工程人为因素来特异性地操纵人细胞中的选择性剪接

该协议的总体目标是设计人工剪接因子，这些因子可以专门纵给定靶标的选择性剪接。该方法可以帮助回答 RNA 加工领域的关键问题，例如癌细胞中交替剪接的调节和失调。这种技术的主要优点是它的灵活性。

我们可以设计人工因子，促进或抑制任何给定基因中不同类型的交替剪接。演示此程序的将是我实验室的助理研究员 Huan-Huan 和我实验室的博士后 Qianyun。野生型 PUF DNA 用作生成定制 PUF 结构域支架的模板。

使用含有 PUF 序列的 PCR 引物，这些序列可特异性识别每个位置的不同 RNA 核苷酸。对于每个 PUF 重复，使用四种不同的引物来识别每个位置的不同碱基。在第一轮 PCR 中，使用所示的引物对生成四个 PUF 重复序列、通用桥片段和帽片段的编码序列。

在第二轮中，使用最后一步生成的 PCR 产物作为模板，显示引物组合以生成 RNA 识别代码 R-1 到 R-4 和 R-5 到 R-8 的编码序列。在第 3 轮中，使用第 2 轮和桥 4 到 5 的产物作为模板，使用 R-one 正向引物和 R-8 反向引物生成无帽的 R-1 到 R-8 编码序列。在第 4 轮 PCR 中，使用 R-1 到 R-8、5 个引物端盖和三个引物端盖作为模板，生成完整 PUF 结构域的编码序列。

要开始转染 HEK-293T 细胞，请轻轻倒置瓶子来混合脂质体转染试剂。然后，每次转染在 50 μL 还原血清培养基中稀释 2 μL 脂质体转染试剂。轻轻混匀，然后在室温下孵育 5 分钟。

接下来，在无菌管中的 50 μL 还原血清培养基中稀释 04 μg 富含甘氨酸的结构域表达载体和 0.2 μg 模块化剪接报告基因质粒。然后在 50 μL 减血清培养基中稀释 0.4 μg RS 效应结构域表达载体和 0.2 μg PGZ-three 报告质粒。最后，在无菌管中的 50 μL 减废血清培养基中稀释 0.4 μg PGL-RS-PUF 表达载体和 0.2 μg PEZ-1B 或 PEZ-2F 报告质粒。

在室温下孵育 5 分钟后，将稀释的脂质体转染试剂与稀释的质粒混合物轻轻混合。将最终混合物在室温下孵育 20 分钟。然后将含有表达载体的转染混合物加入接种有 HEK-293 细胞的 24 孔板的每个孔中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育至少 12 小时。

孵育 12 小时后，通过胰蛋白酶消化和离心收获转染的细胞。离心后，丢弃培养基，每管加入 0.5 mL RNA 提取缓冲液。向每个样品中每 0.5 毫升 RNA 提取缓冲液中加入 0.1 毫升氯仿。

孵育后，将试管以 12， 000 倍 G 和 4 摄氏度离心 15 分钟。然后将水性基质转移到新试管中。在初始匀浆中使用每 0.5 mL RNA 提取缓冲液中加入 0.25 mL异丙醇。

涡旋混匀，并在室温下孵育 10 分钟。像以前一样离心后，RNA 沉淀通常在试管底部可见。弃去上清液，每 0.5 mL RNA 提取缓冲液中加入 0.5 ml 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。

剧烈涡旋，然后在 4 摄氏度下以 7、500 倍 G 离心 5 分钟。离心后，去除上清液，风干 RNA 沉淀。将 RNA 溶解在 50 微升不含 RNase 的水中。

接下来，向每个 50 μL RNA 溶液中加入 2 μL（每微升 5 单位）DNase-one、7 μL 10X 缓冲液和 11 μL 水。孵育后，将溶液加热至 70 摄氏度 15 分钟以灭活 DNase。在进行逆转录酶反应以从每个样品中合成 cDNA 后，按照屏幕上显示的顺序将体标记的 PCR 反应组分添加到 PCR 管中。

每个样品准备一个反应。在热循环仪上运行 RT-PCR 程序。最后，通过含 TBE 缓冲液的 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCR 产物。

使用荧光扫描仪可视化产物，并使用光密度测定软件测量每种剪接亚型的量。对于测量细胞凋亡的免疫荧光测定，如前所述，制备含有富含甘氨酸的结构域表达质粒的转染混合物，并在六孔板中转染在聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上生长的 HeLa 细胞。转染后 24 小时，在室温下用 1 毫升 4% 多聚甲醛的 1x PBS 溶液固定细胞 20 分钟。

然后用 2 毫升 1x PBS 轻轻洗涤盖玻片上的细胞 5 分钟。接下来，用 0.2% Triton X-100 的 1x PBS 溶液透化细胞 10 分钟。像以前一样用 1x PBS 洗涤 3 次后，用 1x PBS 中的 3% 牛血清白蛋白阻断非特异性结合 10 分钟。

在 PBS 中的 3%BSA 中将 flag 抗体稀释 1 比 1， 000，然后将 30 微升稀释的 flag 抗体移液到封口膜片上。使用镊子取下盖玻片。用实验室湿巾小心擦干多余的缓冲液，然后将盖玻片单元的一面朝下放在防旗溶液上。

在室温下孵育 1 小时。孵育后，向盖玻片的细胞侧添加大约 500 微升 1x PBS，直到它漂浮在溶液顶部。将其放回六孔板中，孔中含有 1x PBS。

像以前一样，在封口膜上与二抗孵育 15 分钟。像以前一样洗涤，然后使用含有 DAPI 的安装介质将盖玻片安装在显微镜载玻片上。使用荧光显微镜观察细胞，并使用数码相机拍摄它们。

使用免疫荧光显微镜检查，许多表达 Gly-PUF-531 的细胞具有片段化的核 DNA，表明它们正在经历细胞凋亡。作为对照，与 Gly-PUF-531 转染细胞相比，表达 Gly-PUF 野生型的细胞具有较少的片段化核 DNA。在这里，使用与 DAPI 染色细胞合并的抗旗抗体的免疫荧光显微镜显示，Gly-PUF-531 主要位于转染细胞的细胞核中。

Gly-PUF 野生型也位于转染细胞的细胞核中，表明当完全剪接的 mRNA 被转运到细胞质中时，这些 ESF 会从其靶标上解离。具有片段化核 DNA 的凋亡细胞的百分比是从随机选择的荧光显微镜图像区域测量的。一旦掌握，如果作得当，可以在两天内完成具有 RNA 结合特异性的 PUF 支架的构建。

看完这个视频，你应该对如何通过工程人工因子来专门纵人类细胞中的选择性剪接有了很好的了解。