利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

该技术的总体目标是在体外捕获脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法有助于回答线粒体动力学领域中的问题，例如线粒体外膜上的蛋白质-蛋白质相互作用如何受到辅助脂质的影响。该技术的主要优势在于，将可溶性蛋白质结构域锚定在脂质模板上，能够实现更接近天然状态的构象。

此外，还可以在存在特定脂质辅因子的情况下，评估可溶性蛋白质与其锚定伴侣蛋白之间的复杂相互作用。尽管我们使用该方法研究线粒体分裂机制中的蛋白质相互作用，但它也可应用于定位于不同膜区室的其他蛋白质复合物。演示该实验操作的将是来自我实验室的研究生 Ryan。

首先，在洁净的玻璃试管中混合所需脂质的氯仿溶液。在旋转试管的同时，用干燥的氮气吹干溶剂，形成一层薄的脂质膜。然后在37摄氏度下，使用离心蒸发仪去除残留溶剂，持续一小时。

随后，加入预热的缓冲液A，使脂质终浓度为1至2毫摩尔。在37摄氏度孵育30分钟，期间偶尔涡旋振荡，以充分重悬脂质混合物。孵育结束后，将脂质混合物转移至塑料试管中，并将试管置于液氮中约30秒，直至完全冻结。

然后将离心管置于37摄氏度水浴中1至2分钟，直至完全解冻。接下来，通过将四个滤膜支撑架和一个聚碳酸酯滤膜浸泡在缓冲液A中，并按照制造商的说明组装脂质挤出器，以准备脂质挤出装置。使用温和且恒定的压力，将脂质溶液通过滤膜挤出21次，以确保粒径分布均匀。

挤出时，应使用缓慢且恒定的压力，以确保脂质体粒径均一。使用1微米滤膜时，此操作的影响较小；但使用更小孔径的滤膜时，操作不当可能引入更明显的异质性。

将挤出的脂质体在 4 摄氏度保存。在缓冲液 A 和 BME 中，于室温下将带有 His 标签的线粒体分裂因子（Mff）与支架脂质体孵育至少 15 分钟。作为无 Mff 的对照，将脂质体与带有 His 标签的对照蛋白（如 GFP）孵育，以结合并屏蔽暴露的镍-NTA 位点。

向脂质体混合物中加入动力相关蛋白1（Drp1），并在室温下孵育一小时。接着，取五微升样品滴加到实验室专用膜上，将覆有碳膜的铜-铑网格置于样品上方。孵育一分钟后，用滤纸吸去多余液体，再加入一滴2%醋酸铀酰溶液。

再孵育一分钟后，用滤纸吸除多余的染色液，并将样品转移至网格盒中。次日，使用透射电子显微镜在18,500至30,000倍放大倍数下对样品进行成像，以观察蛋白质和脂质体形态的超微结构变化。将His标签标记的Mff和Fis1与支架脂质体在缓冲液A和BME中于室温孵育15分钟。

加入Drp1，并在室温下将每种混合物再孵育15分钟。将试管转移至设定为37摄氏度的热循环仪中，通过加入GTP和氯化镁启动反应。在预定的时间点，取每种反应混合物20微升转移至含有5微升0.5摩尔EDTA的微孔板孔中，以螯合镁离子并终止反应。

随后，通过将磷酸钾用缓冲液 A 和 BME 稀释，配制一系列磷酸盐标准品，以校准实验结果。将每种标准品各 20 微升加入含有 5 微升 0.5 摩尔 EDTA 的孔中。向每个孔中加入 150 微升孔雀石绿试剂。

最后，每次加入试剂后五分钟读取 650 nm 处的光密度值。在酸性孔雀绿试剂存在下，GTP 会缓慢水解。因此，为最大化信噪比，应在测量吸光度后的 10 分钟内将该试剂加入所有样品孔中。

在缺乏 Drp1 的情况下，Mff 或 GFP 均未引起膜变形。对于 GFP 装饰的富含支架的脂质体（ESL），仅观察到无特征的脂质体。然而，当将 Drp1 添加至 Mff 装饰的 ESL 模板时，脂质体的重塑现象明显可见。

SL 与 Mff 的结合增强了 GTP 酶活性。相反，当暴露的 NTA 头基团被 His 标签 GFP 封闭后，这种增强的 GTP 酶活性被消除。将缺失跨膜结构域的 Fis1 锚定到 SL 上，同样未能引起 Drp1 GTP 酶活性的增强。

与SL类似，将SL/Cl添加至Drp1后，GTP酶活性出现轻微增强，而当His标签Fis1或GFP被锚定到脂质体上时，该增强作用被逆转。Mff与心磷脂之间存在协同效应，当Drp1与Mff修饰的SL/CL共同孵育时，其GTP酶活性提高了2.6倍。当SL/PE/CL模板被Mff修饰后，Drp1的活性也得到增强。

通过向支架脂质体中添加磷脂酰乙醇胺（PE），Drp1 将脂质体重塑为脂质小管的能力得到增强。只要熟练掌握，若操作得当，这些支架可在数小时内完成制备并投入使用。按照本方案操作后，还可进一步开展其他蛋白质与脂质相互作用的研究方法，如沉降实验和光散射分析，以表征其功能相互作用。

该技术的应用使得研究人员在研究蛋白质向特定生物膜转位时，能够探索瞬时的蛋白质相互作用以及特定脂类辅因子在关键细胞复合物形成与稳定过程中的影响。