Name: 亚纳米级分辨率成像与调幅原子力显微镜在液体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学习使用调幅原子力显微镜在液体环境中实现亚纳米级分辨率成像的方法。该技术适用于各类商业AFM设备，通过优化成像参数帮助研究人员获得高质量的生物材料与晶体样品图像。

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感谢工程与物理科学研究理事会（资助号 1452230 和 EP/M023915/1）、生物技术和生物科学研究所（资助号 BB/M024830/1）以及欧洲理事会（FP7 CIG 631186）提供的经费支持。

1. 工具及其他表面的清洁
注意：在追求高分辨率时，任何形式的污染都可能带来不利影响。因此，必须确保所有用于操作样品、基底或原子力显微镜（AFM）探针的工具均经过彻底清洁。以下规定适用于任何表面或仪器（例如， 镊子）可能接触样品、悬臂、原子力显微镜（AFM）腔室以及样品台本身的任何部件。
<ol>
	<li>将仪器在超纯水（18.2 MΩ， &lt;5 ppm有机物），然后用异丙醇（99.7%纯度）清洗，再用超纯水清洗，每次各10分钟。如有可能，应在通风橱中使用异丙醇，以减少吸入蒸气。</li>
	<li>在氮气流下干燥。</li>
	<li>如果无法实现完全浸入（例如， 使用单层低尘擦拭纸（轻质擦拭纸），依次用超纯水、异丙醇和超纯水润湿后，对悬臂支架/电子元件表面进行物理清洁。清洁后将表面置于空气中自然干燥（通常在15至30分钟内）。</li>
</ol>
2. 底物制备
注意：基底指直接支撑样品的固体表面，通常与原子力显微镜（AFM）扫描头和样品均发生物理接触。大多数原子力显微镜采用磁性底座，可使用钢制圆盘，但本方案同样适用于载玻片等其他基底。此处假设使用固定有云母圆片的钢制圆盘。本操作的目的是尽可能减少可能影响成像结果的外部污染源。操作过程中必须始终佩戴手套。
<ol>
	<li>将钢样圆片依次在超纯水（18.2 MΩ）中浸泡并超声处理10分钟，随后在异丙醇中进行同样处理，最后再次在超纯水中处理10分钟。</li>
	<li>在氮气流下干燥圆片。</li>
	<li>准备少量环氧树脂胶，充分混合试剂后加入约10 µl 在钢盘上。</li>
	<li>将基底（绢云母云母、SiO₂）粘附2 晶体，玻璃 等等。通过在基底上施加压力，将环氧树脂粘合到钢盘上。根据制造商的说明，在较高温度下使环氧树脂固化数小时。</li>
	<li>确保基底边缘周围没有环氧树脂直接暴露在空气中。如果使用过量环氧树脂，就会发生这种情况，并可能成为污染源。
	<ol>
		<li>对于云母基底，将约2.5 cm宽的低粘性胶带紧密按压在基底表面，确保完全覆盖整个表面，然后平行于表面平稳地撕下。撕下后，去除的材料会留在胶带上。重复此过程2–3次，直至云母表面肉眼观察呈镜面光滑。</li>
		<li>对于玻璃/SiO₂2若需要进一步进行化学表面改性，可重复步骤2.1–2.2中的浸渍-超声处理程序。或者，可使用紫外照射装置（18 W UV-C 杀菌灯），根据功率照射30–60分钟，以热解表面可能残留的有机物。该处理还可使表面更具亲水性，同时不会显著增加表面粗糙度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 悬臂和针尖的制备
<ol>
	<li>将悬臂芯片依次浸入异丙醇和超纯水中，每种液体中各浸泡60分钟。</li>
	<li>如果悬臂/探针需要彻底清洁（例如，长期保存于凝胶盒中后），加入丙酮浸泡30分钟（&gt; 99.5% 纯度）后再进行步骤 1（另见关于污染的章节）。根据我们的经验，将吸头存放在凝胶盒中是导致污染的主要来源之一，且污染可能迅速发生59.</li>
	<li>将尖端短暂暴露于紫外光下（&lt;5 分钟），以促进稳定水合位点的形成60避免过长的曝光时间，以免损坏针尖或增加其曲率半径。</li>
	<li>将悬臂插入原子力显微镜的悬臂夹持器中，并用移液器加入约~50 µl 将成像溶液（溶液的性质取决于被测样品，但在此使用超纯水中10 mM的氯化铷溶液）滴加到悬臂和针尖上以预先润湿；这将在接近样品时减少气泡的产生。</li>
</ol>
4. AFM 细胞装置的设置
<ol>
	<li>将样品盘和基底安装到样品台上，并加入一滴成像液体（液体厚度通常在其最高点处为 2-3 mm）。</li>
	<li>将悬臂架连接至原子力显微镜（AFM）。</li>
	<li>使悬臂与样品靠近，以便在悬臂/针尖和样品上的液体之间形成毛细桥。</li>
</ol>
5. 初始化测量与悬臂梁校准
<ol>
	<li>将测量激光（通常为红色）对准悬臂末端附近。根据原子力显微镜（AFM）型号，通过软件控制或手动调节激光位置来完成对准。在液体中获取悬臂的热谱图（见图1A）。该过程利用激光记录悬臂的热波动，以确定悬臂主共振频率（基频本征模式）。在大多数现代原子力显微镜中，此步骤可通过软件控制中的自动化程序完成，但具体操作可能因不同型号的原子力显微镜而异。</li>
</ol>
<img alt="频率与强度关系图及光学偏转图，显示光谱拟合与热谱。" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：悬臂梁的调谐与校准。A：悬臂梁垂直偏转的热噪声谱（黑色），以及其基频本征模的简谐振子（SHO）拟合结果（红色）。此处，悬臂梁在水中的共振频率为 18.7 kHz。前三个与前三个弯曲本征模相对应的共振频率由蓝色箭头标出。B：悬臂梁逆光学杠杆灵敏度（InvOLS）的校准。将悬臂梁压向一个刚性（不可变形）表面，利用其线性偏转来测量以伏特为单位的偏转信号与相应纳米单位偏转值之间的转换因子（InvOLS）。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>在刚性基底上使用悬臂梁记录偏转与距离的曲线（例如，云母或玻璃）并通过设定线性偏转区域中曲线斜率（如 图1B为161-63. 
	注意：此过程用于确定光电探测器上测得的偏转值（单位：伏特）与悬臂实际偏转（单位：纳米）之间的转换系数，即逆光杠杆灵敏度（InvOLS）。校准过程可能会损伤探针，因此建议在完成所有测量后进行。可使用先前实验中同类型悬臂所得的 InvOLS 值进行估算（通常 &gt;校准前，真实振幅的90%准确度。</li>
	<li>使用简谐振子模型对热谱中的共振峰进行拟合64-66 以获得悬臂梁的弹簧常数。该过程在大多数原子力显微镜软件中已实现自动化，通常无需对相关模型具备专门知识。</li>
	<li>调节悬臂梁。找到悬臂梁在外部驱动下的振幅响应。例如， 在接近其标称共振频率的范围内，通过声学或光热激发方式驱动悬臂梁，并记录其响应频谱。将驱动频率设定在该频谱最大响应峰稍偏左侧的位置。若采用声学驱动，调节过程中可能会出现多个虚假的峰值。
	<ol>
		<li>使用原子力显微镜（AFM）的控制软件，选择一个尽可能接近（并位于热谱中识别出的共振峰包络范围内）的共振峰，具体操作可能因控制AFM的软件类型和版本而异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 样本的接近与初步检查
<ol>
	<li>将驱动振幅设定为使自由振荡振幅约为 5 nm。在大多数原子力显微镜上，这通常对应 0.2–0.8 V（若 InvOLS 未校准）。将振幅设定值调节至自由振幅的约 80%。</li>
	<li>将反馈增益设为相对较高水平（具体数值取决于原子力显微镜型号），但需确保不出现任何不稳定或振铃现象。</li>
	<li>将初始扫描速率和扫描尺寸设为较小的值（例如，分别约为1 Hz和10 nm）。这有助于在反馈参数调节不佳时避免探针在大范围内扫描，从而保护探针。随后可将扫描尺寸增大至更大值（例如， 100 nm）（如果扫描条件合适）。</li>
	<li>在接近之前，确定表面的大致高度（在某些情况下必须通过光学方法进行）。</li>
	<li>使用原子力显微镜（AFM）控制软件启动探针向表面的接近过程。该过程的具体细节将取决于所使用的AFM型号及软件。
	<ol>
		<li>若使用软悬臂梁进行逼近时出现问题，可改用接触模式进行逼近。此时，应确保增益低于调幅模式下的增益，并将设定值设为相对较低的数值（在将激光光斑调整至光电探测器中心后，设定为 0.1–0.2 V），以保护探针。</li>
		<li>通过轻微改变设定值（接触模式下增加，AM模式下减小），在未开始成像的情况下判断针尖是否已到达样品表面。若针尖已接触表面，Z轴压电陶瓷的伸缩变化应几乎不受影响。大多数原子力显微镜的控制软件会以图形方式实时显示Z轴压电陶瓷的运动情况。若改变设定值引起压电陶瓷明显移动，则表明发生误接触。在此情况下，应从当前针尖位置重新开始逼近过程，并采用略高（接触模式）或略低（AM模式）的设定值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一旦探针尖端到达表面，收回Z向压电陶瓷（通常只需按“停止”键），并重新调节悬臂（重复步骤5.4）；由于探针与样品之间的相互作用，共振频率可能会向较低值偏移。</li>
	<li>将设定点更改为新调谐自由振幅的大约 80%（在此针尖-样品距离下）。</li>
	<li>启动悬臂并进行10×10 nm扫描2 在AM模式下对表面进行扫描，以确认成像参数是否合适。
	<ol>
		<li>检查正向扫描（从左到右）与反向扫描（从右到左）的曲线是否重合。若不重合，则进一步降低设定值，并尝试提高增益。</li>
		<li>如果图像出现噪声，则降低增益。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复该操作，使用大号 — 1×1 µm2 至5×5 µm2 — 对提供的样品进行扫描时，这种情况是可能发生的。在软质或生物样品上，可能会导致探针尖端污染。</li>
</ol>
7. 高分辨率成像
<ol>
	<li>将扫描尺寸减小至适合观察特征的数值（例如，100×100 nm2 用于蛋白质晶体或 20×20 nm2 用于云母或方解石。</li>
	<li>将悬臂的驱动振幅降低至足以使反馈回路自动收缩Z向压电陶瓷，从而使针尖远离样品表面。当悬臂远离表面时，调节驱动振幅，使悬臂的振幅达到约1–2 nm（峰对峰）。</li>
	<li>使用原子力显微镜控制软件，逐步将设定点每次降低数十毫伏，直至Z压电元件重新向表面延伸并恢复原始图像。将设定点振幅保持在新的自由振幅的75%至95%之间。</li>
	<li>使用原子力显微镜控制软件重新调整增益；在较低振幅下可使用较高增益，而不会引入显著噪声。
	<ol>
		<li>重复步骤 7.2–7.4，以确定实现高分辨率的最佳自由振幅、设定点和增益组合。最佳条件取决于样品（液体的溶剂化特性与润湿性质），也取决于悬臂梁（弹簧常数、刚度）。</li>
		<li>探索不同的振幅组合以优化成像条件。可能需要再次增大自由振幅42. 在这种情况下，首先将设定值调整为较高值，然后增加驱动（即，与降低振幅所用的方法相反。</li>
		<li>将设定振幅保持在 0.5 nm - 1.5 nm（峰对峰）范围内，设定比值保持在 0.7 以上（通常为 0.75 - 0.95）。对于亲液性界面，使用弹簧常数为 0.5 - 2 N/m 的悬臂梁。该参数足以使针尖去除大部分界面液体而不接触表面。参考文献中的公式 4 提出了一个经验法则。29.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

假设成像液体和悬臂梁刚度已适当选择，实现成功高分辨率成像最关键的步骤是成像振幅的调节以及所研究系统的整体清洁度。
振幅与界面液层厚度相当（通常小于2 nm），主要探测界面溶剂性质的变化42如果振荡幅度太大，振动针尖将穿过长程的非线性力场52 导致悬臂运动不稳定，并不可避免地撞击样品，无论成像条件如何29，导致分辨率下降。除了分辨率降低之外，探针运动中开始出现高次谐波，系统建模也变得更加复杂55. 或者，如果成像振幅过小，则仅能探测到界面的一部分（通常为界面液体的特定层），且只有使用刚性较高的悬臂梁才能实现稳定的成像（&gt;10 N/m 在水中53）以获得理想的信噪比，但存在损坏具有较大高度变化的软样品的风险。使用刚性悬臂梁是为了克服热噪声，当振幅较小时，热噪声可能变得比所测信号更为显著。此时，针尖与样品之间的长程相互作用依然存在，但其变化较小且基本恒定，因此不会影响所获图像的高分辨率反差。
成像环境的洁净度对于高分辨率原子力显微镜（AFM）至关重要。系统中的杂质可能干扰成像和力谱测量。实验中常见的污染主要分为两类：（i）成像时可直接观察到的污染物（图4B、4C）；（ii）无法解释的高分辨率缺失。情况（i）通常仅出现在高度理想化的体系中，例如水-云母界面，此时吸附的分子聚集体与原子级平整的云母表面形成明显对比，从而干扰针尖-样品相互作用（图4A）。在更换针尖和样品之前，值得尝试以较大的偏转幅度采集力谱曲线，即反复用力将针尖压向样品表面。这一操作通常会损坏新的针尖，但偶尔可清除污染的针尖，或诱导形成适合成像的稳定水合位点。然而，该针尖不可避免地会变钝，因此即使成像效果有所改善，也仅适用于平坦样品。当怀疑在刚性样品表面存在污染时，可尝试在执行上述具有一定破坏性的操作前，使用悬臂的第二共振模式进行成像。这仅需将驱动频率切换至第二共振模式，并重新调整振幅/设定值（参见下文的故障排除讨论）。当在第二共振模式下工作时，悬臂的有效刚度显著增加，成像过程中针尖可能将弱吸附的污染物推开。该策略并不能替代洁净样品和针尖的必要性，但在针尖或样品明显非理想的情况下，可为获取满意图像提供额外途径。
<img alt="原子力显微镜（AFM）图像、高度分析图、表面形貌评估。" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：在成像云母时观察到的污染示例，这些污染会阻碍高分辨率成像。A：在 5 mM RbCl 中成像的云母——未见污染物颗粒。B：在名义上超纯水中成像时出现的污染物，表现为尺寸达数十纳米的聚集体。C：由推测为两亲性性质的污染物颗粒自组装形成的结构。成像同样在名义上超纯水中进行。D：对应于 A、B 和 C 中虚线的垂直偏移截面，显示了与云母原子级平坦表面的偏差。A、B 和 C 中的比例尺为 300 nm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
情况（ii）更为常见，其主要特征是令人困扰的事实：无论成像条件如何，亚纳米级特征都无法被分辨。这种情况的典型表现通常可在力谱测量中观察到，往往显示出某些不一致性，包括曲线重复性差，以及振幅-距离曲线显著偏离典型的S形曲线42。如果污染物（离子性或其他类型）在液体中均匀分散，它们可能不会在形貌成像中显现，但可能破坏样品的水合结构69，而水合结构对于维持稳定的针尖-样品相互作用29并获得高分辨率至关重要70。污染物还可能对样品产生直接影响，尤其是在较软的生物样品实验中。例如，众所周知，清洗过程中残留的醇类物质可使凝胶相脂双层发生液化71-73，从而导致无法实现亚纳米级分辨率。若无法获得高分辨率，应首先仔细检查清洗流程，特别关注所有与成像溶液接触的设备。即使看似稳定的化合物（如环氧树脂），若未完全固化，也可能在液体中发生一定程度的溶解。
采用调幅原子力显微镜（AM-AFM）进行高分辨率成像具有较高挑战性，需要耐心操作，通常需经过多次尝试才能达到最佳成像条件。微小的实验问题可能显著影响成像质量，从而阻碍高分辨率成像，因此掌握故障排查技能至关重要。以下列出了我们在实践中遇到的一些常见问题及相应的解决方案。
悬臂梁调谐
大多数商用原子力显微镜（AFM）采用声学激发方式驱动悬臂。在这种情况下，如步骤5.4所述，将悬臂调节至其共振频率附近，通常足以满足在空气中操作的性能需求。在液体环境中，液体往往会在AFM的不同机械部件（如悬臂芯片与支架）之间产生一定的耦合作用。这可能会影响悬臂表观的共振特性，通常表现为悬臂频率谱中出现大量尖锐的峰和谷，常被称为“峰林”现象。因此，往往难以确定正确的驱动频率。这类峰也存在于气体环境中，但由于悬臂的品质因数较高，共振时的振幅显著更大74,75。在液体中选择合适的峰来驱动悬臂可能并不容易，常需通过反复试验进行摸索。实践中，尽管不一定恰好处于共振点，但通常选择在共振频率附近的“峰林”中振幅变化最陡峭的峰，这往往是最佳选择，并能提供足够高的分辨率成像所需的驱动频率。
图像畸变
成像漂移在追求高分辨率时常常成为一个问题，会使图像看起来发生畸变（通常表现为拉伸）。其来源通常是热效应所致，要么是因为扫描仪/原子力显微镜尚未达到稳定的运行温度，要么是因为样品中的部分液体正在快速蒸发。例如，醇类中的成像）。在所有情况下，当达到热平衡时，漂移可忽略不计。因此，若条件允许，固定样品温度是有益的。否则，建议在实验前让原子力显微镜对空白样品进行数小时扫描（大范围、低扫描速率）。若蒸发不是问题，此步骤最好在操作程序第6步之后进行，注意先将探针回撤一小段距离（例如, 20 µm）从表面移除。有时，即使经过充分的热平衡，漂移现象仍会持续存在。这通常表明在成像过程中，悬臂或其探针芯片正在部分拖拽样品，这种情况可能发生在较软且具有粘聚性的样品（如薄膜）上，或当针尖/悬臂/芯片未正确放置时。对于集成多个悬臂/针尖的芯片，通常建议将未使用的悬臂折断，以避免其在样品表面拖行。
离子强度
由于成像主要由界面液层主导，因此在水中对带电表面进行高分辨率成像时，有时加入一些盐会有所帮助。盐的作用有两个方面：首先，它能够改变表面在吸附后的水合状态，通常可增强成像对比度；其次，它有助于屏蔽探针与样品之间的强静电相互作用例如， 在云母上的成像）。通常，由于较大的离子（如钾、铷和铯）具有特定的水合性质，因此能够获得更清晰的图像76，以及它们通常主要以一种独特的水合状态吸附的事实77.
探针/针尖损坏
如果怀疑悬臂梁是污染源（参见上述症状描述），应首先在光学显微镜下进行检查。若悬臂梁存放在凝胶盒中，可能会沾染微量凝胶聚合物或硅油59，在极端情况下，这些污染物会以较暗斑点的形式出现在悬臂梁背面（如图5A所示）。光热振荡也可能导致类似斑点的出现，但这类斑点是由于驱动激光使悬臂梁涂层发生降解或过热所致。污染通常在悬臂梁上随机分布。通过异丙醇清洗较长时间（12小时），随后再用超纯水清洗，可去除悬臂梁上的任何不必要颗粒。
<img alt="悬臂梁频率分析；强度与频率关系图，比较新的和旧的悬臂梁。" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：新悬臂梁与在硬表面上频繁使用并在凝胶盒中长期存放的相同悬臂梁之间的比较。A：上图；经清洁处理后的全新悬臂梁的光学图像（参见操作步骤）。下图；显示凝胶盒中残留可见污染（蓝色箭头）的光学图像。 B：两个悬臂梁各自热谱的比较。旧悬臂梁的第一共振峰展宽明显（绿色箭头），部分高阶振动模式增强（蓝色箭头）。为清晰起见，谱图在纵向上进行了偏移，并以双对数坐标显示。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
如果在较低分辨率下图像质量尚可，但未达到所需的亚纳米级分辨率，则可能是在存储环境中AFM针尖发生了化学修饰。可通过将悬臂芯片暴露于紫外氧化仪中120秒来处理，这有助于在针尖表面形成亲水性基团60。但需注意，所需确切时间可能因针尖几何形状和紫外光功率而异，过度暴露可能导致针尖钝化，从而降低分辨率。
热噪声
高分辨率成像需要对力和距离的变化具有极高的灵敏度（通常为亚皮牛顿级的力和亚埃级的距离78）。对于较软的悬臂梁，由于其固有的布朗运动（热振动）引起的热机械运动可能成为一个问题。在一级近似下，对于刚度为 k 的悬臂梁，无法测量小于 <img alt="热速度公式 √(2kBT/k)；气体动理论方程；物理计算。" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式1"> 的特征尺寸，该值为热噪声的振幅，其中 kB 为玻尔兹曼常数，T 为温度。实际上，使用共振频率更高的悬臂梁可将噪声分布在更宽的频率范围内，从而降低测量带宽内的总体噪声水平79。
高阶特征模式成像
有时，由于有效刚度增加，使悬臂梁在其第二特征模态下工作可能具有优势（参见关于污染的讨论）。实际操作中，只需在悬臂梁的第二特征模态（即较高频率处的第二个共振峰，见图1A）进行驱动即可。在调节悬臂梁时，只需选择第二特征模态而非主共振峰，然后继续进行步骤5.4。需注意，当悬臂梁在第二特征模态下驱动时，反向光学杠杆灵敏度（InvOLS）将有所不同；对于矩形悬臂梁，其值通常约为步骤5.2中测得的InvOLS的1/3。
该技术的主要局限性在于其需要样品表面具有稳定的溶剂化环境。样品必须具有足够的稳定性，以允许扰动界面液体而不引起样品本身的显著形变。这对于非常柔软且不稳定的样品（如大分子生物分子）而言可能具有挑战性。此外，此处所述的小振幅原子力显微镜（AFM）无法获取样品力学性质的相关信息，因为悬臂探针尖端大部分时间处于界面液体中。针对这一问题，可考虑采用其他方法，例如定量纳米力学成像80，或利用悬臂运动的高阶谐波。在液体中成像时（品质因数较低），高阶谐波通常会被增强29,81-83，并可同时提供样品的形貌与刚度信息25,81-84，但通常会降低高分辨率成像的效果。所有扫描探针显微技术固有的其他局限性在此同样适用，尤其是测量结果不可避免地包含探针尖端信息这一事实。小振幅模式也不适用于高度变化较大的样品；当高度变化超过成像振幅时，反馈回路的响应必然较慢，从而增加样品与探针损坏的风险。使用较软的悬臂可在一定程度上缓解这一问题。
本文所介绍方法的主要优势在于，它能够在液体环境中实现原子力显微镜（AFM）所能达到的最高图像分辨率，并且可在任何商用AFM仪器上实施，前提是仪器的噪声水平足够低。在商用仪器上获得类似分辨率通常需采用接触模式，或偶尔使用刚性悬臂梁的调频原子力显微镜（FM-AFM）。而在振幅调制模式（AM模式）下使用相对较软的悬臂梁，可扩大样品的选择范围，且在大多数系统上比FM-AFM更容易实现。该方法依赖于利用任何固-液界面存在的溶剂化力，以提高分辨率并获取局部化学信息。原则上，该方法也可在环境条件下使用，仅依靠由于空气湿度而在大多数表面形成的水层（通常为数纳米厚）。实现高分辨率的基本原理保持不变，但此时针尖大部分处于空气中，仅在针尖顶端与样品之间存在一个毛细桥接85。在此条件下，已在刚性样品上实现了高分辨率成像86,87。然而，由于悬臂梁振荡的品质因子（Q因子）更高，其成像条件与浸入液体中的情况有所不同。实际操作中，我们发现对柔软或不规则样品难以实现稳定运行，推测原因可能是毛细桥接随时间变化，以及对于给定刚度的悬臂梁其Q因子升高所致。
本文所述方案提供了一种利用大多数现代商用调幅原子力显微镜（AM-AFMs）在液体环境中对样品实现分子级分辨率成像的方法。我们阐述了成像参数选择背后的科学依据，并强调了溶剂化力的作用。同时讨论了常见问题，特别是污染问题。具体的针尖-样品相互作用会因成像溶液的成分、悬臂梁的几何形状与材料以及样品的化学性质不同而发生显著变化。因此，深入理解扫描过程中主导作用力的本质，对于将本方案优化应用于新体系并确保结果的可靠性至关重要。经过优化后，该实验方法在获取 原位 溶液样品在局部分子水平上的深入见解

自三十年前发明以来，原子力显微镜（AFM）1已成为在纳米尺度上研究样品的首选技术，尤其适用于无法对宏观表面区域进行平均、而需要局部信息的情况。在典型的AFM测量中，通过检测一个柔性悬臂的偏转，来量化位于悬臂末端的超锐利针尖与少量分子之间的相互作用力。根据所考虑的相互作用类型和时间尺度，可以获得多种信息，包括软性生物膜的粘弹性特性2,3、单个化学键或分子键的强度4,5、表面的原子级细节6-8，以及样品的磁性9、电容性10、导电性11、热学12,13和化学性质1415。AFM成功的一部分原因在于其能够适用于多种材料16，并在多种环境中工作，如真空17、气体11,18或液体19,20，因为它不依赖于探针与样品之间的特定作用力。
然而在实际操作中，除常温环境外的原子力显微镜（AFM）使用条件可能具有挑战性，许多已发表的结果仍是在空气中获得的。另一个困难在于，通常需要以动态模式（振动针尖）操作AFM，以避免过大的摩擦力，从而保护针尖和样品。尽管动态模式操作更具挑战性，但原则上可提供更多关于被测样品的信息，且空间分辨率不会降低。在过去十年中，液相动态AFM领域取得了重要进展，从视频速率AFM21-23的出现，到多频测量技术24,25以及界面水合结构的亚纳米级成像26-31。目前，浸入液体中的AFM操作已常规应用于生物学与生物物理学32-36、高分子研究37、电化学38-40以及固-液界面表征41-44。液体包围振动悬臂梁会显著改变其动力学行为45，以及针尖与样品之间的相互作用29,42。若使用得当，液体可被用于提高成像分辨率26,29，其典型分辨率相比常温条件下的最佳水平可提高近一个数量级46。
在原子力显微镜（AFM）中，特定测量所能达到的最高空间分辨率取决于AFM仪器本身的性能以及所探测相互作用的性质20,47,48。目前，大多数高端商用AFM的噪声水平已接近热噪声极限12，因此分辨率的主要决定因素通常是针尖与样品之间的相互作用。实际上，正是这种相互作用的空间梯度决定了分辨率：基于短程、快速衰减相互作用的测量比长程相互作用主导的情况能获得更高的分辨率。在液体环境中，溶剂化力可以提高成像分辨率，因为当远离样品表面时，这些力通常在几个液体分子直径的距离内（通常&#60; 1 nm）即迅速消失49。这些力源于液体分子与样品表面之间的相互作用。在样品界面处，对表面具有较强亲和力的液体相较于体相液体往往排列更有序、流动性更低29,42,50。因此，振动的AFM针尖要移动界面处的液体分子所需能量高于移动体相液体分子42，从而使测量对纳米尺度下界面液体性质的局部变化——即溶剂化结构——极为敏感。
为了利用溶剂化力，需要考虑几个实际因素。首先，针尖的振幅需与溶剂化力的作用范围相当，通常 &#60; 1 nm。其次，所用液体必须在样品表面形成明确的溶剂化结构。从宏观上看，这相当于要求所考虑的样品使用一种能够“润湿”其表面的液体。例如，在水中对亲水性的云母实现分子级分辨率比对疏水性的石墨更容易42,51。最后，支撑针尖的悬臂梁的弹簧常数必须适当选择52,53。在这些条件下工作时，原子力显微镜不仅能提供界面的分子级图像，还能获得有关样品-液体局部亲和性的信息，从而获取样品表面的化学信息54。
在液体中，原子力显微镜（AFM）最常见的动态工作模式是振幅调制（AM，也称为“轻敲模式”）AFM和频率调制（FM）AFM。在第一种情况下55，探针在样品表面进行光栅扫描，同时通过反馈回路持续调节探针与样品之间的距离，以保持探针振动振幅恒定。样品的形貌图像由反馈回路所施加的校正量获得。在FM-AFM28,41,56中，当探针扫描样品时，保持恒定的是悬臂/探针的振荡频率。这两种技术在液体中均可实现相当的形貌分辨率36,57。对针尖-样品相互作用的量化在FM-AFM中通常更为直接且准确，但AM-AFM更容易实现，更具稳定性，并允许使用更软的悬臂，这对于研究易变形或脆弱样品具有优势。值得注意的是，AM-AFM在AFM用户中更为普及，部分出于历史原因，也因为其在技术上更容易控制。
尽管在调幅原子力显微镜（AM-AFM）成像过程中，反馈回路保持振幅恒定，但允许探针振荡与驱动振荡之间的相位滞后自由变化。相位滞后能够提供有关探针与样品相互作用的有用信息，因为它与探针在样品界面处振荡时耗散的能量相关58。因此，相位成像可与形貌成像同时进行，并且通常在突出样品表面异质性方面具有互补作用。相位成像已被用于多种相互作用的映射，包括黏附能的直接映射42、黏弹性特性58以及界面水合分布的表征44。
实际上，由于需要控制的参数众多，且缺乏一种在各种情况下均适用的简单、系统性操作方案，在液体环境中获得高分辨率图像仍然具有相当大的挑战性。图像质量通常取决于悬臂梁的几何形状和弹性、针尖化学性质、振荡幅度以及样品的刚度等多种因素55。此外，根据定义，原子力显微镜（AFM）测量本身会对系统产生扰动。因此，若在未充分考虑的情况下改变成像参数或环境条件，可能导致实验结果难以重复，或出现误导性的观察现象及虚假结果。
本文介绍了利用商业仪器在振幅调制模式下对溶液中的硬质和软质样品进行高分辨率成像的实验方案。我们的目标是提供一种实用的操作流程，以优化可能影响不同样品成像分辨率的主要参数，并针对每种情况，从成像过程所依据的物理原理出发，解释我们选择这些参数的科学依据。我们详细描述了从基底清洗与制备、悬臂梁的选择、成像参数的调整到常见问题排查的逐步操作方法。阐明实现高分辨率成像所采用选择与操作背后的科学原理，将有助于在调整该方法时做出合理决策，并为新体系的成像研究提供一个良好的起点。
在本文中，我们使用 AM 表示原子力显微镜（AFM）的振幅调制操作模式。我们将反馈控制中保持恒定的参数——无论是悬臂偏转（接触模式）还是振荡振幅（AM 模式）——称为设定点（setpoint）值。在 AM 模式下，悬臂通过声学振荡或聚焦于悬臂基部的脉冲激光进行外部驱动。驱动振幅（drive amplitude）是指外部振荡信号的强度。实现特定悬臂振荡振幅所需的驱动振幅绝对值取决于多种参数，例如驱动方式（声学、光热或磁驱动）、悬臂固定方式及其自身参数（刚度、几何形状）以及激光对准情况。因此，驱动振幅的具体数值并不关键，而是在每次实验中进行调整，以提供适当且可量化的悬臂振荡振幅。当受驱悬臂远离样品表面，且其振动未因针尖-样品相互作用而发生阻尼时，其振荡振幅称为自由振荡振幅（free oscillation amplitude）。随着振动针尖接近样品表面，其振幅开始减小。若启用反馈控制，压电陶瓷 z-扫描器将不断调节其伸长量，以维持所选的设定点振幅恒定。设定点值通常始终小于自由振幅。人们常使用设定点比值（setpoint ratio），即设定点振幅（成像振幅）与自由振幅的比值。设定点比值越小，成像条件越苛刻。

<table><tbody><tr><td>多模式 IIIA 原子力显微镜</td><td>Brucker</td><td>NA</td><td>所使用的仪器之一</td></tr><tr><td>Cypher ES 原子力显微镜</td><td>Asylum Research</td><td>NA</td><td>所使用的仪器之一</td></tr><tr><td>原子力显微镜悬臂/探针</td><td>Nanoworld</td><td>Arrow UHF-AUD</td><td>适用于高频操作</td></tr><tr><td>原子力显微镜悬臂/探针</td><td>Olympus</td><td>RC800-PSA</td><td>通用且成本较低</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Milipore</td><td>NA</td><td>实验室过滤系统可能引入污染</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&amp;nbsp;</td><td>标准化学品，无需进一步纯化</td></tr><tr><td>单价盐</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>标准化学品，无需进一步纯化</td></tr><tr><td>脂质</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td>采用标准方案制备脂质双层</td></tr><tr><td>晶体</td><td>MTI</td><td></td><td>抛光晶体</td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>3M</td><td>Scotch Magic Tape</td><td>半透明胶带效果最佳；透明胶带粘性过强</td></tr></tbody></table>

在液体中利用振幅调制原子力显微镜实现亚纳米级分辨率成像

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

原子力显微镜（AFM）已成为在空气和液体环境中对样品进行纳米尺度成像的一种成熟技术。近期研究表明，当以振幅调制（轻敲）模式运行时，可在液体中对多种软硬样品实现原子或分子级别的高分辨率成像。在这些情况下，小振幅振荡（SAM-AFM）通过利用样品表面的溶剂化液层来提高成像分辨率。尽管该技术已成功应用于材料科学、生物学、生物物理学以及表面化学等多个领域，但对于初学者而言，在液体中获得高分辨率图像仍然具有挑战性。这在一定程度上是由于需要控制和优化的变量较多，例如悬臂梁的选择、样品制备以及成像参数的正确调节。本文提供了一种在商用仪器上使用SAM-AFM在液体中对软硬样品实现高分辨率成像的实验方案。我们的目标是提供一份逐步操作的实用指南，涵盖仪器和样品的清洗与准备、悬臂梁的选择以及成像参数的优化。对于每一步骤，我们均解释了相关选择背后的科学依据，以帮助用户根据各自的具体系统灵活调整实验方法。

前一节所述的方案已成功应用于多种商用原子力显微镜（AFM），以获得分子或原子级分辨率的图像。所有图像均在0.5 nm至1.5 nm的工作振幅范围内获取，具体振幅根据步骤7.1–7.4 individually调整确定。可在多种柔软（图2）和刚性（图3) 样品。在每种情况下，均突出显示了感兴趣的特征。该技术的一大优势在于，通过使用小振幅振荡和高设定值，可最大限度地减少探针对样品施加的作用力，从而允许对脆弱的脂质自组装结构（图 2A），蛋白质（图2B 和 D），以及两亲性分子（图2C) 在溶液中成像时不会受损。较硬的晶体材料，如矿物（图3A、B、D）以及吸附在表面上的单个金属离子（图3C）可以使用该方法进行成像，因为在所有情况下，实际上都是通过所描述的方案对界面液体进行成像。在所示样品上，溶剂化力具有可比性 图2 和 3：所有样品均为亲水性（更普遍的情况是，在某些情况下为“亲溶剂性”） 图2C、3B、3D) 相对于成像溶液。在所有情况下，均使用具有相似刚度（0.2 - 0.8 N/m）的悬臂梁。样品与针尖均应具有亲液性，以确保液体分子形成可被成像的明确定义的溶剂化结构。这并非总是充分条件，但在大多数情况下，对于相对较小的液体分子，液体会以模拟样品对称性的方式重新排列。实现高分辨率的主要驱动力是吸附溶剂分子对表面亲和力的局部变化（在Ångström尺度下，对于 图 2A、3A、3C因此，该技术最适合用于表面溶剂结构变化显著的材料。
<img alt="在水溶液中通过调幅原子力显微镜成像的软界面。A：在150 mM KCl中成像的处于凝胶相的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）脂双层。六方排列的脂质头基在形貌和相位图像中均可分辨，局部对比度反映了特定位置水合状态的差异。B：在150 mM KCl、10 mM Tris、pH 7.4条件下成像的盐生盐杆菌紫色膜。若干细菌视紫红质蛋白三聚体被标出。由于蛋白质上的局部水合位点，相位图像呈现出与形貌不同的对比度。可分辨出单个蛋白三聚体（虚线所示）。C：在染料敏化太阳能电池中，两亲性染料（Z907）分子吸附在TiO2纳米颗粒表面。图像在乙基异丙基砜中获取。吸附的染料分子形成了类似海绵的外观。D：在与B相同缓冲液中成像的天然牛晶状体膜中的水通道蛋白晶体。一个水通道蛋白四聚体被标出。在形貌图像中可见对应于螺旋间环的亚结构，而由于蛋白附近异常的水行为，相位图像显示出显著不同的对比度。图像改编自参考文献36（B）、参考文献38（C）和参考文献67（D）。标尺分别为：5 nm（A）、10 nm（B）、3 nm（C）和15 nm（D）。颜色标尺分别表示高度和相位变化：200 pm和15°（A）、600 pm和4°（B）、2.5 nm和2.5°（C）、1.6 nm和9.5°（D）。" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：在水溶液中通过调幅原子力显微镜（AM-AFM）成像的软界面。A：在150 mM KCl溶液中成像的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）脂双层凝胶相。六方紧密排列的脂质头基在形貌和相位图像中均清晰可辨，同时局部对比度揭示了特定位置水合状态的差异。B：在150 mM KCl、10 mM Tris、pH 7.4条件下成像的盐生盐杆菌（Halobacterium salinarum）紫色膜。多个细菌视紫红质蛋白三聚体被突出显示。由于蛋白质上局部水合位点的存在，相位图像呈现出与形貌图像不同的对比度。可分辨出单个蛋白三聚体（以虚线标示）。C：染料敏化太阳能电池中，两亲性染料（Z907）分子吸附于TiO2纳米颗粒表面。图像在乙基异丙基砜中采集。吸附的染料分子形成了类似海绵的结构外观。D：在与B组相同缓冲液中成像的天然牛晶状体膜中的水通道蛋白晶体。一个水通道蛋白四聚体被突出显示。形貌图像中可见对应于螺旋间环的亚结构，而相位图像则因蛋白附近异常的水行为呈现出显著不同的对比度。图像改编自参考文献36（B）、参考文献38（C）和参考文献67（D）。标尺长度分别为5 nm（A）、10 nm（B）、3 nm（C）和15 nm（D）。颜色标尺分别表示高度和相位的变化范围：200 pm和15°（A）、600 pm和4°（B）、2.5 nm和2.5°（C）、1.6 nm和9.5°（D）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="方解石、SrTiO3、云母+RbCl 和 SiC 的原子力显微镜形貌与相位图像" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：液体溶液中硬质样品的典型AM-AFM图像。A方解石晶体 [<img alt="科学计数法，循环小数符号；适用于数学或物理公式。" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式2">在平衡的超纯水溶液中成像的表面。 B：在二甲基亚砜（DMSO）中获得的钛酸锶成像。在水中无法实现高分辨率。 C：3 mM RbCl 溶液中的云母成像 — 单个吸附的 Rb+ 在相位和高度扫描中，均可观察到云母晶格位点上的离子。 D：碳化硅在DMSO中成像。预期的晶体学排列如图B和D所示。图片改编自参考文献 68 (A)，参考文献 42 （B 和 D），以及 ref 44 （C）中的比例尺为 3 nm（A、B、D）和 5 nm（C）。颜色标尺分别表示 250 pm 的高度和相位变化。 14° (A)，600 pm 和 5.5° (B)，800 pm 和 15° （C）以及 500 pm 和 3.5° (D). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍一种在液体环境中利用振幅调制（轻敲模式）原子力显微镜获得亚纳米级分辨率图像的方法。该方法已在商用原子力显微镜上得到验证。我们解释了参数选择背后的原理，并提出了优化分辨率的策略。

原子力显微镜（AFM）已成为在空气和液体环境中对样品进行纳米级成像的成熟技术。近期研究表明……

本实验的总体目标是利用商品化的原子力显微镜（AFM）在液体环境中进行振幅调制模式（也称为轻敲模式）操作，以实现尽可能高的成像分辨率。该方法通过优化参数组合来获得高分辨率，从而突破标准AFM在液体中操作的极限。该技术的主要优势在于，它适用于大多数商品化的AFM设备，因此无需任何专用设备。本文所述方法面向已具备原子力显微镜（AFM）基本知识的科研人员和技术人员，旨在帮助他们更充分地利用该技术。该方法不局限于特定类型的样品，可广泛应用于物理学、生物学、化学、材料科学及工程科学领域的样品。通常，刚接触该技术的人员可能会遇到困难，因为需要一定耐心才能为特定样品找到最佳参数。将仪器及支撑基底的圆盘在超纯水中进行浴式超声处理，随后依次用异丙醇和超纯水各处理10分钟。当追求高分辨率时，任何污染都可能产生不利影响。始终佩戴手套，并确保任何接触样品、悬臂或原子力显微镜（AFM）样品池的表面或仪器均经过彻底清洁。超声处理后，在氮气流下干燥所有仪器及样品圆盘。使用钢制圆盘作为云母的支撑基底，以观察单个吸附的金属离子。对于无法通过超声清洗的表面，依次使用浸有超纯水、异丙醇和超纯水的单层低绒擦拭纸进行擦拭，以实现物理清洁。让表面在空气中干燥最多30分钟。接着，通过充分混合试剂制备少量环氧树脂胶，并在洁净的钢制样品圆盘上放置约10微升环氧树脂胶。将云母基底置于环氧树脂上，通过施加压力将其固定在钢盘上。根据制造商的说明，在较高温度下使环氧树脂固化数小时。然后，将一块2.5厘米宽的胶带紧密按压在基底表面，确保完全覆盖整个表面，再平稳地剥离顶层。重复此过程两到三次，直至云母表面肉眼观察呈镜面光滑。将悬臂梁芯片先后浸入异丙醇和超纯水中，每种溶液中各浸泡60分钟。随后，将探针暴露于紫外光下照射最多五分钟，以促进稳定水合位点的形成。过长的曝光时间可能会损坏针尖，或增大其曲率半径。将悬臂插入原子力显微镜（AFM）的悬臂夹持器中，用移液器吸取25微升成像液体滴加到悬臂和针尖上，以预先润湿表面。这可在接近样品时减少气泡的产生。将样品圆盘和基底熔接到样品台上，并在样品上添加一滴成像液体。然后将悬臂梁支架连接到原子力显微镜（AFM）。使悬臂梁与样品接近，以便在悬臂梁尖端的液体与样品上的液体之间形成毛细桥。使用原子力显微镜（AFM）软件将测量激光对准悬臂末端的针尖附近。接着，从悬臂的热谱中主峰位置确定其共振频率。如果已对悬臂的偏转进行校准，则通过简谐振子模型拟合共振峰可得到悬臂的弹性常数。然后，通过在热谱中确定的共振频率附近的一系列频率下，施加外部驱动并寻找悬臂的振幅响应，从而对悬臂进行调谐。调节驱动振幅，使自由振荡振幅约为五纳米。在大多数原子力显微镜上，这通常对应0.2–0.8伏特。然后，将振幅设定点调整至自由振幅的大约80%。接着，将反馈增益设为相对较高的值。在确认无任何不稳定性或振铃现象后，将初始扫描速率设为约1赫兹，扫描尺寸设为10纳米。使用 AFM 控制软件启动探针向表面的接近过程。通过轻微改变设定值，评估探针是否已到达表面，但尚未开始成像。如果探针已接触表面，则对 ZPA 区域延伸范围的影响应可忽略不计。当探针尖端到达表面后，收回ZPA区域并重新调节悬臂梁。由于探针与样品之间的相互作用，共振频率可能会降低。此时，将设定点调整至新调谐自由振幅的大约80%，然后使悬臂梁接触样品，以振幅调制模式对表面进行10 × 10 纳米的扫描，以确认成像参数是否合适。检查正向扫描与反向扫描曲线是否重合。若不重合，进一步降低设定点，并尝试提高增益。若图像变得嘈杂，则降低增益。对样品中较大的区域（1至5平方微米）重复此操作，如果条件允许的话。对于较软或生物样品，这可能会导致针尖污染。将扫描尺寸减小至适合观察目标特征的数值。这可以低至20乘以20纳米。接下来，将悬臂的驱动振幅降低至足够小，以使反馈回路自动收回ZPA区域，使探针尖端脱离表面。当悬臂远离表面时，调节驱动振幅，使悬臂的振幅达到峰峰值1至2纳米。逐步小幅降低设定点，直至ZPA区域再次向表面延伸并恢复原始图像。将设定点振幅保持在新的自由振幅的75%至95%之间。随后重新调整增益，因为在较低振幅下可使用较高的增益而不会引入显著噪声。优化系统以找到实现高分辨率的最佳自由振幅、设定点和增益组合。最佳系统条件取决于样品、液体的润湿特性以及所使用的悬臂。对于亲液性界面，应使用弹簧常数为 0.5 至 2 牛顿每米的悬臂。利用该技术，已在多种样品上获得了亚纳米级分辨率的图像。此处展示的软性样品包括脂质双层、盐生嗜盐菌的紫色膜、两亲性双分子自组装单层膜，以及牛晶状体膜中水通道蛋白的晶体。在每种情况下，均重点突出了所关注的结构特征。微小的振幅和高设定值可最大限度地减小探针对样品施加的作用力，从而能够在溶液中对双层脂质、天然生物膜中的蛋白质以及两亲性分子等脆弱的自组装结构进行成像而不造成损伤。对于较硬的结晶材料，例如方解石、钛酸锶、碳化硅以及吸附在云母表面的单个金属离子，也可利用该方法进行成像，因为在所有情况下，实际成像的是界面液体，而非晶体本身。一旦掌握该技术，只要操作正确，几乎每次都能在液体环境中实现分子级或原子级分辨率。进行此操作时，重要的是要牢记所成像的是界面液体，这意味着需采用温和的成像条件。探针、样品或液体的污染通常是导致无法获得高分辨率图像的主要原因。如果存在任何疑问，通常最好清洁所有与液体接触的表面，并重新使用成像溶液。外部噪声也会对高分辨率产生不利影响。应选择远离通风管道的低振动地面。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何优化成像参数以实现高分辨率原子力显微镜（AFM）成像。当然，对于任何前沿技术而言，可能需要多次尝试才能确定最佳的样品成像条件，因此耐心至关重要。

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亚纳米级分辨率成像与调幅原子力显微镜在液体

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