高效且位点特异的抗体标记通过张力促进的叠氮-炔烃环加成反应

本实验的总体目标是通过基因编码含叠氮基的氨基酸，将化学探针位点特异性地引入抗体片段中。该方法有助于解答化学生物学领域中的关键问题，例如蛋白质修饰、蛋白质工程及偶联等。该技术的主要优势在于，只需通过简单混合，即可将目标探针或培养物位点特异性地引入蛋白质或抗体中。

构建质粒后，取每种质粒各一微升，加入到含有 DH10-beta 大肠杆菌菌株的 1.5 毫升离心管中，菌液浓度为每微升 2 × 10⁸ 个细胞，总体积为 20 微升。使用移液器轻轻混匀溶液。然后将 20 微升混合液转移至一个洁净的电转杯中。

将电穿孔仪设置为25微法拉和2.5千伏。然后将比色杯插入电击室的滑槽中。推动滑槽进入电击室，直至比色杯与电击室的电极紧密接触。

按下脉冲按钮一次，直至电穿孔仪发出蜂鸣声。随后，迅速向比色皿中加入一毫升 SOC 培养基。然后将混合液转移至试管中。

在37摄氏度下振荡孵育一小时。转化后的E.Coli细胞在含有适当抗生素的LB琼脂平板上涂布。将平板在37摄氏度下孵育12小时。

平板培养完成后，挑取单个转化菌落接种于5毫升含抗生素的LB培养基中。37摄氏度振荡培养12小时。然后将该初级培养物转接至200毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素和1毫摩尔AF的LB培养基中。37摄氏度振荡培养至少3小时。

当培养物在 550 纳米处的光密度达到 0.8 时，加入 2 毫升 1.6 摩尔的阿拉伯糖。然后在 30 摄氏度下振荡培养 12 小时。培养结束后，于 11,000 ×g 离心 5 分钟收集细胞。

弃去上清液，将沉淀在负20摄氏度下冷冻。准备裂解细胞时，在新的离心管中用20毫升胞浆裂解缓冲液重悬沉淀。将混合物在37摄氏度下孵育1小时。

接下来，在 4 摄氏度条件下，以 18,000 × g 离心细胞裂解液 15 分钟。将上清液转移至新离心管中，并弃去沉淀。然后加入 400 µL Ni-NTA 树脂悬浮液。

使用旋转仪，在 4 摄氏度下轻轻振荡试管一小时。混合完成后，将悬浮液倒入聚丙烯柱中。用五毫升洗涤缓冲液洗涤树脂三次。

用300微升洗脱缓冲液洗脱目标抗体。随后，按照文本方案中所述测定突变蛋白的浓度。首先，取10微升浓度为10微摩尔的HerFab-L177AF溶液（溶于含10毫摩尔磷酸氢二钠和100毫摩尔氯化钠的磷酸盐缓冲液中）加入到一个新的离心管中。

然后加入 20 µL 浓度为 200 µM 的 Cy 5.5 叠氮二苯并环辛炔水溶液。之后用铝箔包裹反应容器，于 37 °C 下避光反应 6 小时。

反应完成后，向离心过滤柱中加入30微升样品和450微升磷酸盐缓冲液，以洗去游离的Cy 5.5染料。在4摄氏度下，以14,000 ×g离心15分钟。弃去滤过液，然后将纯化后的样品转移至1.5毫升微量离心管中。

将纯化的标记HerFab置于4摄氏度保存，直至准备进行分析。首先，向一支新离心管中加入13微升浓度为7.8微摩尔的纯化HerFab。然后加入5微升LDS蛋白质上样缓冲液。

将混合物在 95 摄氏度孵育 10 分钟。孵育结束后，将 4 至 12% Bis-Tris SDS-PAGE 凝胶盒连接至电泳槽，并加入电泳缓冲液。

接下来，将偶联的蛋白质样品加入预染的分子量标准品中。在200伏电压下进行35分钟凝胶电泳。电泳完成后，将凝胶转移至凝胶成像与分析系统。

扫描Cy 5.5，然后用商用蛋白质染色剂对凝胶进行染色。在本研究中，抗体片段Her-Fab通过特定位点与一种分子进行共轭连接。该过程通过在抗体片段中引入含叠氮基的氨基酸，随后使突变型抗体片段与张力环辛炔发生反应而实现。对在有或无含叠氮基氨基酸条件下表达的突变蛋白均进行SDS-PAGE分析。

可以看出，只有在存在该氨基酸的情况下才能获得全长抗体片段。含有该氨基酸的抗体通过与连接了Cy 5.5的叠氮二苯并环辛炔衍生物Cy 5.5发生反应，评估其偶联效果，并通过SDS-PAGE进行分析。荧光图像显示突变型抗体片段与Cy 5.5发生了偶联，而在对照组中未观察到偶联现象。

在正确表达并用乙酰苯丙氨酸纯化目标蛋白后，可通过应变促进的环加成反应高效地将探针标记到蛋白上。由于该标记反应无需额外试剂，您只需将探针与蛋白混合即可将其引入目标蛋白。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过基因编码含叠氮基团的氨基酸，实现化学探针在抗体片段上的特定位点引入。