三维全心心肌组织分析

Narrator}本方案的总体目标是建立一种结构化且可重复的三维全心组织处理方法，用于评估心肌内注射至梗死边缘区的靶向准确性。该方法有助于回答心血管再生医学领域的一些关键问题，例如注射技术的实践发展与优化。该技术的主要优势在于，它为三维全心组织处理提供了一种标准化且可重复的方法。

该技术的应用前景包括推动心脏再生治疗的发展，以及验证常规递送技术的注射准确性。这种心脏干细胞治疗的目标是将细胞注射至梗死边缘区域，以刺激局部血管生成并保护心肌细胞。在舒张末期捕捉心脏图像需要练习和耐心。

这些步骤的可视化演示至关重要。首先将心包从注射了微珠的心脏上分离，保持心房和心室的完整。当所有周围组织均被清除后，使用克氏剪刀在主动脉瓣上方约一厘米处解剖升主动脉，并在距心房约一厘米处剪断下腔静脉和肺静脉。

将心脏心尖固定在塑料包埋容器底部以防止漂浮后，用2-0缝线穿过主动脉剩余部分并缝合至容器边缘，以固定心脏。注意确保心脏位于中心位置，且不接触容器壁。当器官被固定于类似舒张末期的几何形态时，用蚊式钳夹住下腔静脉，通过上腔静脉用50毫升注射器缓慢注入新配制的50至60摄氏度的琼脂，直至右心房和右心室完全充满。

为了获得尽可能接近舒张末期几何形态的嵌入式心脏，需将左心室心尖固定在容器底部，并在夹闭肺静脉的同时向右心室注入琼脂。接着，用蚊式钳夹住肺静脉，将一支新装满琼脂的50毫升注射器经主动脉瓣逆行缓慢插入。然后缓慢将溶液注入左心室，直至左心室和左心房完全充满，待左心室填充完毕后夹闭主动脉。

现在，将剩余的琼脂倒入容器中，直至心脏完全被覆盖，并在包埋容器内放置两根硬质塑料管，作为图像配准时的参考结构。然后将心脏置于 2 至 7 摄氏度环境中至少 4 小时，使琼脂凝固。磁共振成像完成后，将容器倒置，使空气进入琼脂与容器壁之间，从而将凝固的琼脂和心脏从容器中取出。

移除塑料棒。然后使用切肉机从心尖到心脏基底部，将琼脂块和心脏切成5毫米厚的切片，切割方向需平行于琼脂块底部，以保持切片角度与所获取的磁共振图像一致。在获得所有切片后，用TTC对组织样本进行染色。

15分钟后，从两侧垂直角度拍摄切片照片，然后用0.9%生理盐水小心冲洗切片。若需通过荧光显微镜成像，请在多模式扫描仪上选择荧光成像模式，并将像素大小设置为100 × 100微米。对于第一滤光块，选择一个与通道一中微珠荧光发射波长重叠的带通滤光片；对于第二滤光块，则选择一个位于通道二发射波长范围之外的带通滤光片。

接下来，选择合适的滤光片组，将光电倍增管调至适当的电压，并将激发激光的波长设置为最接近所注射微珠的激发波长。在获取所有图像后，使用相应的后期处理软件，在磁共振图像中对心肌以及左心室的内膜和外膜边界进行分割，随后在荧光图像中对心肌和注射位点进行类似的分割。然后，对切片两侧的图像配准后的分割区域进行线性插值，以重建原始样本厚度，并创建数据的三维模型。

将心脏固定在类似舒张末期的几何形态后，在本代表性实验中，琼脂成功黏附于心脏组织，使组织能够以理想的倾斜角度被切割，并保证各切片厚度均一。在二维荧光成像和磁共振成像中，瘢痕区域与注射位点均清晰可辨。TTC染色组织与延迟钆增强磁共振成像可为荧光成像中的瘢痕评估提供对照。

后期图像处理能够基于分割结果和荧光图像重建离体心脏的三维几何结构，从而评估三维注射定位的准确性。在本研究中，注射沉积区域和梗死边缘区被投射至心内膜壁上，并测量其在心内膜表面投影之间的距离。通过该方法，可进一步开展其他分析，如手术评估、梗死面积定量，或其他三维成像模态的验证。

我们已采用该技术评估向梗死边缘区注射的准确性。本研究旨在改善心力衰竭的心脏再生治疗。观看本视频后，您应能够充分掌握心脏组织的制备、心脏组织的包埋与处理，以及心脏组织样本的荧光成像操作方法。