Name: 高效抗体标记由应变叠氮推广 - 炔环加成特定站点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习利用应变叠氮-炔环加成技术在抗体片段中位点特异性引入化学探针的方法。该技术通过基因编码叠氮氨基酸实现高效蛋白质标记，为化学生物学和蛋白质工程研究提供重要工具。

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1. 质粒构建
<ol>
	<li>使用传统的定点突变技术，构建一个表达质粒（pBAD-HerFab-L177TAG），用于表达带有 His6-标签的目标抗体基因（pBAD-HerFab-WT），并将亮氨酸-177 的密码子替换为琥珀密码子（TAG）27。 
	参见材料表。</li>
	<li>构建另一个表达质粒（pEVOL-AFRS），其中包含进化后的 tRNATyr 和氨酰-tRNA 合成酶（aaRS）配对的基因。使用专门设计的质粒载体 pEVOL，以实现非天然氨基酸（UAA）的高效插入。详细的质粒信息和克隆方案已在先前的报道中描述28。</li>
	<li>使用 commercially available 质粒提取试剂盒获得高质量的质粒 DNA。纯化后的 DNA 其 260/280 比值约为 1.8 时为最佳。如有需要，可进行 1% 琼脂糖凝胶电泳以检测 DNA 的纯度。</li>
</ol>
2. 培养物制备
<ol>
	<li>电穿孔
	<ol>
		<li>将各1 µL的pEVOL-AFRS28和pBAD-HerFab-L177TAG质粒DNA加入20 µL的大肠杆菌（Escherichia coli）DH10β菌株中，用移液器轻轻混匀。质粒可共同转化或分别进行转化反应。</li>
		<li>使用0.1 cm电穿孔杯时，将电穿孔仪参数设置为25 µF和2.5 kV。</li>
		<li>将电穿孔杯插入电击室的滑槽中，推入滑槽直至电穿孔杯与电击室电极紧密接触。</li>
		<li>按下脉冲按钮进行一次电击，直至电穿孔仪发出蜂鸣声。</li>
		<li>迅速向电穿孔杯中加入1 mL含分解代谢物阻遏的超级优化肉汤（SOC）培养基（含2% (w/v) 胰蛋白胨、0.5% (w/v) 酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2 和20 mM葡萄糖），并将混合液转移至离心管中。在37 °C、振荡条件下培养1小时。</li>
		<li>将转化后的大肠杆菌（E. coli）细胞涂布于含有适当抗生素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上（分别添加35 µg/mL氯霉素和100 µg/mL氨苄青霉素以筛选pEVOL-AFRS和pBAD-HerFab-L177TAG质粒）。于37 °C培养12小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养物制备
	<ol>
		<li>挑取单个转化菌落接种于5 mL含抗生素的LB培养基中，在37 °C、振荡条件下培养12小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. HerFab-L177AF 的表达与纯化
<ol>
	<li>HerFab-L177AF 的表达
	<ol>
		<li>将初级培养物（5 mL）转移至含有氨苄青霉素（100 µg/mL）和 AF（1 mM）的 200 mL LB 培养基中，37 °C 摇床培养。 
		注意：100 mM AF 储存液（10 mL）通过将 206 mg AF 溶解于 100 mM 盐酸（10 mL，终体积）中制备。</li>
		<li>当培养物达到对数生长期（OD550 = 0.8，OD = 光密度）时，加入 2 mL 1.6 M 阿拉伯糖（终浓度 16 mM），30 °C 摇床培养 12 小时。</li>
		<li>在 11,000 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞，弃上清，将沉淀在 -20 °C 冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>将细胞沉淀用 20 mL 周质裂解缓冲液重悬，缓冲液含 30 mM Tris（pH 8.0）、1 mM EDTA、20% 蔗糖和 0.2 mg/mL 溶菌酶，37 °C 孵育 1 小时。</li>
		<li>4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 15 分钟，将上清转移至新离心管中，弃去沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ni-NTA 亲和层析
	<ol>
		<li>向每个离心管中加入 Ni-NTA 树脂悬浮液（每 200 mL 培养物加 400 µL 树脂），4 °C 轻柔混合 1 小时。</li>
		<li>将悬浮液倒入聚丙烯柱中，用 5 mL 洗涤缓冲液（含 50 mM NaH2PO4（pH 8.0）、20 mM 咪唑和 300 mM NaCl）洗涤树脂三次。</li>
		<li>用 300 µL 洗脱缓冲液（含 50 mM NaH2PO4（pH 8.0）、250 mM 咪唑和 300 mM NaCl）洗脱目标抗体。</li>
		<li>通过 Bradford 蛋白测定法29或测定 280 nm 处吸光度确定突变蛋白浓度。使用蛋白消光系数计算器，根据 AF 的消光系数（2,471 M-1cm-1）计算 HerFab-L177AF 在 280 nm 处的消光系数（75,866 M-1cm-1）。 
		注意：HerFab 的氨基酸序列可在 NCBI 网站查询（GI:783282791 和 GI:783282792）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用应变促进的叠氮-炔基环加成反应（SPAAC）将纯化的 HerFab-L177AF 与炔基探针偶联
<ol>
	<li>在含有 10 mM Na2HPO4（pH 7.0）和 100 mM NaCl 的磷酸盐缓冲液中，向 10 µL 浓度为 10 µM 的 HerFab-L177AF 溶液加入 20 µL 浓度为 200 µM 的 H2O 溶液中的 Cy5.5-叠氮二苯并环辛炔（Cy5.5-ADIBO）。 
	注意：作为替代方案，二氟环辛炔（DIFO）和双环[6.1.0]壬炔（BCN）衍生物也可用于相同应用。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 6 小时，使应变促进的环加成反应进行。若使用对光敏感的探针（例如，Cy5.5），需用铝箔包裹反应容器。</li>
	<li>根据步骤 5 纯化标记后的 HerFab。</li>
</ol>
5. 标记 HerFab 的纯化
<ol>
	<li>向离心过滤旋柱中加入 500 µL 样品。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 14,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>弃去滤过液，并将旋柱中纯化的样品转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>作为步骤 5.1–5.3 的替代方法，可通过透析法在相同缓冲液中进行纯化。</li>
	<li>将纯化后的标记 HerFab 在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
6. 标记 HerFab 的 SDS-PAGE 分析
<ol>
	<li>向13 µL纯化的标记HerFab（7.8 µM或0.38 mg/mL）中加入5 µL含有106 mM Tris·HCl、141 mM Tris碱（pH 8.5）、2% LDS、10%甘油、0.51 mM EDTA、0.22 mM SERVA Blue G250和0.175 mM酚红的LDS蛋白上样缓冲液，并在存在（+）或不存在（−）2 µL二硫苏糖醇（DTT，终浓度100 mM）的条件下混合。将混合物在95 °C孵育10分钟。</li>
	<li>将4-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝胶盒安装到电泳槽中并加入电泳缓冲液。上样偶联蛋白样品及预染蛋白分子量标记物。在200 V条件下进行35分钟凝胶电泳。 
	注意：整个电泳过程中应将电泳槽避光保存，以尽量减少荧光染料的光漂白。</li>
	<li>电泳结束后，将凝胶转移至荧光凝胶扫描仪，在适当波长下扫描荧光发射信号。对于Cy5.5，使用扫描仪软件中的Cy5模式。</li>
	<li>使用商用蛋白质染色剂对凝胶进行染色。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).</li>
<li>Wu, X., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+at+the+interface+of+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis at the interface of chemistry and biology.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+the+keto+functional+groupto+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli.</a> proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
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<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Kazane, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+antibody+multimers+through+peptide+nucleic+acid+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).</li>
<li>Ko, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+site-specific+antibody+labeling+by+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cho, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+extracellular+region+of+HER2+alone+and+in+complex+with+the+Herceptin+Fab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab.</a> Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将非天然氨基酸遗传整合到蛋白质中，相较于其他蛋白质修饰方法具有多项优势1-3。其中一项重要优势是其适用于各类蛋白质的普适性。理论上，选择目标蛋白质及其靶向位点并无限制。然而，若将结构或功能关键的残基替换为非天然氨基酸（UAA），可能会影响目标蛋白质的结构与功能。通常选择暴露于溶剂且不与其他残基相互作用的残基进行UAA整合。因此，常利用高分辨率晶体结构提供的结构信息，以确定UAA整合的最佳位点30。由于UAA整合在技术上较为简便，仅需简单的定点突变，因此可快速筛选多个位点，从而为目标蛋白质的特定功能选择最优的残基。
在此方案中，将非天然氨基酸AF通过遗传方式引入抗体片段，并利用SPAAC反应对抗体片段突变体进行位点特异性荧光标记。该方法的偶联产率可达定量水平，且无任何副反应，较此前报道具有重要改进。 25 这是通过仔细的结构分析以选择最佳位点并延长反应时间来实现的。因此，非天然氨基酸（UAA）插入位点的选择对于快速且定量的偶联反应至关重要。此外，使用高效的UAA插入系统（例如pEvol-AFRS）对于...

自从在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现对p-甲氧基苯丙氨酸的遗传编码以来1，已有超过100种非天然氨基酸（UAAs）被成功地整合到各种蛋白质中1-3。在这些非天然氨基酸中，含有生物正交功能基团的氨基酸被广泛研究，且占比最大。这些非天然氨基酸中所使用的生物正交功能基团包括酮基4、叠氮基5、炔基6、环辛炔7、四嗪8、α,β-不饱和酰胺9、降冰片烯10、反式环辛烯11以及双环[6.1.0]壬炔11。尽管每种功能基团各有优缺点，但含叠氮基的氨基酸在蛋白质偶联中应用最为广泛。p-叠氮苯丙氨酸（AF）是含叠氮基的氨基酸之一，易于获得，且其整合效率优异。含有该氨基酸的突变蛋白可通过铜催化的环加成反应与炔烃反应，或通过SPAAC反应与环辛炔反应12-20。
近年来，生物制药在制药行业中备受关注。抗体-药物偶联物（ADC）是一类治疗性抗体，因其能够实现靶向治疗人类癌症而具有显著优势21 和 其他疾病。目前有超过50种抗体药物偶联物（ADC）正处于临床试验阶段，且数量正在迅速增加。在ADC的开发过程中，需考虑多种因素以最大化疗效并最小化副作用。其中，实现抗体与药物之间高效且位点特异的共价连接反应至关重要。通过将非天然氨基酸特异性地引入抗体中，并利用其携带的生物正交功能基团进行偶联反应，可实现所需的高度高效性和特异性。22-26 在此，我们报告一种位点特异性整合的方案 将AF转化为抗体片段，并将突变的抗体片段与生化探针进行偶联。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. 质粒构建&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>质粒 pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>可选择在目标位置包含琥珀终止密码子（TAG）。Ko, W. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 利用张力促进的叠氮-炔烃环加成实现高效且位点特异性的抗体标记。 &lt;em&gt;BKCS.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;36 (9)&lt;/strong&gt;, 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>质粒 pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., 和 Schultz, P. G. 一种增强的非天然氨基酸在 &lt;em&gt;E. coli.&lt;/em&gt; 中的诱变系统。 &lt;em&gt;J. Mol. Biol.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;395 (2)&lt;/strong&gt;, 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>表达宿主</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/包</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. 培养物制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1 电穿孔&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>微型脉冲仪</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>微型脉冲电击杯</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&amp;nbsp;cm 电极间隙，每包50个</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC 培养基</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. HerFab-L177AF 的表达与纯化&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3.1 HerFab-L177AF 的表达&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-叠氮-L-苯丙氨酸（AF）</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-阿拉伯糖，99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>盐酸，35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3.2 细胞裂解&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷，99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物，99.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3.3 Ni-NTA 亲和层析&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ni-NTA 树脂</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>聚丙烯柱</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/包，1 mL 容量</td></tr><tr><td>咪唑，99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠，98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>氯化钠，99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. 利用张力促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）将纯化的 HerFab-L177AF 与炔基探针偶联&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&amp;nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. 标记 HerFab 的纯化&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/包，500 &amp;#956;L 容量</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. 标记 HerFab 的 SDS-PAGE 分析及荧光凝胶扫描&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1,4-二硫代-DL-苏糖醇，DTT，99.5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 上样缓冲液，4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES 电泳缓冲液</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% SDS-PAGE 凝胶</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12孔</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 多功能成像仪</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高效且位点特异的抗体标记通过张力促进的叠氮-炔烃环加成反应

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

目前已有多种化学工具可用于将化学探针引入蛋白质，以研究其结构与功能。一种有效的方法是通过基因引入含生物正交官能团的非天然氨基酸，实现蛋白质偶联。本文报道了一种位点特异性抗体偶联的详细实验方案，内容包括含叠氮基氨基酸的基因整合方法，以及通过应变促进的叠氮-炔环加成反应（SPAAC）进行偶联的实验步骤。该应变促进反应在生理pH和温度下仅需将反应分子简单混合即可进行，无需额外添加如一价铜离子或铜螯合配体等试剂。因此，该方法适用于常规蛋白质偶联及抗体药物偶联物（ADCs）的开发。

本研究中，通过将含叠氮基团的氨基酸引入抗体片段，并使突变后的抗体片段与张力环辛炔发生反应，实现了抗体片段与荧光染料的位点特异性偶联（图1）。选择HerFab作为目标抗体片段，并将含叠氮基团的氨基酸AF引入其中。为确定HerFab中适合被AF取代的残基，分析了HerFab的X射线晶体结构30。所选残基需满足两个关键条件：与抗体结合位点保持足够距离，以尽量减少对其结合亲和力的影响；同时具备溶剂可及性，以确保偶联反应高效进行。第177位的亮氨酸是一个较理想的候选位点，因为该残基充分暴露于抗体外部，且位于两个免疫球蛋白结构域的交界区域，距离抗体结合位点较远。
首先，构建了带有C端His6-标签的HerFab表达质粒，并通过定点突变在第177位引入琥珀密码子，用于非天然氨基酸AF的掺入。在1 mM AF存在下，共表达优化后的tRNATyr和氨酰-tRNA合成酶配对...

本文介绍一种通过基因编码将含叠氮基团的氨基酸引入抗体片段，并利用应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）将该叠氮基团与化学探针特异性偶联，从而在特定位点引入化学探针的实验方案。

目前已有多种化学工具可用于将化学探针引入蛋白质，以研究其结构与功能。一种有效的方法是……

本实验的总体目标是通过基因编码含叠氮基的氨基酸，将化学探针位点特异性地引入抗体片段中。该方法有助于解答化学生物学领域中的关键问题，例如蛋白质修饰、蛋白质工程及偶联等。该技术的主要优势在于，只需通过简单混合，即可将目标探针或培养物位点特异性地引入蛋白质或抗体中。构建质粒后，取每种质粒各一微升，加入到含有 DH10-beta 大肠杆菌菌株的 1.5 毫升离心管中，菌液浓度为每微升 2 × 10⁸ 个细胞，总体积为 20 微升。使用移液器轻轻混匀溶液。然后将 20 微升混合液转移至一个洁净的电转杯中。将电穿孔仪设置为25微法拉和2.5千伏。然后将比色杯插入电击室的滑槽中。推动滑槽进入电击室，直至比色杯与电击室的电极紧密接触。按下脉冲按钮一次，直至电穿孔仪发出蜂鸣声。随后，迅速向比色皿中加入一毫升 SOC 培养基。然后将混合液转移至试管中。在37摄氏度下振荡孵育一小时。转化后的E.Coli细胞在含有适当抗生素的LB琼脂平板上涂布。将平板在37摄氏度下孵育12小时。平板培养完成后，挑取单个转化菌落接种于5毫升含抗生素的LB培养基中。37摄氏度振荡培养12小时。然后将该初级培养物转接至200毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素和1毫摩尔AF的LB培养基中。37摄氏度振荡培养至少3小时。当培养物在 550 纳米处的光密度达到 0.8 时，加入 2 毫升 1.6 摩尔的阿拉伯糖。然后在 30 摄氏度下振荡培养 12 小时。培养结束后，于 11,000 ×g 离心 5 分钟收集细胞。弃去上清液，将沉淀在负20摄氏度下冷冻。准备裂解细胞时，在新的离心管中用20毫升胞浆裂解缓冲液重悬沉淀。将混合物在37摄氏度下孵育1小时。接下来，在 4 摄氏度条件下，以 18,000 × g 离心细胞裂解液 15 分钟。将上清液转移至新离心管中，并弃去沉淀。然后加入 400 µL Ni-NTA 树脂悬浮液。使用旋转仪，在 4 摄氏度下轻轻振荡试管一小时。混合完成后，将悬浮液倒入聚丙烯柱中。用五毫升洗涤缓冲液洗涤树脂三次。用300微升洗脱缓冲液洗脱目标抗体。随后，按照文本方案中所述测定突变蛋白的浓度。首先，取10微升浓度为10微摩尔的HerFab-L177AF溶液（溶于含10毫摩尔磷酸氢二钠和100毫摩尔氯化钠的磷酸盐缓冲液中）加入到一个新的离心管中。然后加入 20 µL 浓度为 200 µM 的 Cy 5.5 叠氮二苯并环辛炔水溶液。之后用铝箔包裹反应容器，于 37 °C 下避光反应 6 小时。反应完成后，向离心过滤柱中加入30微升样品和450微升磷酸盐缓冲液，以洗去游离的Cy 5.5染料。在4摄氏度下，以14,000 ×g离心15分钟。弃去滤过液，然后将纯化后的样品转移至1.5毫升微量离心管中。将纯化的标记HerFab置于4摄氏度保存，直至准备进行分析。首先，向一支新离心管中加入13微升浓度为7.8微摩尔的纯化HerFab。然后加入5微升LDS蛋白质上样缓冲液。将混合物在 95 摄氏度孵育 10 分钟。孵育结束后，将 4 至 12% Bis-Tris SDS-PAGE 凝胶盒连接至电泳槽，并加入电泳缓冲液。接下来，将偶联的蛋白质样品加入预染的分子量标准品中。在200伏电压下进行35分钟凝胶电泳。电泳完成后，将凝胶转移至凝胶成像与分析系统。扫描Cy 5.5，然后用商用蛋白质染色剂对凝胶进行染色。在本研究中，抗体片段Her-Fab通过特定位点与一种分子进行共轭连接。该过程通过在抗体片段中引入含叠氮基的氨基酸，随后使突变型抗体片段与张力环辛炔发生反应而实现。对在有或无含叠氮基氨基酸条件下表达的突变蛋白均进行SDS-PAGE分析。可以看出，只有在存在该氨基酸的情况下才能获得全长抗体片段。含有该氨基酸的抗体通过与连接了Cy 5.5的叠氮二苯并环辛炔衍生物Cy 5.5发生反应，评估其偶联效果，并通过SDS-PAGE进行分析。荧光图像显示突变型抗体片段与Cy 5.5发生了偶联，而在对照组中未观察到偶联现象。在正确表达并用乙酰苯丙氨酸纯化目标蛋白后，可通过应变促进的环加成反应高效地将探针标记到蛋白上。由于该标记反应无需额外试剂，您只需将探针与蛋白混合即可将其引入目标蛋白。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过基因编码含叠氮基团的氨基酸，实现化学探针在抗体片段上的特定位点引入。

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

高效抗体标记由应变叠氮推广 - 炔环加成特定站点

腺病毒颗粒被改造为含有非天然氨基酸类似物叠氮高丝氨酸或叠氮糖O-GlcNAz。通过“点击”化学反应，每种分子中的叠氮基团可发生化学选择性连接，从而实现病毒表面的修饰。...

通过生物正交点击化学实现病毒表面的化学选择性修饰

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

利用DNA或蛋白质甲基转移酶及合成辅因子类似物，可对DNA和蛋白质进行序列特异性的亲和性或荧光报告基团标记。根据酶对辅因子的特异性，可采用氮丙啶或双活化辅因子类似物进行一步或两步标记。...

使用甲基转移酶和辅因子类似物对核酸和蛋白质进行序列特异性标记

光稳定的氰基染料连接到寡核苷酸上，通过能量转移来监测杂交过程。...

利用光稳定性氰基染料合成波长位移DNA杂交探针

本文介绍了一种利用光亲和标记技术鉴定小分子结合蛋白的方法。该技术的优势在于，目标蛋白的结合及共价标记过程均在活细胞环境中进行，从而避免了细胞裂解可能对天然蛋白结构及结合条件造成的破坏。...

通过活细胞光亲和标记在天然细胞环境中鉴定小分子结合蛋白

本文详细描述了一种125I标记叠氮化合物的合成方法，以及利用无铜点击反应对偶联了二苯并环辛炔（DBCO）基团、粒径为13...

一种利用125I标记的叠氮基连接基团高效标记金纳米颗粒的优化方案

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

将赖氨酸的环丙烯衍生物引入抗体，可实现含四嗪分子的位点特异性、快速且高效的连接，从而生成抗体-药物偶联物。...

通过快速生物正交反应遗传编码非天然氨基酸以生成抗体-药物偶联物

在本实验方案中，我们将描述PODS的合成方法。PODS是一种基于苯并恶二唑基甲基砜的试剂，可用于将载荷分子位点选择性地连接到生物分子（尤其是抗体）的巯基上。此外，我们还将描述含PODS的双功能螯合剂的合成与表征，以及其与一种模型抗体的偶联过程。...

合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

学习利用应变叠氮-炔环加成技术在抗体片段中位点特异性引入化学探针的方法。该技术通过基因编码叠氮氨基酸实现高效蛋白质标记，为化学生物学和蛋白质工程研究提供重要工具。

高效且位点特异的抗体标记通过张力促进的叠氮-炔烃环加成反应

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