ACT-PRESTO：用于大体积成像的生物组织透明化与免疫标记方法

本实验的总体目标是获得透明化且完整的组织，并利用免疫标记方法可视化其三维分子信息。该方法有助于回答神经科学和发育生物学领域中的关键问题，例如神经元连接、分子分类以及发育过程中的结构变化。该技术的主要优势在于，无需切片即可对大型样本进行亚细胞水平的清晰分析。

开始此操作时，将固定的器官在4°C下于A4P0水凝胶单体溶液中孵育12至24小时，并轻轻振荡。随后，向一个10毫升的圆底试管中加入5毫升水凝胶单体溶液。然后将小鼠脑组织样本转移至其中，并用Parafilm封住试管口。

接下来，将氮气通入含有水凝胶浸润脑组织样本的液体中，持续吹泡一分钟。迅速并紧密地封闭装有样本的管子。将该管子转移至水浴中孵育两小时。

随后，检查水凝胶的黏度，然后用 0.1 X PBS 短暂清洗聚合后的样品，以去除多余的水凝胶。在此步骤中，将聚合后的样品转移至组织容器中，并将组织容器放入 ETC 室内。

接下来，使用蠕动泵将ETC缓冲液注入ETC室中。设置ETC反应条件并启动装置。一至两毫米厚的脑片可在两小时内完成透明化处理。

整个大脑可在五到六小时内充分透明化。随后，将样品转移至含有45毫升0.1倍浓度PBS的50毫升锥形管中。用0.1倍浓度PBS多次清洗样品，直至短暂振荡试管时不再观察到气泡，以确认十二烷基硫酸钠（SDS）已完全去除。

进行c-PRESTO时，取少量样品转移至1.5毫升离心管中。加入500微升抗体稀释液，其中IV型胶原抗体的稀释比例为1:500，然后在600 × g条件下离心2小时。随后，用0.1 × PBS通过600 × g离心30分钟洗涤染色后的样品。

然后，加入500微升抗体稀释液，稀释倍数为1:500，用于Cy3标记的抗兔二抗，并以600 × g离心两小时。随后，用0.1 × PBS通过600 × g离心30分钟洗涤染色样本。为了对较大组织进行s-PRESTO操作，将样本转移至处于阀门关闭位置的三通阀连接注射器中。

加入5至7毫升抗体稀释液，按1:500的比例稀释IV型胶原抗体。随后，打开阀门，将抗体溶液加入样品中。接下来，在保持阀门打开的状态下，将注射器活塞设置至17毫升位置，以留出足够的空间用于输注回抽操作。

然后，在完成注射器设置后关闭三通阀。将装有样品的注射器放置在注射泵上。将注射泵的条件设置为连续循环模式，输注抽取速率为每分钟十毫升，暂停时间为四分钟。

随后，在室温下使用注射泵运行三至24小时。之后，打开三通阀，用0.1倍浓度的PBS溶液替换原有溶液。使用注射泵，每次用0.1倍浓度的PBS溶液对染色样本清洗一小时，共清洗两次。

然后，用含有Cy3标记的山羊抗兔二抗的抗体稀释液替换PBS，并运行注射泵3至24小时。随后，打开三通阀，用0.1 X PBS替换溶液。成像前，将染色样本置于适量的立方体封片液中，在室温下轻轻振荡孵育1小时。

一小时后，将溶液更换为新鲜的立方体封片溶液，并继续孵育一小时。由于抗体无法通过扩散作用穿透致密组织，PRESTO 免疫标记方法被设计用于主动灌注大分子并递送试剂进入致密组织。使用标准台式离心机施加离心力可显著促进抗体的递送。

使用注射泵施加对流流动也改善了抗体的渗透。对于s-PRESTO，采用注射泵输送抗体。小鼠器官（如肾脏和肝脏）用IV型胶原进行标记。

与传统方法相比，c或s-PRESTO技术经过三小时处理即可显著增强标记深度。在肾脏和肝脏中，PRESTO样本的z轴标记深度可达300至350微米甚至更深，而对照样本的标记深度仅为40至50微米。一旦掌握，若操作得当，这些技术可在一天内完成组织的清晰处理。

在进行该操作时，重要的是要明确记录组织固定、水凝胶单体乳液处理以及电泳组织的时间。在完成该操作后，还可进行免疫标记等其他方法，以回答更多科学问题，例如细胞动态分析以及跨多个器官的神经元网络鉴定。该技术问世后，为医学领域研究人员探索疾病诊断开辟了新的途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何进行水凝胶包埋和组织聚合。请务必注意，操作水凝胶单体溶液可能具有极高危险性，在执行该实验步骤时应始终采取必要的防护措施。