Name: 工程人为因素来特异性地操纵人细胞中的选择性剪接 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学习利用人工剪接因子特异性操控人细胞中的选择性剪接技术。该方法通过工程化PUF结构域实现基因剪接调控，为癌症等疾病中RNA代谢研究提供灵活工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01-CA158283和国家自然科学基金委员会（NSFC）资助项目31400726资助，资助对象为Z.W.。Y.W. 受“青年千人计划”及国家自然科学基金委员会（资助号31471235和81422038）资助。X.Y. 受中国博士后科学基金（资助号2015M571612）资助。

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li>
<li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+day+in+the+life+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li>
<li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li>
<li>Wang, G. -S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+in+disease%3A+disruption+of+the+splicing+code+and+the+decoding+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery.</a> Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).</li>
<li>Li, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing+is+a+primary+link+between+genetic+variation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease.</a> Science. 352 (6285), 600-604 (2016).</li>
<li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mis-splicing+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li>
<li>Graveley, B. R., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine%2Fserine-rich+domains+of+SR+proteins+can+function+as+activators+of+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing.</a> Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).</li>
<li>Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1+recruited+to+an+exon+in+vivo+can+function+as+an+exon+splicing+silencer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).</li>
<li>Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+binding+of+single-stranded+RNA%3A+is+there+a+code+for+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition.</a> Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).</li>
<li>Dong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+modular+binding+code+for+cytosine+recognition+in+Pumilio%2FFBF+%28PUF%29+RNA-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains.</a> J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).</li>
<li>Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+code+for+RNA+recognition+by+PUF+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A universal code for RNA recognition by PUF proteins.</a> Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).</li>
<li>Wei, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA-binding+proteins+with+diverse+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA-binding proteins with diverse activities.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+splicing+factors+with+designed+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering splicing factors with designed specificities.</a> Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).</li>
<li>Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+endonucleases+with+customized+sequence+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities.</a> Nat Commun. 3, 1147(2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).</li>
<li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+splicing+enhancers%2C+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li>
<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li>
<li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li>
<li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732(2009).</li>
<li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li>
<li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).</li>
<li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer%3A+pathways+and+programs+unhinged%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li>
<li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+biol%22%5BJournal%5D)">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
<li>Anczukòw, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告详细描述了可特异性调控靶基因选择性剪接的人工剪接因子的设计与构建方法。该方法利用PUF重复序列独特的RNA结合模式，构建具有定制特异性的RNA结合支架，可用于激活或抑制剪接过程。
本方案的关键步骤是生成重编程的PUF结构域，该结构域决定了ESF的特异性。为此已开发并优化了一种PCR拼接方案，用于快速构建PUF骨架。该方法成功的关键在于将不同重叠模板的比例调整为1:1:1。每轮PCR后对产物进行纯化也至关重要，因为未纯化的产物可能含有上一轮反应残留的引物污染。另一个重要步骤是使用半定量RT-PCR检测剪接比例。通常应避免过多的扩增循环次数，以免PCR反应达到饱和。在我们共表达剪接报告基因的实验中，常规使用20至25个循环，但在检测内源基因剪接时，具体循环数可能需根据mRNA丰度进行调整。当使用新的一对引物定量剪接异构体时，建议每次均按照先前所述方法重新校准PCR实验16。
设计型ESF的一个潜在局限性是其脱靶效应，因为特异性由PUF骨架中的重复序列数量决定。野生型PUF识别一...

大多数人类基因经历可变剪接（Alternative Splicing, AS），以产生具有不同活性的多种亚型，从而极大地增加了基因组的编码复杂性1,2。AS 是调控基因功能的主要机制之一，并在不同的细胞和发育阶段通过多种途径受到严密调控3,4。由于剪接调控异常是人类疾病的常见原因5,6,7,8，靶向剪接调控正成为一种有吸引力的治疗策略。
根据一个简化的剪接调控模型，可变剪接（AS）主要由前体mRNA中的剪接调控cis-元件（SREs）控制，这些元件作为可变外显子的剪接增强子或沉默子发挥作用。这些SREs特异性招募多种trans-作用蛋白因子（即&#160;剪接因子），以促进或抑制剪接反应3,9。大多数trans-作用剪接因子具有独立的序列特异性RNA结合结构域用于识别其靶标，以及调控剪接的效应结构域。最著名的例子是富含丝氨酸/精氨酸（SR）蛋白家族成员，其包含位于N端的RNA识别基序（RRMs），可结合外显子剪接增强子，以及位于C端的RS结构域，促进外显子的包含10。相反，hnRNP A1通过其RRM结构域结合外显子剪接沉默子，并通过C端的富含甘氨酸结构域抑制外显子的包含11。利用这种模块化结构，研究人员应能够通过将特定的RNA结合结构域（RBD）与不同功能的效应结构域（激活或抑制剪接）组合，设计出人工剪接因子。
此类设计的关键在于使用一种RBD，其能够以可编程的RNA结合特异性识别特定靶标，类似于TALE结构域的DNA结合模式。然而，大多数天然剪接因子含有RRM或K同源（KH）结构域，这些结构域对短RNA元件的识别亲和力较弱，因而缺乏可预测的RNA-蛋白质识别能力。 &#34;代码&#34;12PUF重复蛋白的RBD（RNA结合结构域）即&#160;PUF结构域具有独特的RNA识别模式，可据此重新设计PUF结构域，以特异性识别不同的RNA靶标13,14经典的PUF结构域包含八个由三个α螺旋组成的重复单元，每个重复单元识别一个8个核苷酸长度的RNA靶标中的单个碱基。第二α螺旋特定位置上的氨基酸侧链与RNA碱基的Watson-Crick边缘形成特异性的氢键，从而决定每个重复单元对RNA的结合特异性。图1A）。PUF重复序列对RNA碱基的识别编码出人意料地简单（图1A），从而能够生成可识别任意8碱基组合的PUF结构域（Wei和Wang综述）15).
这种模块化设计原则可用于构建一种由定制的PUF结构域和剪接调控结构域（即&#160;SR结构域或Gly富集结构域）组成的工程化剪接因子（ESF）。这些ESF可作为剪接激活因子或抑制因子，用于调控多种类型的剪接事件，并已被证明是操控与人类疾病相关的内源性基因剪接的有效工具16,17。例如，我们构建了PUF-Gly型ESF，以特异性改变Bcl-x基因的剪接方式，将抗凋亡的长亚型（Bcl-xL）转化为促凋亡的短亚型（Bcl-xS）。改变Bcl-x亚型的比例足以增强多种癌细胞对多种抗癌化疗药物的敏感性16，表明这些人工因子可能作为潜在的治疗试剂具有应用价值。
除了利用已知的剪接效应结构域（例如，RS 结构域或富含甘氨酸的结构域）来调控剪接外，工程化 PUF 因子还可用于研究新剪接因子的功能活性。例如，通过该方法，我们已证明当多个 SR 蛋白的 C 末端结构域结合到不同的 pre-mRNA 区域时，可激活或抑制剪接过程18，RBM4 的富含丙氨酸基序可抑制剪接19，而 DAZAP1 的富含脯氨酸基序则可增强剪接效率20,21。这些新发现的功能结构域可用于构建更多类型的合成因子，以精确调控剪接过程。

<table><tbody><tr><td>高保真DNA聚合酶（Phusion High-Fidelity）及PCR缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA连接酶（T4 DNA连接酶）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>脂质体转染试剂（Lipofectamine 2000）</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>减量血清培养基（Opti-MEM）</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取缓冲液（TRIzol试剂）</td><td>ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol 试剂含有苯酚，可导致灼伤。操作时应佩戴手套。</td></tr><tr><td>PBS（1×）</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶（RT）</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3 抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>PARP 抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-x 抗体</td><td>BD生物科学</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>β-actin 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>α-微管蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>FLAG抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting 检测试剂</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>荧光激活细胞分选仪（FACS）</td><td>BD生物科学</td><td>FACSCalibur&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>过滤除菌后，4 ℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>载体 pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>质粒 pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>载体 psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（无RNase）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; 引物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SO131&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>小鼠二抗（抗小鼠IgG，HRP标记抗体）</td><td>细胞信号技术公司</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

大多数真核生物RNA的加工过程由具有模块化结构的RNA结合蛋白（RBPs）介导，这些蛋白包含一个特异性结合前体mRNA靶标的RNA识别模块和一个效应结构域。此前，我们利用人源Pumilio 1蛋白中PUF结构域独特的RNA结合模式，构建了一种可编程的RNA结合支架，并以此开发了多种人工RBPs，用于调控RNA代谢。本文详细描述了一种构建工程化剪接因子（ESFs）的实验方案，该因子专门设计用于调控目标基因的可变剪接。本方案包括如何针对特定RNA靶标设计和构建定制化的PUF支架，如何通过将设计的PUF结构域与效应结构域融合来构建ESF表达质粒，以及如何利用ESFs调控目标基因的剪接过程。在本方法的代表性结果中，我们还介绍了使用剪接报告系统检测ESF活性的常用实验方法、ESF在培养的人源细胞中的应用，以及剪接变化所产生的后续效应。通过遵循本报告中详尽的实验步骤，研究人员可设计并生成用于调控不同类型可变剪接（AS）的ESFs，为研究剪接调控机制及不同剪接异构体的功能提供了一种新策略。此外，通过将不同的功能结构域与设计的PUF结构域融合，研究人员可构建靶向特定RNA的人工因子，以操控RNA加工过程中的多个步骤。

本报告介绍了外显子剪接增强子（ESF）及剪接报告系统的完整设计与构建方案，并概述了ESF在调控内源基因可变剪接（AS）中的进一步应用。16为了说明ESF介导的剪接变化的典型结果，我们以先前研究中的数据为例。具有不同功能结构域的ESF可用于促进或抑制目标盒式外显子的包含图1D &amp; E）。ESFs 还可影响报告系统中替代性 5' 和 3' 剪接位点的使用图1F &amp; G).
内源基因的选择性剪接也可通过设计的ESF实现特异性调控。我们以Bcl-x为靶点验证了这一应用，Bcl-x可通过不同的5'剪接位点产生两种功能拮抗的异构体。我们设计了一种ES...

本报告介绍了一种生物工程技术，用于设计和构建新型人工剪接因子（ASFs），以特异性调控哺乳动物细胞中靶基因的剪接过程。该方法可进一步拓展，用于构建多种人工因子，以操控RNA代谢的其他方面。

大多数真核生物RNA的加工由具有模块化结构的RNA结合蛋白（RBPs）介导，这些蛋白包含一个RNA识别模块，该模块……

本实验方案的总体目标是构建能够特异性调控特定靶标基因可变剪接的人工剪接因子。该方法有助于解答RNA加工领域中的关键科学问题，例如癌症细胞中可变剪接的调控机制及其异常调控。该技术的主要优势在于其高度的灵活性。我们可以设计出人工因子，以促进或抑制任意给定基因中的不同类型的可变剪接。演示该实验步骤的是我实验室的研究助理黄欢和博士后钱云。野生型 PUF DNA 被用作生成定制 PUF 结构域支架的模板。使用包含PUF序列的PCR引物，这些序列可特异性识别每个位置上的不同RNA核苷酸。针对每个PUF重复单元，使用四种不同的引物以识别各个位置上的不同碱基。在第一轮PCR中，使用所示的引物对生成四个PUF重复单元的编码序列、通用连接片段和帽片段。在第二轮中，以上一步生成的PCR产物为模板，使用所示的引物组合扩增出编码RNA识别序列R-one至R-four以及R-five至R-eight的序列。在第三轮中，以第二轮的产物并连接四至五的片段作为模板，使用R-one的上游引物和R-eight的下游引物，扩增出不含末端帽结构的R-one至R-eight编码序列。在第四轮PCR中，以R-one至R-eight、5'端帽和3'端帽为模板，扩增出完整的PUF结构域编码序列。开始转染HEK-293T细胞时，轻轻倒置脂质体转染试剂瓶以混匀试剂。然后每份转染反应中，在50微升低血清培养基中稀释2微升脂质体转染试剂。轻柔混匀后，于室温孵育5分钟。接下来，在无菌离心管中，将0.4微克富含甘氨酸结构域的表达载体和0.2微克模块化剪接报告质粒溶于50微升低血清培养基中。然后，将0.4微克RS效应结构域表达载体和0.2微克PGZ-three报告质粒溶于50微升低血清培养基中。最后，在无菌离心管中，将0.4微克PGL-RS-PUF表达载体和0.2微克PEZ-1B或PEZ-2F报告质粒溶于50微升低血清培养基中。室温孵育5分钟后，将稀释的脂质体转染试剂与稀释的质粒混合物轻轻混匀。将最终混合物在室温下孵育20分钟。然后将含有表达载体的转染混合物加入已接种HEK-293细胞的24孔板的各孔中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育至少12小时。孵育12小时后，通过胰蛋白酶消化和离心收集转染的细胞。离心后弃去上清液，每管加入0.5毫升RNA提取缓冲液。每个样本中按每0.5毫升RNA提取缓冲液加入0.1毫升氯仿。孵育结束后，将离心管在4°C、12,000 × g条件下离心15分钟。然后将水相转移至新的离心管中。按照初始匀浆时所用RNA提取缓冲液体积的每0.5毫升加入0.25毫升异丙醇。涡旋混匀，在室温下孵育10分钟。按照之前的方法进行离心后，RNA沉淀通常可见于管底。弃去上清液，每0.5毫升RNA提取缓冲液加入0.5毫升75%乙醇洗涤RNA沉淀。剧烈涡旋，然后在4°C条件下以7,500 × g离心5分钟。

engineering-artificial-factors-to-specifically-manipulate-alternative

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

工程人为因素来特异性地操纵人细胞中的选择性剪接

已证明可变剪接调控参与上皮-间质转化（EMT），EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍了一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT...

上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

本文描述了一种旨在研究异常剪接对实体瘤和血液系统恶性肿瘤耐药性影响的实验方案。为此，我们分析了亲本株和耐药株的转录组谱型 体外...

利用RNA测序检测与药物耐药性相关的新剪接变异体 体外 癌症模型

利用RNA对小鼠脑切片中pre-mRNA选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。...

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

本方案提供了一种快速且实用的工具，用于评估在化疗处理后功能尚未明确的蛋白质在选择性剪接调控中的作用。...

利用E1A微基因工具研究mRNA剪接变化

可变剪接（AS）和可变多聚腺苷酸化（APA）能够扩展转录本异构体及其产物的多样性。本文中，我们描述了用于分析整体RNA测序（bulk...

RNA-seq 数据中可变剪接与多聚腺苷酸化位点的鉴定

本方案描述了一种微型基因报告基因检测方法，用于监测5´剪接位点突变对剪接的影响，并开发了用于挽救突变所致剪接抑制的抑制性U1 snRNA。将报告基因和抑制性U1...

基于报告基因的细胞检测法用于监测剪接效率

为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。...

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

本方案描述了一种利用微电穿孔法高效转染新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞中siRNA，并鉴定这些细胞中DNA-蛋白质复合物的方法。在4天的培养期间，可通过Western印迹和EMSA分析对转染细胞进行监测。...

新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染及EMSA分析

本文介绍了在生理氧浓度条件下分析结合mRNA...

生理氧条件下人细胞中帽结合蛋白的分析

学习利用人工剪接因子特异性操控人细胞中的选择性剪接技术。该方法通过工程化PUF结构域实现基因剪接调控，为癌症等疾病中RNA代谢研究提供灵活工具。

在人类细胞中设计人工因子以特异性调控选择性剪接

探索更多视频