用于研究线性侵袭体形成与活性的二维和三维基质

我们的研究团队致力于细胞与细胞外基质之间相互作用的研究。细胞不仅能够产生细胞外基质成分，也能够降解这些成分。基质的降解可发生在生理过程中，也可发生在病理过程中，例如神经退行性疾病以及肿瘤细胞的侵袭。

在细胞水平上，我们可以观察到由肌动蛋白构成的、参与基质降解的结构，这些结构被称为侵袭性细胞器（invadosomes）。Invadosome 是一个统称，包括正常细胞中的足体（podosomes）和癌细胞中的侵袭伪足（invadopodia）。

这种侵袭体的降解可自组织形成不同的形态，如点状、聚集体和玫瑰花环状结构。该侵袭体的活性由基质金属蛋白酶驱动，例如 MMP2 和 MT1-MMP。MMP2 与 MT1-MMP 这对蛋白酶被 I 型胶原纤维激活的过程并不持久。

为了研究侵袭体的活性，采用了经典的原位明胶酶谱法。但为了研究I型胶原纤维在侵袭体中的作用和影响，我们决定建立一种新的检测方法。为此，我们构建了一种由明胶和I型胶原纤维组成的混合基质。

在本视频的第一部分，Eloide Henriet 将向您展示我们如何制备此类基质。在第二部分，Zakaria Ezzoukhry 将向您展示我们如何测量Ⅰ型胶原纤维对侵袭体形态、形成及活化的影响。在最后一部分，Julie Di Marino 将向您展示我们如何改进三维胶原侵袭实验。

我将向您展示如何制备由明胶和I型胶原纤维组成的混合基质。我将制备两种类型的混合基质：一种用于进行原位荧光明胶酶谱实验，其中包含荧光素标记的明胶和非荧光标记的I型胶原。

另一种方法则允许我们利用非荧光素标记的明胶和标记的胶原原纤维来可视化胶原原纤维。制备明胶基质时，将明胶分成每份20 µL的液滴，滴加在一片石蜡膜上，然后用经高压灭菌的玻璃盖玻片覆盖每个液滴。

室温孵育20分钟，并避光。对于明胶固定，取40 µL 0.5%戊二醛PBS溶液滴加成液滴。用镊子将包被明胶的盖玻片转移至每滴戊二醛溶液上。

室温避光孵育40分钟。取一个多孔细胞培养板，向每孔加入500 µL无菌1×PBS。孵育结束后，将每张盖玻片（明胶面朝上）放入各孔中。

用 1× PBS 将盖玻片洗涤两次，每次五分钟。在此步骤中，盖玻片可直接用于实验，或储存以备后续使用。将每毫升 0.4 mg 的 I 型胶原蛋白加入离心管中。

加入荧光染料，使其终浓度为每毫升10微克。混匀管中溶液，于室温避光孵育5分钟。用1×DPBS稀释至终体积，并将500微升溶液加入多孔板中明胶包被的盖玻片上。

在37摄氏度下孵育4小时以进行胶原蛋白聚合。孵育结束后，去除多余的胶原蛋白。加入细胞，使终体积为500 µL，并在固定前于37摄氏度下孵育细胞。

这类基质可通过其他基质成分进行修饰，例如纤连蛋白、玻璃粘连蛋白或 IV 型胶原蛋白。接下来，我将向您展示如何利用 Tks5（一种侵袭性伪足的标志物）进行免疫荧光实验，并介绍如何在 I 型胶原包被的盖玻片上定量线性侵袭性伪足。结果可以表示为含有线性侵袭性伪足的细胞数量，也可以表示为每个细胞中此类结构的数量。

在 PBS 中加入 500 微升 4% 多聚甲醛，将盖玻片固定 10 分钟。用 1× PBS 洗涤两次，再用含 0.2% Triton X-100 的 1× PBS 处理细胞 10 分钟以进行透化。取一片 Parafilm，在其上分装数滴 50 微升的抗体溶液（溶于含 4% BSA 的 1× PBS 中）。

将每张盖玻片置于一滴液体上，在室温避光条件下孵育40分钟。用1×PBS洗涤盖玻片两次，然后将盖玻片置于二抗、胶原蛋白和Hoechst染料中，避光孵育30分钟。

孵育结束后，用1×PBS洗涤两次，再用蒸馏水洗涤以去除盐分。将盖玻片用聚合型封片剂封固于载玻片上。室温下避光干燥过夜后进行成像。

对于图像分析，使用共聚焦显微镜依次采集肌动蛋白和Tks5的图像。为了定量分析每个细胞中线性侵袭体的大小和数量，使用ImageJ软件及提供的宏。首先在ImageJ中运行宏，然后打开肌动蛋白图像。

随后，打开 Tks5 图像。设置阈值并应用宏。分析结果将显示在两个表格中。

每个细胞中线性侵袭体的数量以及其他信息（例如线性侵袭体在细胞中所占的百分比面积）将显示在汇总表中。每个线性侵袭体的大小将列在结果表中。在完成图像定量分析后，我们可以通过展示每个细胞中结构的数量来呈现结果。

在我的部分，我们采用一种方法来证明三维环境中线性侵袭体的存在。我们制备了仅由I型胶原纤维组成的凝胶，该实验用于评估细胞在I型胶原环境中的侵袭能力。在冰上配制终浓度为2 mg/mL的I型胶原溶液。

加入荧光染料，终浓度为每毫升一微克。混匀溶液，置于冰上避光孵育五分钟。随后加入50微升预冷的10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。

然后加入6.25 µL预冷的1 M氢氧化钠。加入无菌水以获得正确的浓度，并混匀溶液。将Boyden小室小室放入多孔细胞培养板中。

向每个插入物中加入 100 µL 一型胶原溶液。为使胶原凝胶聚合，将培养皿在 37°C 下孵育 1 小时。向每个孔中加入富含血清的细胞培养基，并将插入物置于培养基中。

在胶原凝胶上层的无血清培养基中接种 30,000 个细胞。固定细胞时，向空孔中加入 4% 多聚甲醛溶液。从插入物中移除细胞培养基时，注意不要触碰胶原凝胶。

将插入物放入含有 4% 多聚甲醛溶液的孔中，并在胶原凝胶上方加入额外的 4% 多聚甲醛溶液。室温孵育 30 分钟。固定后，吸除 4% 多聚甲醛溶液，并用 1× PBS 洗涤。

洗涤后，胶原凝胶应变得透明。现在，插入物已准备好进行免疫荧光实验。首先将插入物中的液体吸除。

然后将插入物放入多孔板的新孔中。为了通透细胞，在胶原凝胶上加入含有0.2% Triton X-100的1× PBS溶液，孵育30分钟。弃去插入物中的液体。

用1× PBS洗涤，并在胶原凝胶上加入一抗溶液，避光孵育1小时。移除一抗溶液，用1× PBS洗涤，然后将胶原凝胶与二抗溶液避光孵育1.5小时。用1× PBS洗涤去除二抗溶液。

为准备用于固定的胶原凝胶，使用手术刀切割插入膜。将附着在膜上的胶原凝胶置于玻璃底培养皿中。确保凝胶的顶部与培养皿的底部接触至关重要。

加入封片剂并盖上盖玻片，用于显微镜观察。通过该实验，我们证实了DDR1受体在细胞侵袭I型胶原凝胶过程中的关键作用。该实验还可用于评估药物对细胞侵袭的影响。

在另一项研究中，我们证明了仅添加一种处于其生理构象的细胞外基质新组分（此处为Ⅰ型胶原纤维），即可改变侵袭体的形态、分子组成及其活性。通过本视频中描述的多种检测方法，我们证实了一类新结构的存在，即我们所命名的线性侵袭体。通过构建更复杂且更接近生理状态的基质，我们得以鉴定出参与细胞黏附、迁移和侵袭的新信号通路。