一种优化的分析淋巴细胞糖酵解和线粒体呼吸的实验方案

本实验的总体目标是利用细胞外通量分析法准确测量淋巴细胞的糖酵解和线粒体呼吸。该方法有助于解答免疫代谢领域中的关键问题，例如免疫细胞在活化、分化或疾病过程中会发生哪些代谢变化。该技术的主要优势在于能够同时对超过90个样本的代谢特征进行高效且实时的分析。

尽管该方法可用于研究淋巴细胞的代谢，但也同样适用于其他细胞，包括那些需要添加培养板且对功能干扰最小的非贴壁细胞。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为淋巴细胞较为脆弱，需要轻柔操作以维持其功能和活力。实验前一天，取出细胞外通量分析仪的传感器微板，向校准板的每个孔中加入 200 µL 校准液。

接下来，将 cartridge 放入培养板中，使传感器浸入校准液，并在 37 摄氏度、无二氧化碳和氮气的培养箱中孵育过夜。次日早晨，用 25 µL 黏附溶液包被 96 孔检测板的每个孔，并在室温下孵育 20 分钟。孵育结束后，吸去黏附溶液，并用 200 µL 无菌水洗涤每个孔两次。

在培养板晾干的同时，将70微米细胞筛置于50毫升锥形管上，并将收获的器官转移至筛网上。使用无菌3毫升注射器的推杆将组织研磨过筛，在整个研磨过程中根据需要添加MS缓冲液，以保持滤膜和器官湿润。接着，用5至10毫升MS缓冲液冲洗细胞筛，然后离心所得的细胞悬液。

将沉淀重悬于5 mL ACK红细胞裂解缓冲液中。冰上孵育5分钟后，加入10至20 mL MS缓冲液以恢复体系体积，并再次离心细胞。离心结束后，将一个30微米细胞筛网置于15 mL锥形管上，并用1 mL MS缓冲液预湿筛网。

将细胞重悬于 5 mL 新鲜 MS 缓冲液中，通过滤网过滤细胞悬液，以去除裂解的红细胞聚集体。加入 4 mL 新鲜 MS 缓冲液冲洗空的裂解管，并将洗涤液通过滤网过滤。计数细胞，并分装适量数量的脾细胞用于胞外通量分析。

然后将两组细胞分别离心收集沉淀，将脾细胞样品用5毫升预冷的RF 10培养基重悬，置于冰上用于胞外通量分析。将用于磁珠分离的细胞分别用适当体积的生物素化抗体混合液、抗生物素磁珠和MS缓冲液重悬，在2至8摄氏度下按照指定时间进行孵育。第二次孵育结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀用每1×10⁸个细胞500微升的新鲜MS缓冲液重悬。

接下来，将合适的分选柱安装到分离磁铁上，并用3 mL MS缓冲液预洗分选柱，弃去流出液。在分选柱下方放置一个无菌的15 mL锥形管，将全部细胞样品体积上样至分选柱中。然后用3 mL新鲜MS缓冲液冲洗细胞孵育管，并将洗涤液收集至该锥形管中。

收集完最后一次洗脱液后，用MS缓冲液将管内液体补至终体积15毫升，并对阴性分离的细胞进行离心。然后将沉淀重悬于5毫升预冷的RF10培养基中，置于冰上。细胞分离后不超过3小时，将所有细胞样品离心，并将沉淀重悬于5毫升相应的检测培养基中，进行再次离心。

第二次离心后，用新鲜的检测培养基将沉淀重悬至适当的实验浓度，使每孔细胞终体积为180微升，并向每孔中加入180微升细胞悬液。在37摄氏度孵育细胞25分钟。然后对培养板进行离心，使细胞牢固地贴附于孔底，再将培养板放回孵箱中。

30分钟后，使用微量移液器将新配制的37摄氏度目标化合物加入细胞外通量分析仪传感器微孔板的相应加样孔中，对照背景孔及非实验孔仅加入培养基。将加样后的微孔板放回培养箱中，并设置细胞外通量检测程序。随后将微孔板装入仪器并启动程序，在校准完成后，根据提示将校准板更换为检测板。

在完成细胞外通量分析后，继续进行蛋白质含量测定。所有细胞群体中超过90%具有活性，淋巴细胞的纯度达到98%至99%。每种细胞类型的汇合度与初始接种密度相关。

裂解液蛋白浓度与铺板密度呈线性相关，证实蛋白浓度可用于准确归一化细胞外通量数据。较高的细胞数量与较高的实测氧消耗率相关，并且对线粒体抑制剂的反应更为显著。在T细胞和脾细胞中，较高的铺板密度可得到相似的归一化氧消耗率；而在B细胞中，每孔5 × 10⁵和1.25 × 10⁵个细胞可得到相似的归一化氧消耗率。

线粒体呼吸参数与铺板密度也呈线性相关。此外，较低的质子泄漏表明大部分基础呼吸用于ATP合成。较高的铺板密度会导致较高的细胞外酸化率，以及对线粒体抑制剂产生更强的反应。

糖酵解参数与细胞接种密度呈线性相关，其中高接种密度被确定为进行糖酵解应激实验的最佳条件。葡萄糖可轻微促进线粒体呼吸，该作用可被寡霉素抑制，而2-DG对氧消耗率无显著影响。若操作得当，掌握该技术后可在6至8小时内完成实验。

在进行该实验操作时，重要的是要记住在细胞外通量分析之前将细胞保持在冰上，并准确计数和接种细胞。在完成该操作后，还可采用其他方法，如检测线粒体膜电位和葡萄糖摄取，以进一步探究细胞的代谢状态。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离淋巴细胞以及如何开展细胞外通量分析实验。