脂肪干细胞的软骨细胞分化诱导离心重力

该程序的总体目标是诱导 ASC 的软骨形成分化以修复有缺陷的软骨。该方法利用离心重力诱导 ASC 的软骨前发生分化。虽然这种方法可以深入了解 ASC 的软骨形成分化，但它也可以应用于其他系统，例如成骨和纤维化分化。

该技术的主要优点是可以很容易地从干细胞中诱导软骨形成分化，而无需处理任何细胞因子。演示该程序的是我实验室的 Yeri Alice Rim 和 Yoojun Nam。首先从 100 毫升培养皿中收获 80% 汇合的脂肪来源干细胞，丢弃培养基并用 5 毫升 PBS 洗涤。

然后，加入 1 毫升含有 1 毫摩尔 EDTA 的 PBS，并在 37 摄氏度下在含有 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 2 分钟。2 分钟后，轻轻敲击培养板，然后加入 4 mL 新鲜培养基，将细胞转移至 15 mL 锥形管中。在室温下以 250 x g 离心细胞 2 分钟。

离心后，去除上清液，不要干扰沉淀。然后，将沉淀重新悬浮在 10 毫升培养基中。使用血细胞计数器计数细胞。

对于离心重力加载，将 2.5 倍 10 至第五个细胞转移到新的 15 mL 锥形管中，并以 2400 倍 g 离心 15 分钟。离心后，进行沉淀或微量培养。离心后立即吸出上清液和 500 μL 的软骨形成分化培养基 （CDM） 和每毫升 50 μg 新鲜制备的 L-抗坏血酸 2-磷酸盐到沉淀中。

阳性对照，通过添加含有 10 ng/mL TGF-β-1 的 CDM 诱导软骨形成分化并收集其细胞。松散地盖上试管，并在 37 摄氏度下在含有 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育三周。重力负载离心后，立即吸出上清液并将沉淀重悬于 10 μL CDM 中。

为了形成微质量，将重新悬浮的细胞移液到 24 孔板的孔中心，然后将板放入培养箱中。两小时后，小心地向孔中加入 500 μL CDM，靠着板壁移液以避免破坏微质量。作为阳性对照，通过添加每毫升含有 10 ng TGF-β-1 的 CDM，对未离心的细胞进行微量培养。

将微团块孵育三周。在微量物质形成后第 21 天，使用移液管收集球状体沉淀，然后用 1X PBS 洗涤。通过在 4% 多聚甲醛中浸泡 24 小时来固定球状颗粒。

第二天，丢弃固定剂并用去离子水冲洗细胞沉淀。将一层纱布放在组织盒上，并使用移液管转移固定的球状体颗粒。折叠纱布盖住沉淀并关闭盒盖。

接下来，在室温下将球状体沉淀浸入 70% 乙醇中 5 分钟，使球状体沉淀脱水。然后，继续进行一系列乙醇浓度，每次浓度 5 分钟。然后将颗粒浸入 100% 二甲苯中 15 分钟。

将球状体颗粒浸入 56 摄氏度的石蜡中进行包埋。接下来，使用旋转切片机从石蜡包埋的细胞沉淀中切下 5 微米厚的切片。将切片漂浮在 50% 乙醇中，然后将它们转移到 50 摄氏度的水浴中。

将漂浮切片安装在载玻片上，然后进行番红 o 和阿尔新蓝进行免疫荧光染色。为了确定合适的离心重力，ASC 在 0、300、600、1、200 和 2、400 倍 g 的离心重力下旋转 15 分钟。在 CG 刺激后 24 小时评估 SOX9 mRNA 表达。

CG 为 2， 400 倍 g 显著诱导 SOX9 mRNA 表达。为了评估软骨形成相关基因的表达，从未刺激的 ASC、离心或用 TGF-β-one 处理的 ASC 中提取总 RNA。如图所示，CG 刺激诱导 2 型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖表达。

使用 Alexa Fluor 594 偶联二抗中的抗 2 型胶原抗体进行免疫荧光分析，证实 2 型胶原在 CG 处理的 ASC 中过表达。为了确定 CG 对软骨形成相关 ECM 过表达的影响，用 TGF-β-one 作为阳性对照处理 ASC。阴性对照是未进行 CG 负载或 TGF-β-one 处理的沉淀培养物。

通过使用番红 o 和阿尔新蓝染色，在由离心的 ASC 组成的球状体沉淀中评估软骨形成相关 ECM 的过表达。糖胺聚糖是关节软骨的主要成分，被阿尔新蓝染成蓝色，或被番红 o 染成橙色。微量培养 14 天后，通过聚集体的大小评估软骨细胞浓缩。

CG 生成的每个聚集体的大小约为 0.5 毫米。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 30 分钟内完成。看完这个视频，你应该对如何利用离心重力诱导干细胞的成软骨分化有一个很好的了解。