亮的荧光区域（ROI）（半径为20像素）。 
	注意：表达mTFP1的ROI区域的光谱形状在细胞内应保持相对恒定。若光谱形状变化显著，需重新调整激光强度和增益设置，以提高信噪比。</li>
	<li>通过点击“&#34;save spectra to database.&#34;”将该荧光ROI区域的平均归一化强度添加至光谱数据库中。</li>
	<li>优化激光功率和增益，以获得良好的信噪比。不同设备的设置参数可能有所不同。以未转染的非荧光细胞作为背景参照，逐步提高增益和功率，使细胞荧光明亮，但不超过探测器的动态范围（即避免达到饱和点）。背景细胞在平均信号后应无明显可检测的荧光。</li>
	<li>对转染venus的细胞重复上述过程，但需注意以下例外情况：
	<ol>
		<li>定位表达venus的细胞时，确保激发波长为515 nm，且带通滤光片的中心波长接近530 nm。</li>
		<li>在“&#34;Spectral Mode,&#34;”中，使用515 nm激发波长，而非458 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 采集未混合图像
<ol>
	<li>将采集模式切换为 &#34;光谱解混&#34;。</li>
	<li>将venus和mTFP1的光谱特征添加到解混通道中（图3，箭头-2）。</li>
	<li>将激发激光重新设置为458 nm氩离子激光源。</li>
	<li>将Nesprin-TS观察皿置于60倍油镜上方。</li>
	<li>聚焦于一个荧光表达足够明亮的细胞后，调节增益和激光功率以优化信噪比。 
	注意：由于Nesprin-TS的FRET效率接近20%，解混后的venus图像应明显比解混后的mTFP1图像暗。通过迭代确定合适的激光功率和增益设置后，所有后续图像采集均须保持这些参数不变。</li>
	<li>至少采集15–20个亮度相对相近的Nesprin-TS细胞图像，并避免出现过度的像素饱和（图像处理过程中会去除所有饱和像素）。</li>
	<li>使用相同的成像参数，对Nesprin-HL细胞重复上述图像采集过程。</li>
</ol>
6. 图像处理与比率图像分析
<ol>
	<li>使用开源的 ImageJ（FIJI）软件（http://fiji.sc/），通过 BioFormats Reader 打开原生格式图像。</li>
	<li>对图像进行预处理，并根据先前建立的方案15计算比值图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述内容概述了一种对活细胞中核LINC复合物蛋白Nesprin-2G所受机械张力进行活细胞成像的方法及其实验演示。在此项工作之前，已有多种技术被用于对细胞核施加应变并测量其整体材料特性，例如微吸管抽吸法、磁珠细胞计量法和显微激光消融法16,17,18 。然而，直到我们最近的研究之前，尚无研究直接证明拉伸力能够直接传递到活细胞中的LINC复合物蛋白上2。
此前，我们的实验室已证明，Nesprin-2G 的一种修饰版本（称为 mini-Nesprin2G）可被设计用于表达一种名为 TSmod 的 FRET 力探针（图 2C）2。TSmod 此前已被证实可用于在活细胞及多种承重蛋白中动态测量张力3...

近年来，基于基因编码的力敏感FRET传感器已成为测量活细胞中张力的重要工具，有助于揭示机械力如何作用于蛋白质1,2,3,4。利用这些工具，研究人员可借助常规荧光显微镜对活细胞内的细胞内力进行非侵入性成像。这类传感器由一对FRET荧光蛋白（供体和受体荧光蛋白，通常为蓝色供体和黄色受体）通过一段弹性肽连接而成3。与C端或N端标记不同，该传感器被插入蛋白质的内部位点，用于测量跨蛋白质传递的机械力，其功能类似于分子应变仪。当传感器所受机械张力增加时，FRET对之间的距离增大，导致FRET效率降低3。因此，FRET信号与张力呈负相关关系。
这些基于荧光的传感器已针对黏着斑蛋白（vinculin3 和 talin4）、细胞骨架蛋白（α-actinin5）以及细胞间连接蛋白（E-Cadherin6,7、VE-Cadherin8 和 PECAM8）进行开发。在这些生物传感器中，最常用且表征最充分的弹性连接子被称为 TSmod，其由一段重复的 40 个氨基酸序列 (GPGGA)8 构成，该序列源自蜘蛛丝蛋白 flagelliform。研究表明，TSmod 可表现为线性弹性纳米弹簧，对 1 至 5 pN 的拉伸力具有 FRET 响应性3。通过使用不同长度的 flagelliform 序列，可调节 TSmod 的 FRET-力敏感性的动态范围9。除 flagelliform 外，spectrin 重复序列5 和 villin 头结构域肽段（称为 HP35）4 也已被用作类似力生物传感器中 FRET 配对之间的弹性肽段4。最后，最近一项研究显示，TSmod 还可用于检测压缩力10。
我们最近通过将TSmod插入此前开发的截短型Nesprin-2G蛋白（称为mini-Nesprin2G）中，构建了一种用于核质骨架连接蛋白（LINC复合物）Nesprin-2G的力传感器（图2C），该蛋白的功能与内源性Nesprin-2G相似11。LINC复合物包含多种蛋白，从细胞核外延伸至核内，将细胞质骨架与核纤层连接起来。Nesprin-2G是一种结构蛋白，可同时与细胞质中的肌动蛋白骨架以及核周间隙中的SUN蛋白结合。利用我们的生物传感器，我们证实Nesprin-2G在NIH3T3成纤维细胞中受到肌动球蛋白依赖性的张力作用2。这是首次直接测量到作用于核LINC复合物蛋白上的力，该传感器有望成为研究力学信号在力学生物学中对细胞核作用的重要工具。
以下方案详细介绍了如何使用Nesprin-2G张力传感器，包括在哺乳动物细胞中表达Nesprin张力传感器（Nesprin-TS），以及对表达Nesprin-TS的细胞进行FRET图像的采集与分析。本方案采用配备光谱检测器的倒置共聚焦显微镜，详细描述了如何通过光谱分离法和比率型FRET成像来测量敏化发射FRET信号。所得的比率型图像可用于进行相对定量的力学比较。尽管本方案主要聚焦于成纤维细胞中Nesprin-TS的表达，但其方法可轻松适用于其他哺乳动物细胞，包括细胞系和原代细胞。此外，本方案中关于图像采集和FRET分析的部分也可直接推广至其他基于FRET的力生物传感器，这些传感器已被开发用于研究其他蛋白质的力学特性。

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS DNA</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>从 https://www.addgene.org/68127/ 获取</td></tr><tr><td>Nesprin-HL DNA</td><td>Addgene</td><td>68128</td><td>从 https://www.addgene.org/68128/ 获取</td></tr><tr><td>mTFP1 DNA</td><td>Addgene</td><td>54613</td><td>从 https://www.addgene.org/54613/ 获取</td></tr><tr><td>mVenus DNA</td><td>Addgene</td><td>27793</td><td>从 https://www.addgene.org/27793/ 获取</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>从 https://www.addgene.org/26021/ 获取</td></tr><tr><td>感受态细胞</td><td>Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td></tr><tr><td>液体LB培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>10855001</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001</td></tr><tr><td>固体LB细菌培养板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td>SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Biorad</td><td>1702504</td><td>SmartSpec Plus专用比色皿</td></tr><tr><td>DNA提取试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>6孔细胞培养皿</td><td>Falcon-Corning</td><td>353046</td><td>多孔6孔聚苯乙烯培养皿</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）细胞培养液</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>低血清细胞培养液</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>低血清培养基，&quot;OptiMEM&quot;</td></tr><tr><td>脂质载体溶液</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>脂质试剂，&quot;Lipofectamine 2000&quot;</td></tr><tr><td>1.5 mL无菌塑料管</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0.25%胰蛋白酶-EDTA (1x)</td></tr><tr><td>玻璃底显微镜观察皿</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35 mm培养皿，带20 mm底部孔，#1.5玻璃</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>人纤连蛋白，血浆来源</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>杜氏磷酸盐缓冲盐水</td></tr><tr><td>15 mL无菌离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>摆动转子离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo electron</td><td>Centra CL2</td><td>摆动转子Thermo Electron 236</td></tr><tr><td>细胞培养生物安全柜</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>温控细胞培养孵育箱</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>倒置LED宽场荧光显微镜</td><td>Life technologies</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>透明HEPES缓冲成像培养基</td><td>Molecular Probes</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>带458 nm和515 nm激光源的温控倒置共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>&amp;nbsp;LSM 710-w/光谱META检测器</td><td></td></tr><tr><td>外延生长培养基</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 förster 共振能量转移（fret）力生物传感器测量细胞核 linc 复合物跨膜机械力的实验方案

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

LINC复合体被认为是从细胞骨架向细胞核传递机械力的关键结构。Nesprin-2G是LINC复合体的一个关键组分，它将肌动蛋白细胞骨架与核周间隙中的膜蛋白（SUN结构域蛋白）连接起来。这些膜蛋白进一步与细胞核内的核纤层蛋白（lamins）相连。最近，研究人员将一种福斯特共振能量转移（FRET）力探针克隆到微型Nesprin-2G中（即Nesprin-TS，张力传感器），并用于在活体NIH3T3成纤维细胞中测量跨越Nesprin-2G的张力。本文描述了在NIH3T3成纤维细胞中利用Nesprin-TS测量LINC复合体力学信号的实验流程。为了从Nesprin-TS中提取FRET信息，本文还概述了如何将原始光谱图像进行光谱解混，以分离出受体和供体荧光通道。使用开源软件ImageJ对图像进行预处理，并转换为比值成像图像。最后，展示了Nesprin-TS的FRET数据，并提供了在不同实验组之间比较数据的策略。

按照上述方案，从DNA文库中获取质粒DNA并将其转化至E. coli细胞中。从LB/氨苄青霉素平板上筛选出表达传感器DNA的E. coli菌落，并在液体LB培养基中进行扩增。载体扩增后，使用标准的商业化DNA提取试剂盒将质粒DNA纯化至TRIS-EDTA缓冲液中。使用分光光度计对纯化的DNA进行定量，使其浓度达到µg/mL的标准浓度（图1A，第1-2天）。
使用 NIH3T3 成纤维细胞，在 6 孔塑料细胞培养皿中将细胞培养至 70-90% 汇合度。为将质粒 DNA 导入 NIH3T3 细胞，采用脂质介导的质粒转染法。使用 commercially available transfection reagent（参见材料表）作为 DNA 的脂质载体。将两份重复的 Nesprin-TS 和 Nesprin-HL 传感器分别转染至 4 个细胞孔中（<str...

近年来，已开发出多种基于FRET的力学生物传感器，能够实现对细胞内力的蛋白质特异性解析。在本方案中，我们演示了如何使用一种针对核骨架-细胞骨架（LINC）复合物蛋白Nesprin-2G的连接区设计的传感器，来测量作用于细胞核LINC复合物上的肌动球蛋白力。

使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

LINC复合体被假定为介导机械力从细胞骨架传递至细胞核的关键结构。

本实验的总体目标是通过专为LINC复合物蛋白nesprin-2G设计的生物传感器，利用活细胞中的FRET显微镜技术测定核骨架-细胞骨架连接器（LINC复合物）连接区所受的力学力。该方法有助于解答力传导研究领域中的关键问题，例如作用于活细胞细胞核内蛋白质上的力学力及其在不同条件下的变化规律。该技术的主要优势在于能够精确测量活细胞中蛋白质所受的极微弱作用力。通常，初次使用该方法的研究人员在图像采集方面会遇到困难。优化显微镜的激光功率和增益，以在所有实验组之间获得良好的信号，这一过程较为复杂。首先，在标准细胞培养箱（具备温度和 CO2 调控功能）中，将 NIH 3T3 成纤维细胞在六孔细胞培养板中培养至 70% 至 90% 汇合度。在细胞培养超净台中，吸除培养基，并用约1毫升低血清细胞培养基冲洗每个孔。向每个孔中加入800微升低血清细胞培养基，将六孔板放入培养箱中。然后，用移液器吸取700微升低血清细胞培养基加入已标记为L的1.5毫升离心管中，再加入35微升脂质载体溶液，配制成脂质混合液。用移液器混匀悬浮液。接着，将100微升的低血清细胞培养基分别加入六个已标记为1至6的1.5毫升离心管中。按照文本方案所述，将用于nesprin张力传感器、nesprin无头零力对照、mTFP1和venus的血浆DNA分别加入1至6号管中。吸取不同类型的DNA时，请勿重复使用移液器吸头。然后，用洁净的移液器将L管中的脂质混合物各100微升加入每个已标记的试管中，并通过反复吹打混匀，每个试管使用新的洁净移液器。将悬浮液孵育10至20分钟。接下来，从每个标记的离心管中取 200 微升，加入已接种细胞的六孔板各孔中。在每孔上方标记所加入的相应 DNA。然后，将六孔板置于培养箱中孵育 4 至 6 小时。孵育结束后，吸除培养基，加入一到两毫升低血清细胞培养基进行冲洗。吸除低血清细胞培养基，每孔加入两毫升胰蛋白酶，然后将六孔板放入培养箱中孵育五到十五分钟。在细胞于培养箱中脱附的同时，用浓度为每毫升20微克、溶于磷酸盐缓冲液的纤连蛋白溶液，对六个玻璃底观察培养皿进行包被处理。在细胞培养罩内让培养皿充分覆盖表面。细胞脱落后，加入两毫升DMEM中和胰蛋白酶。然后，将每孔中的内容物转移至已标记的15毫升离心管中，在摆动转子离心机中以90 × g离心5分钟。用移液器吸除上清液，并将每份细胞沉淀重悬于 1,000 µL DMEM 中。从玻璃培养皿中吸除纤连蛋白混合液，然后将 1,000 µL 每种细胞悬液移入各培养皿中。待细胞沉降至玻璃培养皿底部后，向每个孔中再加入 1 mL 培养基。将细胞置于细胞培养箱中孵育至少18至24小时，使其贴壁并表达传感器。为验证转染效率，使用配备激发波长约为462纳米（用于mTFP1）或525纳米（用于venus）的荧光显微镜进行观察。发射滤光片的中心波长应选择约为492纳米（用于mTFP1）或525纳米（用于venus）。转染完成后约18至24小时，使用倒置荧光显微镜观察转染效率，通过比较视野中荧光细胞数量与细胞总数进行评估。若无法在转染后48小时内对活细胞进行成像，可用4%多聚甲醛固定细胞5分钟。固定前应让细胞表达传感器24至48小时。将细胞保存在 PBS 中，48 小时后观察。在细胞培养操作台中，用添加了 10% 胎牛血清的成像培养基替换细胞培养基。将观察用培养皿置于温度可控的共聚焦显微镜载物台上。将转染了 mTFP1 的细胞的玻璃培养皿置于油镜物镜上方，使用 60 倍放大倍数（数值孔径为 1.4）进行观察。在宽场荧光模式下找到表达 mTFP1 的细胞。当视野中出现荧光细胞时，选择光谱检测模式并采集光谱图像。包含458纳米以上所有波长，以10纳米为增量。在细胞上选择一个明亮的荧光区域。单击“将光谱保存至数据库”，将荧光ROI的平均值作为归一化强度添加到光谱数据库中。优化激光功率和增益，以获得良好的信噪比。不同设备的设置参数会有所差异。对表达Venus的细胞重复此过程，并保持在光谱模式下。使用 488 纳米的激发波长，而非 458 纳米。根据需要调整功率设置，但不要更改发射波长。选择一个亮度较高的荧光区域作为感兴趣区域（ROI），半径约为 20 像素。单击“保存光谱至数据库”，将荧光 ROI 的平均值作为归一化强度添加到光谱数据库中。要获取解混图像，首先将采集模式切换为光谱解混，然后将 Venus 和 mTFP1 的光谱特征添加到解混通道中。将激发激光器重新设置为458纳米氩离子光源。将nesprin张力传感器观察皿置于60倍油镜物镜上方。聚焦于表达足够明亮荧光的细胞后，调节增益和激光功率以优化信噪比。使用成像参数相同的设置，对nesprin张力传感器细胞至少采集15至20张亮度相对一致的图像，并避免像素过度饱和。采用相同的成像参数，重复进行nesprin无头细胞的图像采集。此处展示的是通过脂质介导载体将nesprin张力传感器转染至3T3成纤维细胞后获得的代表性10倍放大图像。通常情况下，在给定视野中只有一小部分细胞被转染。此处展示的是表达nesprin-TS的两个3T3细胞核，在光谱分离后的venus和mTFP通道中的代表性图像。最右侧面板显示了这两个通道的合并彩色图像。以下是稳定表达 MDCK 细胞在图案化和非图案化基底上，nesprin-TS 掩蔽的细胞核的代表性取样结果。比值图像定义为 venus 通道与 mTFP 通道的比值，可用于进行相对定量的力学比较。一旦掌握该技术，若操作得当，约需八小时即可完成。在进行该实验操作时，需牢记在转染过程中应仔细标记DNA管，并在采集光谱分辨图像时保持成像参数恒定。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用nesprin张力传感器对细胞进行转染，并采集光谱分辨图像以计算与张力传感器受力相关的FRET指数。尽管本实验中使用的是针对nesprin的FRET传感器，该方法同样可应用于细胞中其他需要测量受力的蛋白质。

a-protocol-for-using-frster-resonance-energy-transfer-fret-force

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种利用共振能量转移（FRET）的生物传感器-force议定书衡量所有核LINC复杂的机械力

本文中，我们描述了使用磁力镊子以高度可并行的方式在单分子水平上研究力对酶促蛋白水解作用的影响。...

使用磁镊进行多重单分子力促蛋白水解测量

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

纤维素体是用于降解纤维素的多酶复合物。本研究采用基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-based...

利用基于原子力显微镜的单分子力谱研究纤维素体的受体-配体系统

Förster共振能量转移整合生物传感器（FIBS）的校准方法描述 原位 代谢谱分析被介绍。 FIBS...

FIBS 实现的无创代谢谱分析

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。...

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

在本实验方案中，我们描述了一种使用微移液管的方法，可直接对活细胞中的细胞核施加可控的力。该检测方法可用于研究活体贴壁细胞中细胞核的力学特性。...

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

本文介绍了一种针对持续性运动的肌球蛋白-5分子马达进行超快力钳实验的完整方案，该方案可轻松拓展应用于其他类型的持续性分子马达研究。本方案详细描述了从实验装置的搭建、样品制备，到数据采集与分析的全部必要步骤。...

利用超快力钳光谱技术解析行进性肌球蛋白的力-酶特性

该研究详细介绍了FRET定位的方法学，包括标记位点的选择、染料的选用、数据采集以及数据分析。该方法在确定蛋白质体系中的结合位点、构象变化和动态运动方面具有显著效果，若与现有的三维结构信息结合使用，则效果更佳。...

荧光共振能量转移定位：一种阐明全局结构特征的新方法

集成力谱技术（EFS）是一种在生物物理和生物传感领域中用于机械解折叠及实时检测一组生物分子结构的可靠技术。...

通过剪切力进行的集成力谱学

了解利用FRET生物传感器测量活细胞中核LINC复合物机械力的方法。该技术使用Nesprin-2G特异性探针和NIH 3T3成纤维细胞，为研究细胞力学和机械转导过程提供新见解。

使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

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