洞察氨基酸和多肽与无机材料的使用相互作用的单分子力谱
2017年3月6日
在这里，我们提出了一个协议使用原子力显微镜（AFM）测量由单分子力光谱测量相互作用的定义明确的无机表面和任一的肽或氨基酸之间的力。从测量中获得的信息是重要的，以便更好地了解肽 - 无机材料相间。
单分子力谱技术的总体目标是确定具有不同表面的氨基酸或肽之间相互作用的粘附力和性质。该物质可以帮助回答表面化学领域的关键问题，并用于开发新的复合材料和脊索酸盐。该技术的主要优点是它提供了有关所需分子和表面之间相互作用的单分子水平信息。
首先，购买氮化硅 AFM 悬臂，该悬臂配备有标称悬臂半径为 2 纳米的硅尖端。将尖端安装在支架上。将每个 AFM 悬臂浸入乙醇中 20 分钟，然后在室温下干燥，以清洁它们。
接下来，将尖端放入等离子室中，并通过将悬臂暴露在氧气等离子体中 5 分钟来处理悬臂。制备含有 15 份甲基三乙氧基硅烷和 1 份三氨基丙基三乙氧基硅烷的溶液，并在惰性气氛下将导管悬浮在溶液上方 3 厘米处。重要的是，尖端和支架不要接触硅烷混合物。
此外，硅烷对水分高度敏感，因此需要在惰性气氛中进行这些吸头。密封后，将干燥器连接到真空泵上，并施加真空两个小时，以在悬臂表面形成两种混合硅烷化合物的单层。小心地取出尖端，将它们放在预热至 70 摄氏度的热板上。
让尖端晾干 10 分钟。在室温下冷却尖端，然后在室温下将它们浸入 Fmoc-PEG-NHS 溶液中 1 小时。接下来，将吸头浸入氯仿中 5 分钟，然后再浸入 DMF 中 5 分钟。
在 DMF 中孵育后，将吸头浸入 DMF 中的 20% 哌啶溶液中 30 分钟，以解除对附着 PEG 分子的 Fmoc 基团的保护。再次将尖端浸入 DMF 中 4 分钟，然后在 N-甲基-2-吡咯烷酮中再浸入 4 分钟。要将氨基酸偶联到尖端上，将其浸入总浓度为 30 毫摩尔和 5 毫升 N-甲基-2-吡咯烷酮的氨基酸偶联溶液中一个半小时。
为了通过乙酰基保护剩余的游离或未反应的 PEG 残基，将尖端浸入 0.65 摩尔的四份乙酐和一份二异丙基乙胺和 N-甲基-2-吡咯烷酮的混合物中 30 分钟。然后依次将肽氨基酸官能化吸头浸入 NMP、氯仿、50% 乙醇和水中各 4 分钟，最后在空气中干燥吸头。用市售的环氧树脂将所需的测试表面连接到 AFM 的金属支架上。
然后，将金属支架放入 AFM 的玻璃支架中，该玻璃支架的形状为一个小培养皿。用 TRIS 缓冲液填充玻璃架。然后将金属支架放在针尖支架下方的 AFM 载物台上。
接下来，将 AFM 针尖安装在 AFM 的光学玻璃上。将光学玻璃块放入 AFM 头中。并将 AFM 头放在舞台上。
接下来，用每纳米 10 到 30 皮顿的弹簧常数校准 AFM 悬臂。典型的力测量会产生如图所示的力距离曲线。第一次窥视表示尖端和表面之间的非特异性相互作用，第二次窥视是指特定的粘附事件。
从几百条力距离曲线中，可以通过绘制粘附事件的数量与力的关系来构建直方图。在这些直方图上应用高斯拟合将确定最可能的力。看完这个视频，您应该对如何用氨基酸或肽对 AFM 针尖进行化学修饰以及如何使用 AFM 进行单分子力谱分析有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种使用原子力显微镜（AFM）的单分子力谱技术来测量无机表面与肽或氨基酸之间相互作用力的协议。理解这些相互作用对于推进表面化学和材料开发方面的知识至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 表面化学
- 单分子力谱学
- 材料科学
背景
- 单分子力谱学可以在分子水平上测量粘附力。
- 这种技术可以提供关于肽或氨基酸与各种表面之间相互作用的见解。
- 理解这些相互作用对于开发新的复合材料和材料至关重要。
- 在这种情况下使用AFM提高了测量的精确度。
研究目的
- 确定肽或氨基酸与无机表面之间的粘附力。
- 探索单分子水平上的分子相互作用的性质。
- 为表面化学和材料设计的进步做出贡献。
使用的方法
- 使用带有硅尖端的硅氮化物AFM弹簧片。
- 在测量前用乙醇清洁AFM弹簧片。
- 使用AFM技术测量相互作用力。
- 分析数据以理解肽-无机材料界面。
主要结果
- 成功测量了肽/氨基酸与表面之间的粘附力。
- 提供了分子水平上相互作用性质的见解。
- 在新材料开发中的潜在应用。
- 提高了对肽-无机材料界面的理解。
结论
- 该协议提供了一种研究分子相互作用的可靠方法。
- 研究结果可以为表面化学和材料科学的未来研究提供信息。
- 单分子力谱学是理解粘附力的有价值工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding molecular-level interactions between biomolecules and inorganic surfaces supports target validation in biomaterials development and reduces mechanistic uncertainty in early-stage discovery. Single-molecule force spectroscopy enables quantitative assessment of adhesion forces, providing predictive confidence for material-biocompatibility screening. This approach aids in de-risking hypotheses related to biofouling, composite design, and surface functionalization prior to translational investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures adhesion forces between amino acids/peptides and surfaces to interrogate molecular recognition hypotheses.
- Operational Value: Provides single-molecule resolution to distinguish specific from non-specific interactions in target engagement studies.
- Predictive Value: Enables force-based discrimination of binding modes to support lead identification in biomaterial design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative adhesion force histograms for standardized comparison across peptide variants or surface chemistries.
- Operational Value: Uses AFM-based force-distance curves to establish reproducible, label-free interaction assays.
- Assay Readiness: Enables high-content force mapping to guide selection of peptide sequences for downstream screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular interaction data to biofilm formation mechanisms relevant to implant-associated infection models.
- Preclinical Modeling: Supports evaluation of peptide-inorganic interfaces in disease-relevant systems such as catheter or sensor surfaces.
- Risk Mitigation: Informs material selection by quantifying biofouling propensity through single-molecule adhesion metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where mechanistic de-risking of target-surface interactions precedes assay development and lead optimization.
- Discovery Biology: Tests thermodynamic and kinetic aspects of peptide-surface binding to clarify binding mechanisms.
- Screening: Produces force distribution outputs that enable ranking of peptide candidates by adhesion strength.
- Analytics: Applies Gaussian fitting to adhesion event histograms to extract most probable force values for quantitative decision-making.
- Translational Research: Connects force measurements to biofouling risk assessment in medical device-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable platform for screening diverse biomolecules against varied inorganic coatings or nanomaterials.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces ambiguity in interaction mechanisms by providing direct force measurements at single-molecule resolution.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible force spectroscopy data across laboratories and material systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in biomaterial development by quantifying interfacial stability early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of peptide candidates based on surface interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, surface chemistry, and peptide handling under inert conditions.
- Depends on access to AFM systems with functionalized cantilevers and vibration isolation for sensitive force measurements.
- Necessitates standardization of silanization, PEGylation, and coupling protocols across users to ensure tip consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to different peptide lengths, surface chemistries, or buffer conditions.
- Limited by the throughput of single-molecule measurements and the need for hundreds of force curves to build reliable histograms.
