Name: 2D和3D矩阵研究线性侵袭体形成和活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学习利用明胶与I型胶原蛋白构建二维混合基质及三维胶原塞，研究线性侵袭体形成机制与基质降解活性，评估原代细胞与癌细胞系的侵袭能力，为肿瘤侵袭研究提供新见解。

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J.D.M. 获得了法国国家健康与医学研究院（INSERM）/阿基坦大区提供的博士奖学金资助，目前获得美国癌症研究协会（ARC）博士后奖学金以及西奈山医学院蒂施癌症研究所的资助。E.H. 获得了法国高等教育与研究部提供的博士学位资助。Z.E. 获得了法国国家科研署（ANR）提供的博士后奖学金资助。C.M. 由西奈山医学院蒂施癌症研究所资助，J.J.B.C. 由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）资助项目 K22CA196750、TCI 青年科学家癌症研究奖 JJR 基金以及西奈山医学院蒂施癌症研究所资助。本研究获得了法国国家科研署（ANR-13-JJC-JSV1-0005）资助项目的资助。F.S. 获得了“法国抗癌联盟”的资助。V.M. 和 F.S. 获得了“法国抗癌联盟认证研究团队 2016”项目、法国国家癌症研究所（INCA_8036）以及 PLBio2012 项目的资助。

注意：固定之前的所有步骤均须在无菌超净工作台中完成。
1. 二维矩阵
注意：使用二维基质来确定形成侵袭性伪足的细胞百分比以及每个细胞的基质降解面积。
<img alt="细胞培养制备示意图；盖玻片明胶包被过程；逐步操作方法。" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案。用于制备明胶和I型胶原基质的实验流程概要。可单独制备明胶基质，也可制备明胶与I型胶原的混合基质。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>明胶基质 
	注意：荧光明胶基质用于定量分析基质降解，非荧光明胶用于促进I型胶原纤维的黏附。荧光明胶基质 также 可用于足体（podosome）和侵袭伪足（invadopodia）的研究（参见 图1).
	<ol>
		<li>在无菌超净工作台内，将一块聚四氟乙烯膜（20 cm × 15 cm）放置于操作区域，并用70%乙醇消毒。</li>
		<li>等分试样 20 µL 1 mg/mL 明胶液滴呈线状排列，间距约 1 cm；参见 图1 用于液滴的排列组织。</li>
		<li>覆盖每一个 20 µL 直径为12 mm的经高压灭菌的玻璃盖玻片覆盖的明胶液滴</li>
		<li>室温孵育20分钟。如果明胶具有荧光性，需避光保护。</li>
		<li>等分试样 40 µL 在步骤1.1.3中盖玻片排成的直线正下方约1 cm处，沿直线排列0.5%戊二醛的1×磷酸盐缓冲液（PBS）液滴，每个液滴间距约1 cm。 
		警告：戊二醛是一种有毒固定剂。使用时需佩戴手套，避免吸入。</li>
		<li>使用宝石镊子将每张明胶包被的盖玻片转移至戊二醛液滴中。 
		注意：在 Parafilm 上残留少量明胶液滴是正常现象。请勿将此残留物用于其他实验。</li>
		<li>室温孵育40分钟。对于荧光盖玻片，需避光保存。</li>
		<li>取一个24孔细胞培养板，向每孔中加入 500 µL 无菌1×PBS。将盖玻片有明胶的一面朝上放入各孔中。</li>
		<li>用1×PBS洗涤两次，每次5分钟。 
		注意：此步骤中，盖玻片可用于后续实验，或保存于1x PBS中 4 °C非荧光盖玻片可保存一周，荧光盖玻片可保存48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>I型纤维状胶原基质 
	注意：使用纤维状 I 型胶原基质来研究线性侵袭体的形成及其相关的基质降解。通过结合荧光标记的 I 型胶原与非荧光明胶盖玻片，可实现侵袭体标志物与胶原纤维的共定位例如， 远红外通道显示F-actin，红色通道显示胶原蛋白I，绿色通道显示Tks5，Hoechst染料用于细胞核染色）。另一方面，采用非荧光标记的胶原蛋白I与非荧光标记的明胶盖玻片组合，以最大化可染色的侵袭体标记物数量（例如， 远红外通道显示F-actin，红色通道显示cortactin，绿色通道显示Tks5，Hoechst染料用于细胞核染色）。最后，结合使用非荧光标记的I型胶原和荧光标记的明胶盖玻片，以定量分析与明胶相关的降解情况例如， 远红外通道显示F-actin，红色通道显示Tks5，绿色通道显示，Hoechst染料用于细胞核染色（见图1）。Hoechst染料用于细胞核染色，同时可检测支原体污染，此外还定期对所用细胞系进行PCR检测以确认无支原体污染。
	<ol>
		<li>荧光标记的胶原蛋白 I
		<ol>
			<li>使用从大鼠尾腱中提取的市售I型胶原蛋白，溶于0.02 N乙酸中。取出制备所需量的I型胶原蛋白 500 µL 每盖玻片加入终浓度为 0.4 mg/mL 的 I 型胶原溶液。</li>
			<li>加入5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯，终浓度为 10 µg/mL，根据 I 型胶原溶液的终体积计算（n × 500 µL).</li>
			<li>用移液器反复吹打混匀溶液，室温避光孵育5分钟。</li>
			<li>用含钙和镁的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）定容至终体积，直接使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>纤维状胶原 I 盖玻片
		<ol>
			<li>使用在步骤1.1中预先制备的非荧光或荧光明胶盖玻片。</li>
			<li>在含有钙和镁的1× DPBS中配制荧光或非荧光I型胶原蛋白溶液，终浓度为0.4 mg/mL。</li>
			<li>添加 500 µL 每盖玻片加入荧光或非荧光的I型胶原溶液，置于24孔细胞培养板中。</li>
			<li>37 °C孵育4小时 37 °C 用于胶原蛋白 I 的聚合。</li>
			<li>孵育后，通过倾斜培养板并用移液器从孔的侧壁吸除多余的 I 型胶原（不要直接接触盖玻片），以避免损伤基质。 
			注意：该基质不能储存，去除多余的胶原蛋白 I 后应立即接种细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞接种、培养时间及固定
<ol>
	<li>根据细胞类型，使用适当的培养基制备细胞，并将细胞接种至每孔终体积为 500 µL。</li>
	<li>为表征细胞系形成线性侵袭体（linear invadosomes）的能力及其降解基质的能力，将细胞接种于 I 型胶原基质上，分别培养 4 小时、12 小时和 24 小时，以确定线性侵袭体形成的动力学及其相关的基质降解活性。 
	注意：表 1 列出了实验室中已测试的细胞系示例。
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td>细胞系</td>
				<td>每张盖玻片接种细胞数</td>
				<td>用于定量线性侵袭体的细胞与基质接触时间</td>
				<td>用于定量线性侵袭体降解活性的细胞与基质接触时间</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>MDA MB 231</td>
				<td>40,000</td>
				<td>4 h</td>
				<td>12 h</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>HUH7</td>
				<td>40,000</td>
				<td>12 h</td>
				<td>24 h </td>
			</tr>
			<tr>
				<td>HEP 3B</td>
				<td>40,000</td>
				<td>12 h</td>
				<td>24 h </td>
			</tr>
			<tr>
				<td>SNU 398</td>
				<td>40,000</td>
				<td>12 h</td>
				<td>24 h </td>
			</tr>
			<tr>
				<td>NIH 3T3 src</td>
				<td>30,000</td>
				<td>4 h</td>
				<td>12 h</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>A431</td>
				<td>50,000</td>
				<td>6 h</td>
				<td>24 h </td>
			</tr>
			<tr>
				<td>A549</td>
				<td>40,000</td>
				<td>12 h</td>
				<td>24 h </td>
			</tr>
			<tr>
				<td>RAW</td>
				<td>40,000</td>
				<td>12 h</td>
				<td>12 h</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>PAE</td>
				<td>40,000</td>
				<td>12 h</td>
				<td>12 h</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	表 1：细胞接种与孵育时间参考表。 本表列出了用于研究线性侵袭体的部分细胞系，提供了在基质上接种的细胞数量、观察线性侵袭体所需的时间以及观察相关基质降解所需的时间。线性侵袭体寿命较短，为在尽可能多的细胞中观察到线性侵袭体，细胞与 I 型胶原基质的接触时间应较短。另一方面，为能够清晰观察到明胶降解情况，细胞与 I 型胶原基质的接触时间需比上表所列时间更长。</li>
	<li>移除细胞培养基后，加入 500 µL 含 4% 多聚甲醛的 1X PBS 溶液，固定盖玻片 10 分钟。</li>
	<li>用 1X PBS 洗涤两次。</li>
	<li>置于 4 °C 避光保存。</li>
</ol>
3. 免疫荧光
<ol>
	<li>用新鲜配制的溶液对细胞进行透化处理，持续 10 min 含0.2% Triton X-100 的1×PBS溶液。此溶液不可重复使用。</li>
	<li>用1×PBS洗涤盖玻片两次。</li>
	<li>在实验台上放置一块石蜡膜（20 cm × 15 cm）。</li>
	<li>用1×PBS中的4%牛血清白蛋白（BSA）稀释一抗，具体操作如文中所述 材料表.</li>
	<li>等分试样 50 µL 一滴一滴地将一抗溶液以约1厘米的间隔排成一行。</li>
	<li>将每张盖玻片置于液滴上。</li>
	<li>室温避光孵育40分钟。</li>
	<li>孵育结束后，用1×PBS洗涤两次。</li>
	<li>将二抗、鬼笔环肽和 Hoechst 染料用含 4% BSA 的 1x PBS 稀释。</li>
	<li>等分试样 50 µL 在盖玻片第一排下方约1 cm处，以之前相同的方式滴加混合液液滴。</li>
	<li>将每张盖玻片置于液滴上。</li>
	<li>室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>孵育后，用1×PBS洗涤两次。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤一次，以去除盐分。</li>
	<li>使用聚合封片剂将盖玻片封固在玻璃载片上。</li>
	<li>将盖玻片在室温下避光干燥过夜，然后进行显微镜观察。</li>
</ol>
4. 定量分析
<img alt="细胞分析；invadosome定量；图像处理示意图；数据结果汇总。" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：线性invadosome的定量分析。该宏需要F-肌动蛋白和Tks5染色的共聚焦图像（格式：1,024 × 1,024）。（A）首先，打开F-肌动蛋白图像并创建掩膜。（B）然后，打开Tks5图像并进行阈值处理，应用该宏。（C）分析结果将显示在两个表格中。每个细胞中线性invadosome的数量以及其他信息（例如线性invadosome在细胞中所占面积百分比）将出现在“汇总”表中，每个线性invadosome的大小将出现在“结果”表中。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>形成线性侵袭足细胞的百分比
	<ol>
		<li>计数形成线性侵袭足的细胞，每张盖玻片约计数100个细胞（使用技术重复三次）。每个n值至少量化300个细胞，n = 3。</li>
		<li>通过三次独立实验的平均值计算形成线性侵袭足的细胞百分比，共量化900个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每个细胞中线性侵袭足的大小和数量 
	注意：使用共聚焦显微镜对F-肌动蛋白和Tks5染色进行连续成像。该宏程序适用于1,024 × 1,024的图像格式。
	<ol>
		<li>使用ImageJ软件及提供的补充宏程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每个细胞的降解面积
	<ol>
		<li>每种条件使用三张盖玻片。</li>
		<li>每张盖玻片采集30张荧光明胶和Hoechst染色细胞核的图像。</li>
		<li>按照Martin KH 等9所述方法使用ImageJ软件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 三维胶原侵袭实验
<img alt="显示Boyden小室的侵袭实验示意图，包括胶原蛋白、癌细胞迁移、固定步骤。" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：侵袭实验示意图。 侵袭实验方案的总结。I型胶原蛋白与琥珀酰亚胺酯染料交联，并在37 °C下聚合1小时。将细胞接种于无血清培养基中，置于I型胶原蛋白凝胶上方。将插入物放入含10% FBS的培养基中。在对照条件下，于细胞接种后1小时固定I型胶原蛋白凝胶；在实验条件下，于细胞接种后3天固定，以测定细胞的侵袭能力。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>制备 I 型胶原蛋白凝胶
	<ol>
		<li>首次实验时设置 4 小时、12 小时、24 小时、48 小时和 72 小时的时间点，以根据细胞类型确定细胞侵袭进入凝胶的动力学。每次实验均需增加 1 小时时间点作为参考，此时无细胞侵袭发生。</li>
		<li>在冰上、无菌超净工作台中制备 I 型胶原蛋白溶液。每 3 个 Boyden 小室插件准备 500 µL 溶液。</li>
		<li>吸取 1 mg 商品化大鼠尾 I 型胶原蛋白，配制成终浓度为 2 mg/mL 的 I 型胶原蛋白溶液。</li>
		<li>加入 5-羧基罗丹明琥珀酰亚胺酯（5-carboxy x Rhodamine succinimidyl ester），终浓度为 1 µg/mL，按 I 型胶原蛋白溶液的终体积（本例中为 500 µL）计算所需用量。</li>
		<li>充分混匀，在冰上、无菌超净工作台中避光孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 50 µL 冰冷且经过滤的 10X PBS 和 6.25 µL 冰冷的 1 M 氢氧化钠（NaOH）。</li>
		<li>根据公式 443.75 - x µL（x 为所用 I 型胶原蛋白体积）加入无菌水。</li>
		<li>每个 Boyden 小室插件中加入 100 µL 溶液。</li>
		<li>在 37 °C 孵育 1 小时，使胶原蛋白充分聚合。</li>
		<li>在新的孔板中加入含胎牛血清（FBS）的细胞培养基，并将插件放入这些孔中。</li>
		<li>在无 FBS 培养基中，将 30,000 个细胞接种至 I 型胶原蛋白凝胶表面。</li>
		<li>细胞在 37 °C 培养后，用含 1x PBS 的 4% 多聚甲醛固定 I 型胶原蛋白凝胶 30 分钟。</li>
		<li>按步骤 3 进行免疫荧光染色，但以下步骤除外：使用含 0.2% Triton X-100 的 1x PBS 透化 30 分钟（而非 10 分钟）；一抗和二抗孵育时间均为 1.5 小时（而非分别为 40 分钟和 30 分钟）。对 F-肌动蛋白或细胞核进行染色以定位细胞。</li>
		<li>完成免疫荧光染色后，使用手术刀沿插件膜边缘切割，并小心将 I 型胶原蛋白凝胶转移至玻璃底培养皿中。确保凝胶顶部与玻璃接触。保持插件膜附着在 I 型胶原蛋白凝胶底部，以维持凝胶完整性。 
		注：I 型胶原蛋白凝胶在玻璃底培养皿中保持完整。玻璃底部与其周围塑料之间的深度等于凝胶的厚度。</li>
		<li>在 I 型胶原蛋白凝胶上加盖盖玻片，并使用可聚合封片剂封固，防止凝胶干燥。</li>
		<li>使用倒置共聚焦显微镜对 I 型胶原蛋白凝胶成像；凝胶顶部与培养皿的玻璃底部接触。
		<ol>
			<li>从 I 型胶原蛋白凝胶顶部到底部采集 z 轴层扫图像，以观察细胞侵袭情况。通过观察细胞侵入成像视野的深度来确定 z 轴层扫的厚度。使用 40X 油镜，以 512 x 512 分辨率、z 步长 0.25 μm 进行图像采集。 
			注：作为参考，MDA-MB-231 细胞接种后 3 天的平均 z 轴层扫厚度为 30 µm。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

传统上，侵袭性突起（invadosomes）的研究通常在体外（in vitro）进行，且未考虑细胞所处的微环境及其接种基质的影响。目前常用的基质类型包括明胶、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白或高密度纤维状胶原蛋白（HDFC）7,11；然而，这些基质往往不能真实反映细胞在体内所处的微环境，缺乏生理相关性。本文采用了一种新型基质，由明胶与纤维状I型胶原蛋白共同组成。利用I型胶原蛋白纤维，我们发现了一类新型的侵袭性突起，称为线性侵袭性突起（linear invadosomes），其特异性地在具有生理结构的I型胶原蛋白上形成7。通过对I型胶原蛋白进行标记，可观察到线性侵袭性突起沿纤维的分布，并利用Tks5和cortactin等细胞标志物对其形成进行定量分析。借助这种混合基质，我们鉴定出一种新的受体——盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1, DDR1），其参与了线性侵袭性突起的形成过程8。</...

细胞外基质（ECM）的重塑发生在生理和病理过程中，例如血管生成和肿瘤细胞侵袭。在生理条件下，多种细胞类型（主要来源于造血谱系）能够降解细胞外基质成分。例如，巨噬细胞能够穿越解剖屏障以到达组织，而破骨细胞则通过降解骨基质来维持钙稳态。更广泛地说，机体中所有基质都会不断更新，以维持其物理和化学特性。在肿瘤组织中，肿瘤微环境的组成发生改变。例如，在乳腺癌和肺癌中，I型胶原蛋白过度表达并在肿瘤周围积聚。此外，这种积聚与转移风险增加相关1,2。癌症转移依赖于肿瘤细胞降解细胞外基质并侵入邻近组织的能力。
细胞的侵袭活性归因于富含肌动蛋白的特化结构，称为侵袭性突起（invadosomes）。该术语包括分别存在于正常细胞和癌细胞中的足体（podosomes）和侵袭伪足（invadopodia）。例如， 巨噬细胞、内皮细胞以及癌细胞（例如 MDA-MB-231 乳腺癌细胞系）。 体外，侵袭体可组织形成不同的形态：点状、聚集体或玫瑰花结状3经典上，侵袭体由一个含多种蛋白质的F-actin核心构成，例如支架蛋白Tks5和皮层肌动蛋白（cortactin），其周围环绕着黏附斑分子，如整合素（integrins）和纽蛋白（vinculin）。4最近研究表明，Tks5 和 RhoGTPase Cdc42 可作为功能性侵袭体的最小分子标志5这些结构能够通过募集并激活特定的金属蛋白酶蛋白（如MT1-MMP和MMP-2）来降解细胞外基质（ECM）6在之前的一项研究中，我们报道了I型胶原原纤维与其特异性受体——盘状结构域受体1（DDR1）之间的相互作用，可导致一类新型侵袭体的形成，这类侵袭体被命名为线性侵袭体。线性侵袭体沿I型胶原原纤维形成7这些结构能够通过募集并激活MT1-MMP/MMP2来降解I型胶原纤维。此外，其形成依赖于Tks5和Cdc42。5. 体外我们证实了线性侵袭体的存在，并揭示了DDR1在其形成与活性中的作用8 采用不同的策略，这些策略包含多种基质成分的组合，包括：i) 荧光标记明胶包被的盖玻片，ii) 荧光标记I型胶原纤维包被的盖玻片，以及iii) 三维I型胶原凝胶塞。由于使用了不同的基质，我们能够研究并表征线性侵袭体的形成及其降解活性。7,8.
最后，为了更好地理解侵袭性细胞的生物学特性，采用了二维和三维培养系统中细胞外基质（ECM）成分的组合，以模拟肿瘤微环境组成的复杂性。以下是用于在二维和三维培养系统中用明胶/Ⅰ型胶原蛋白包被盖玻片的实验方案。

<table><tbody><tr><td>明胶溶液</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>储存液为 20 mg/ml，使用浓度为 1 mg/ml</td></tr><tr><td>猪皮来源明胶 Oregon Green 488 标记物</td><td>Molecular probe life technologies</td><td>G13186</td><td>5 mg 溶于无菌水中，配制成 1 mg/ml</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Marlenfeld GmbH &amp; Co</td><td>111520</td><td>&amp;Oslash;12 mm，No.1</td></tr><tr><td>0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中含 2.5% 戊二醛</td><td>Electron microscopy science</td><td>15960</td><td>用无菌水稀释至 0.5%</td></tr><tr><td>1× PBS，pH 7.4</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10010-015</td><td>所有固定前步骤均使用此 PBS</td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 I 型</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯</td><td>Life technologies</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>含钙和镁的 1× DPBS</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛溶液</td><td>Electron microscopy science</td><td>15710</td><td>用 1× PBS 稀释至 4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10× PBS 缓冲液，pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>用水稀释至 1×，用于固定后的各步骤</td></tr><tr><td>Tks5 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>侵袭体标志物，稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>Cortactin 4F11 抗体</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>侵袭体标志物，稀释比例：1/100</td></tr><tr><td>DDR1 抗体</td><td>Cell signaling</td><td>5583</td><td>线性侵袭体受体</td></tr><tr><td>稀释比例：1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>丝状肌动蛋白标志物，稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>细胞核标志物，稀释比例：1/200</td></tr><tr><td>FluoProbes 二抗</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H 或 FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>用 1× PBS 稀释至 4%</td></tr><tr><td>Fluoromount G 封片介质</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>Public domain</td><td></td><td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr><tr><td>细胞培养小室</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>孔径 8.0&amp;micro;m，24 孔板</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究线性侵袭体形成与活性的二维和三维基质

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

细胞黏附、迁移和侵袭参与多种生理和病理过程。例如，在转移灶形成过程中，肿瘤细胞必须穿越解剖屏障，侵入并迁移通过周围组织，以到达血管或淋巴管。这一过程需要细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用。在细胞水平上，许多细胞（包括大多数癌细胞）能够形成以F-肌动蛋白为基础的结构——侵袭性突起（invadosomes），其具有降解ECM的能力。侵袭性突起是突出的肌动蛋白结构，可募集并激活基质金属蛋白酶（MMPs）。ECM的分子组成、密度、结构排列和刚度在调控侵袭性突起的形成与激活中起关键作用。体外实验中，明胶降解实验是观察和定量侵袭性突起降解活性的标准方法。然而，明胶是变性的I型胶原，并非生理性的基质成分。一种新型的利用I型胶原纤维的实验方法已被开发并用于证明：这种生理性基质是诱导侵袭性突起形成的强效因子。沿胶原纤维形成的侵袭性突起因其在线性纤维上的排列方式而被称为线性侵袭性突起（linear invadosomes）。此外，对线性侵袭性突起的分子分析表明，盘状结构域受体1（discoidin domain receptor 1, DDR1）是介导其形成的受体。这些数据明确表明，使用具有生理相关性的基质对于理解细胞与ECM之间复杂相互作用的重要性。

通过结合使用两种基质——明胶和I型胶原蛋白（图1 和 图4），我们揭示了一种新型的侵袭性结构，称为线性侵袭体。对这些基质进行标记后，可观察到线性侵袭体沿I型胶原纤维的形成及其降解能力（图5）。随后可通过前述宏程序（步骤4.2）对侵袭性结构的数量进行定量分析，同时也可以使用ImageJ软件测定其降解活性，方法如Martin et al. 和 Diaz et al.9,10. 所述。这种混合基质有助于鉴定DDR1为线性侵袭体形成与功能所必需的受体，从而实现对线性侵袭体的特征表征（图6）。
为了理解细胞的侵袭能力，我们还开发了一种三维I型胶原塞检测法（...

本方案描述了如何制备由明胶和I型胶原组成的二维混合基质，以及I型胶原的三维凝胶栓，用于研究线性侵袭体。这些方案可用于研究线性侵袭体的形成、基质降解活性，以及原代细胞和癌细胞系的侵袭能力。

细胞黏附、迁移和侵袭参与多种生理和病理过程。例如，在转移灶形成过程中，肿瘤……

我们的研究团队致力于细胞与细胞外基质之间相互作用的研究。细胞不仅能够产生细胞外基质成分，也能够降解这些成分。基质的降解可发生在生理过程中，也可发生在病理过程中，例如神经退行性疾病以及肿瘤细胞的侵袭。在细胞水平上，我们可以观察到由肌动蛋白构成的、参与基质降解的结构，这些结构被称为侵袭性细胞器（invadosomes）。Invadosome 是一个统称，包括正常细胞中的足体（podosomes）和癌细胞中的侵袭伪足（invadopodia）。这种侵袭体的降解可自组织形成不同的形态，如点状、聚集体和玫瑰花环状结构。该侵袭体的活性由基质金属蛋白酶驱动，例如 MMP2 和 MT1-MMP。MMP2 与 MT1-MMP 这对蛋白酶被 I 型胶原纤维激活的过程并不持久。为了研究侵袭体的活性，采用了经典的原位明胶酶谱法。但为了研究I型胶原纤维在侵袭体中的作用和影响，我们决定建立一种新的检测方法。为此，我们构建了一种由明胶和I型胶原纤维组成的混合基质。在本视频的第一部分，Eloide Henriet 将向您展示我们如何制备此类基质。在第二部分，Zakaria Ezzoukhry 将向您展示我们如何测量Ⅰ型胶原纤维对侵袭体形态、形成及活化的影响。在最后一部分，Julie Di Marino 将向您展示我们如何改进三维胶原侵袭实验。我将向您展示如何制备由明胶和I型胶原纤维组成的混合基质。我将制备两种类型的混合基质：一种用于进行原位荧光明胶酶谱实验，其中包含荧光素标记的明胶和非荧光标记的I型胶原。另一种方法则允许我们利用非荧光素标记的明胶和标记的胶原原纤维来可视化胶原原纤维。制备明胶基质时，将明胶分成每份20 µL的液滴，滴加在一片石蜡膜上，然后用经高压灭菌的玻璃盖玻片覆盖每个液滴。室温孵育20分钟，并避光。对于明胶固定，取40 µL 0.5%戊二醛PBS溶液滴加成液滴。用镊子将包被明胶的盖玻片转移至每滴戊二醛溶液上。室温避光孵育40分钟。取一个多孔细胞培养板，向每孔加入500 µL无菌1×PBS。孵育结束后，将每张盖玻片（明胶面朝上）放入各孔中。用 1× PBS 将盖玻片洗涤两次，每次五分钟。在此步骤中，盖玻片可直接用于实验，或储存以备后续使用。将每毫升 0.4 mg 的 I 型胶原蛋白加入离心管中。加入荧光染料，使其终浓度为每毫升10微克。混匀管中溶液，于室温避光孵育5分钟。用1×DPBS稀释至终体积，并将500微升溶液加入多孔板中明胶包被的盖玻片上。在37摄氏度下孵育4小时以进行胶原蛋白聚合。孵育结束后，去除多余的胶原蛋白。加入细胞，使终体积为500 µL，并在固定前于37摄氏度下孵育细胞。这类基质可通过其他基质成分进行修饰，例如纤连蛋白、玻璃粘连蛋白或 IV 型胶原蛋白。接下来，我将向您展示如何利用 Tks5（一种侵袭性伪足的标志物）进行免疫荧光实验，并介绍如何在 I 型胶原包被的盖玻片上定量线性侵袭性伪足。结果可以表示为含有线性侵袭性伪足的细胞数量，也可以表示为每个细胞中此类结构的数量。在 PBS 中加入 500 微升 4% 多聚甲醛，将盖玻片固定 10 分钟。用 1× PBS 洗涤两次，再用含 0.2% Triton X-100 的 1× PBS 处理细胞 10 分钟以进行透化。取一片 Parafilm，在其上分装数滴 50 微升的抗体溶液（溶于含 4% BSA 的 1× PBS 中）。将每张盖玻片置于一滴液体上，在室温避光条件下孵育40分钟。用1×PBS洗涤盖玻片两次，然后将盖玻片置于二抗、胶原蛋白和Hoechst染料中，避光孵育30分钟。孵育结束后，用1×PBS洗涤两次，再用蒸馏水洗涤以去除盐分。将盖玻片用聚合型封片剂封固于载玻片上。室温下避光干燥过夜后进行成像。对于图像分析，使用共聚焦显微镜依次采集肌动蛋白和Tks5的图像。为了定量分析每个细胞中线性侵袭体的大小和数量，使用ImageJ软件及提供的宏。首先在ImageJ中运行宏，然后打开肌动蛋白图像。随后，打开 Tks5 图像。设置阈值并应用宏。分析结果将显示在两个表格中。每个细胞中线性侵袭体的数量以及其他信息（例如线性侵袭体在细胞中所占的百分比面积）将显示在汇总表中。每个线性侵袭体的大小将列在结果表中。在完成图像定量分析后，我们可以通过展示每个细胞中结构的数量来呈现结果。在我的部分，我们采用一种方法来证明三维环境中线性侵袭体的存在。我们制备了仅由I型胶原纤维组成的凝胶，该实验用于评估细胞在I型胶原环境中的侵袭能力。在冰上配制终浓度为2 mg/mL的I型胶原溶液。加入荧光染料，终浓度为每毫升一微克。混匀溶液，置于冰上避光孵育五分钟。随后加入50微升预冷的10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。然后加入6.25 µL预冷的1 M氢氧化钠。加入无菌水以获得正确的浓度，并混匀溶液。将Boyden小室小室放入多孔细胞培养板中。向每个插入物中加入 100 µL 一型胶原溶液。为使胶原凝胶聚合，将培养皿在 37°C 下孵育 1 小时。向每个孔中加入富含血清的细胞培养基，并将插入物置于培养基中。在胶原凝胶上层的无血清培养基中接种 30,000 个细胞。固定细胞时，向空孔中加入 4% 多聚甲醛溶液。从插入物中移除细胞培养基时，注意不要触碰胶原凝胶。将插入物放入含有 4% 多聚甲醛溶液的孔中，并在胶原凝胶上方加入额外的 4% 多聚甲醛溶液。室温孵育 30 分钟。固定后，吸除 4% 多聚甲醛溶液，并用 1× PBS 洗涤。洗涤后，胶原凝胶应变得透明。现在，插入物已准备好进行免疫荧光实验。首先将插入物中的液体吸除。然后将插入物放入多孔板的新孔中。为了通透细胞，在胶原凝胶上加入含有0.2% Triton X-100的1× PBS溶液，孵育30分钟。弃去插入物中的液体。用1× PBS洗涤，并在胶原凝胶上加入一抗溶液，避光孵育1小时。移除一抗溶液，用1× PBS洗涤，然后将胶原凝胶与二抗溶液避光孵育1.5小时。用1× PBS洗涤去除二抗溶液。为准备用于固定的胶原凝胶，使用手术刀切割插入膜。将附着在膜上的胶原凝胶置于玻璃底培养皿中。确保凝胶的顶部与培养皿的底部接触至关重要。加入封片剂并盖上盖玻片，用于显微镜观察。通过该实验，我们证实了DDR1受体在细胞侵袭I型胶原凝胶过程中的关键作用。该实验还可用于评估药物对细胞侵袭的影响。在另一项研究中，我们证明了仅添加一种处于其生理构象的细胞外基质新组分（此处为Ⅰ型胶原纤维），即可改变侵袭体的形态、分子组成及其活性。通过本视频中描述的多种检测方法，我们证实了一类新结构的存在，即我们所命名的线性侵袭体。通过构建更复杂且更接近生理状态的基质，我们得以鉴定出参与细胞黏附、迁移和侵袭的新信号通路。

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生物工程

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用于研究线性侵袭体形成与活性的二维和三维基质

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