在鼠耳皮肤的免疫反应的活体多光子成像诱导缺血再灌注损伤

本实验的总体目标是通过小鼠耳皮肤的活体多光子成像了解免疫细胞如何对缺血再灌注做出反应。这种方法可以帮助解决免疫学和皮肤病学领域的一些非常重要的问题，以了解免疫细胞的动态行为。该技术的主要优点是它为研究发炎或静止状态下皮肤中的细胞活动提供了一个强大的成像模型。

虽然这种方法可以提供对缺血性再灌注损伤的见解，但这也可以应用于其他系统，例如超敏反应和感染。要开始此过程，请将鼠标放在加热垫上，以在整个准备过程中将其体温保持在 37 摄氏度。通过没有脚趾捏反射来确认麻醉深度。

接下来，在动物的眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止麻醉时干燥。之后，小心地将脱毛膏涂抹在耳背的上三分之二，等待两到三分钟。然后，使用湿棉头涂抹器彻底但轻柔地去除乳霜。

现在，使用钕磁铁诱导小鼠耳皮肤缺血。为此，首先将磁铁插入各自的塑料导轨中。放置一个磁铁，使只有边缘与第二个腹侧磁铁接触，该磁铁应放置在耳朵腹侧下方，耳朵平放在磁铁上。

准备好后，小心地让磁铁聚在一起。缺血 1.5 小时后，使用塑料导板将磁铁彼此扭开，以去除磁铁，以便进行再灌注。移除磁铁后，立即静脉注射 Evans Blue 或其他选择的血管标记剂。

在此步骤中，剪下两片遮蔽胶带。让胶粘剂面粘在一起，同时沿其宽度留出约 1 毫米的胶粘剂。然后，将遮蔽胶带切成两半，以适应其放置在耳平台上的狭缝内。

将遮蔽胶带插入狭缝的一半左右，使粘合面朝上。之后，将鼠标放在加热垫上，使要成像的耳朵位于遮蔽胶带条旁边。使用两个 PBS 湿棉头涂抹器，轻轻地将耳朵压在胶条上。

以条带为导向，将鼠标耳朵穿过狭缝，同时将鼠标调整到更靠近载物台的位置。由于耳部皮肤非常脆弱，因此必须非常小心地进行此步骤，以避免任何准备引起的伤害。要去除胶带，首先要加入一滴 PBS 以减少胶带的粘合性。

然后，使用细画笔尽可能轻柔地将鼠标耳朵与遮蔽胶带分开。将湿润的棉签涂抹器轻轻地滚动在耳朵上，将耳朵压平在耳平台上。随后，将一滴 PBS 滴在盖玻片下方，轻轻地将其放在耳朵上。

然后，根据制造商的说明插入直肠温度探头并将电线连接到加热系统。要获取图像，请将动物置于多光子显微镜下。从靠近缺血边缘的成像区域开始，该区域以大量 Evans Blue 渗漏为特征。

此处的示意图显示了磁体的位置。这两张照片显示了磁体夹持后的缺血前耳和缺血后耳。在这个示意图中，耳朵表示相对于磁铁放置位置成像的区域。

这个最大投影的延时序列显示了缺血 1.5 小时后 LysM-eGFPM 白化小鼠耳皮肤响应再灌注的中性粒细胞浸润。在较早的时间点，缺乏 Evans Blue 信号表明缺血后血管暂时闭塞。一旦掌握，如果作得当，可以在不到 30 分钟的时间内完成缺血再灌注耳成像的准备工作。

在执行此程序时，不断检查麻醉深度和鼠标的温度非常重要。按照此程序，可以执行其他方法，如小鼠耳皮肤的全小鼠染色，以获得细胞定位的全局视图。在该协议发展之后，它为免疫学和皮肤病学领域的研究人员探索小鼠耳皮肤的先天免疫铺平了道路。

看完这些视频后，您应该对如何建立小鼠耳皮肤成像模型来研究缺血再灌注损伤有一个很好的了解。不要忘记，使用多照相显微镜可能很危险。并应采取激光安全培训等预防措施。