Name: 洞察氨基酸和多肽与无机材料的使用相互作用的单分子力谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 了解单分子力光谱技术用于测量氨基酸或多肽与无机材料表面之间的粘附力和相互作用性质。该方法利用原子力显微镜在单分子水平上提供精确的分子相互作用信息，有助于表面化学和材料设计的发展。

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本工作由玛丽·居里国际回归基金（EP7）资助。P. D. 感谢以色列高等教育委员会提供的支持。

1. 针尖修饰
<ol>
	<li>购买带有硅探针的氮化硅（Si3N4）原子力显微镜（AFM）悬臂梁（标称悬臂梁半径约为 2 nm）。</li>
	<li>将每个AFM悬臂梁浸入无水乙醇中清洗20分钟，在室温下干燥，然后将其暴露于O2等离子体中处理5分钟。</li>
	<li>将清洁后的探针悬置于含有甲基三乙氧基硅烷和3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷（体积比为15:1）的溶液上方约3 cm处，置于惰性气氛（氮气或氩气）下的干燥器中，并将干燥器连接至真空泵。抽真空2小时，以形成这两种混合硅烷化合物的单分子层。</li>
	<li>使用专为此过程制备的金属探针夹具将探针放置于加热板上，然后在大气条件下于70 °C干燥10分钟。使用前，用乙醇清洁加热板、金属夹具和镊子。</li>
	<li>将探针在室温下冷却，随后将其浸入含5 mM浓度的芴甲氧羰基-聚乙二醇-氮羟基琥珀酰亚胺（Fmoc-PEG-NHS，分子量5,000 Da）的氯仿溶液中，该溶液另含0.5%（v/v）三乙胺，反应1小时。</li>
	<li>将探针在氯仿中浸洗5分钟，再在二甲基甲酰胺（DMF）中浸洗5分钟。为脱除连接的PEG分子上的Fmoc保护基团，将探针在含20%（v/v）哌啶的DMF溶液中浸泡30分钟。随后将探针在DMF中浸洗4分钟，再在N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中浸洗4分钟。重复此顺序浸洗步骤三次。</li>
	<li>进行氨基酸偶联时，将探针浸入5 mL NMP溶液中，该溶液含有N端保护的氨基酸（AA）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），三者摩尔比为1:1:1，总浓度为30 mM，反应1.5小时。</li>
	<li>进行肽段偶联时，将探针浸入5 mL溶液中，该溶液含有40 mg保护肽（N端及侧链均保护，例如Fmoc-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Tyr(tBu)-COOH）、15 mg 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）以及DIPEA，溶剂为NMP，反应2小时。</li>
	<li>将探针在NMP中浸洗4分钟。随后，为用乙酰基保护剩余未反应的游离NH2基团，将探针在乙酸酐与DIPEA摩尔比为4:1、总浓度为0.65 M的NMP溶液中浸泡30分钟。</li>
	<li>进行肽段偶联时，需额外执行以下两个步骤。
	<ol>
		<li>为脱除肽段的侧链保护基团，将探针浸入含95%三氟乙酸（TFA）、2.5%三异丙基硅烷和2.5%水的溶液中反应1小时，随后用氯仿和DMF洗涤。</li>
		<li>为脱除肽段的Fmoc保护基团，将探针浸入含20%（v/v）哌啶的DMF溶液中30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将已功能化修饰有肽段或氨基酸的探针依次在DMF（用于肽段）或NMP（用于氨基酸）、氯仿、50%乙醇和水中各浸洗4分钟。最后在空气中干燥探针。</li>
</ol>
2. 表面准备
<ol>
	<li>准备云母片。每次使用前用透明胶带剥离基底（直径9.9 mm），然后用三蒸水（TDW）清洗表面。</li>
	<li>制备TiO2涂层硅片。
	<ol>
		<li>使用金刚石笔将（100）硅片切割成2 cm的正方形。</li>
		<li>将基底放入盛有丙酮的15 mL试管中，在超声波清洗仪中超声5分钟。随后将基底转移至盛有异丙醇的15 mL试管中，超声5分钟。用氮气吹干基底。</li>
		<li>将表面活性剂（例如，Byk-348）溶于乙醇中，配制成5%（质量/体积）的溶液。然后向2 mL 30% TiO2分散液中加入0.02 mL该表面活性剂溶液。</li>
		<li>从所得溶液中取0.2 mL滴涂于洁净的Si基底上。</li>
		<li>将滴涂后的基底在空气中250 °C下退火2小时。41</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单分子力谱测量
<ol>
	<li>将所需表面用市售双组分胶水固定到原子力显微镜（AFM）的金属样品台上。将该金属样品台放入原子力显微镜的玻璃样品架中，该玻璃样品架呈小型培养皿状&#160;培养皿。向此样品槽中加入Tris缓冲液（50 mM，pH = 7.4）或任何所需培养基。然后，将样品槽置于原子力显微镜（AFM）载物台上，位于探针夹持装置下方。</li>
	<li>使用热波动法校准弹簧常数在10至30 pN/nm范围内的AFM悬臂梁26 （包含在原子力显微镜软件中），绝对不确定度约为10%。</li>
	<li>通过将氨基酸或肽功能化的探针接近基底，直至其与基底接触并产生约200 pN的压缩力，然后以0.1至0.8 µm/s的不同速度立即回撤探针约200 nm的距离，测量相互作用力。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>通过将光敏二极管灵敏度（V/m）与实验测定的弹簧常数相乘，将偏转值（V）转换为力。42 这由原子力显微镜软件自动完成。
	<ol>
		<li>为获得包含单分子事件的力-距离曲线，需记录数百条曲线（800–1,500条）。单分子曲线中应出现两个峰：第一个峰代表探针与表面之间的非特异性相互作用，第二个峰对应分子与表面之间的特异性相互作用。当力-距离曲线包含多于这两个峰时，应将其排除在最概然力的计算之外。 
		注意：仅考虑单个黏附事件（占曲线的10%至30%）。43</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为计算表观加载速率，需使用蠕虫状链（WLC）模型拟合至少50条力-距离曲线44 在即将发生断裂前获取一组加载速率，用于绘制表观加载速率的直方图。通过悬臂梁与基底分离后力的跳跃，推导出肽/氨基酸与表面之间的解离力。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在操作步骤1.3、1.4和1.7时应格外小心，并以极其轻柔的方式进行。在步骤1.3中，移液枪头不应与硅烷混合物接触，且硅烷化过程应在惰性气氛（无湿气）中进行45。这是为了防止多层结构的形成，因为硅烷分子在水分存在下极易发生水解45。
在步骤1.4中，应适当控制温度和时间。在开始步骤1.5之前，须将小柱冷却至室温；否则小柱可能受损。在偶联步骤（1.7）中，HBTU与待测氨基酸或肽应完全溶解于混合液中。偶联完成后，须用不同溶剂以非常温和的方式洗涤小柱，以避免对小柱造成任何损伤。
该报道的技术可应用于任何肽或氨基酸。为了修饰硅探针，我们使用硅烷化合物。这是一种通用的化学方法，可以进行调整。例如，可以使用一种或两种聚乙二醇化硅烷来修饰探针表面。23,25,26</su...

蛋白质与无机矿物之间的相互作用可形成具有独特性质的复合材料，包括具有高强度机械性能或特殊光学性质的材料。1,2 例如，蛋白质胶原与矿物羟基磷灰石的结合可形成具有不同功能的软骨或硬骨。 3 短肽也能够以高特异性结合无机材料。 4,5,6 这些肽的特异性已被用于设计新型磁性与电子材料7,8,9、制备纳米结构材料、晶体生长 10以及合成纳米颗粒。11 因此，理解肽或蛋白质与无机材料之间相互作用的机制，将使我们能够设计出具有更优吸附性能的新型复合材料。此外，由于植入物与免疫反应之间的界面由蛋白质介导，更深入地理解蛋白质与无机材料的相互作用将提升我们设计植入物的能力。另一个涉及蛋白质与无机表面相互作用的重要领域是防污材料的制备。12,13,14,15 生物污损是一种不希望发生的生物体附着于表面的过程，对人类生活造成诸多不利影响。例如，细菌在医疗器械上的生物污损会导致医院获得性感染；海洋生物在船只和大型船舶上的污损会增加燃料消耗。12,16,17,18
利用原子力显微镜（AFM）的单分子力谱技术（SMFS）可直接测量氨基酸或肽与基底之间的相互作用。19,20,21,22,23,24,25,26 其他方法如噬菌体展示技术27,28 、石英晶体微天平（QCM）29或表面等离子体共振（SPR）29,30,31,32,33则用于在整体水平上测量肽和蛋白质与无机表面的相互作用。34,35,36 这意味着这些方法所得结果反映的是分子集合体或聚集体的行为。在SMFS中，将一个或极少数分子固定于AFM探针尖端，进而测量其与目标基底之间的相互作用。该方法还可拓展用于通过从表面拉伸蛋白质来研究蛋白质折叠过程。此外，它也可用于测量细胞与蛋白质之间的相互作用，以及抗体与其配体的结合。37,38,39,40 本文详细描述了如何利用硅醇化学方法将肽或氨基酸连接至AFM探针尖端。此外，本文还解释了如何进行力测量以及如何分析结果。

<table><tbody><tr><td>带硅探针的氮化硅（Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）原子力显微镜悬臂</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10，悬臂名义半径约 2 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲基三乙氧基硅烷&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>用于原子力显微镜探针的硅烷化&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>用于原子力显微镜探针的硅烷化</td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>用于多肽去保护</td></tr><tr><td>N-乙基二异丙基胺</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>用于探针修饰</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>用于探针修饰</td></tr><tr><td>哌啶</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>用于探针Fmoc去保护</td></tr><tr><td>芴甲氧羰基-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺（Fmoc-PEG-NHS）&amp;nbsp;</td><td>Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)</td><td></td><td>用作共价柔性连接臂&amp;nbsp;（分子量 = 5,000 Da）</td></tr><tr><td>2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）</td><td>Alfa Aser (Heysham, England)</td><td></td><td>用作偶联试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>用于探针修饰过程中的溶剂</td></tr><tr><td>DMF（二甲基甲酰胺）</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td>用于探针修饰过程中的溶剂</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Bio-Lab (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>用于探针修饰过程中的溶剂</td></tr><tr><td>乙醇（无水）</td><td>Gadot (Netanya, Israel)</td><td></td><td>用于探针修饰过程中的溶剂</td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多肽</td><td>GL Biochem (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯丙氨酸和酪氨酸&amp;nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Germany)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% 二氧化钛（TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）分散液，溶剂为2-(2-甲氧基乙氧基)乙醇（DEGME）和3-乙氧基丙酸乙酯（EEP）的混合物</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>（30%）溶于2-(2-甲氧基乙氧基)乙醇（DEGME）和3-乙氧基丙酸乙酯（EEP）的混合溶剂中。用于制备TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;基底</td></tr><tr><td>云母基底</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)</td><td></td><td>直径 9.9 mm</td></tr></tbody></table>

利用单分子力谱研究氨基酸和肽与无机材料相互作用的机制

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

蛋白质或肽与无机材料之间的相互作用会引发多种有趣的物理化学过程。例如，将蛋白质与无机矿物结合可形成具有独特性能的复合材料。此外，生物污损（biofouling）这一不利过程始于生物分子（主要是蛋白质）在材料表面的吸附，所形成的有机层为细菌提供了附着基础，使其能够与表面发生相互作用。因此，理解调控有机-无机界面相互作用的基本作用力，对于光学、力学及生物医学应用中的新材料设计等多个研究领域均具有重要意义。本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）测量肽或氨基酸与明确表征的无机表面之间黏附力的单分子力谱技术。该技术包括通过共价柔性连接臂将生物分子固定于AFM探针尖端的实验方案，以及利用原子力显微镜进行单分子力谱测量的方法。此外，还包含了对这些测量数据的分析方法。

图1展示了针尖修饰的流程。第一步中，通过等离子体处理改变氮化硅针尖的表面，使其表面生成羟基（OH基团），这些基团随后与硅烷发生反应。此步骤结束后，针尖表面将被游离的-NH2基团覆盖。这些游离的氨基随后与Fmoc-PEG-NHS（一种共价连接剂）发生反应。PEG连接剂中的Fmoc基团通过去保护试剂哌啶去除。最后，利用偶联试剂HBTU，将待研究的氨基酸或肽分子通过PEG上的游离氨基进行偶联。
使用经过修饰的AFM探针，可以检测氨基酸或肽与表面之间的相互作用（图2）。PEG分子将肽或氨基酸与探针尖端隔开，使其能够自由取向。典型的力测量结果为力-距离曲线（图3）。该曲线具有探针与表面分离的特征点，以及单分子黏附事件。第一个峰代表探针与表面之间的非特异性相互作用，第二个峰则对应特异性黏附事件。通过对数百条力-距离曲线进行分析，可绘制黏附事件...

本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）通过单分子力谱测量技术，研究明确定义的无机表面与肽或氨基酸之间相互作用力的实验方案。该测量所获得的信息对于深入理解肽-无机材料界面具有重要意义。

蛋白质或肽与无机材料之间的相互作用会引发多种有趣的物理化学过程。例如，将蛋白质与矿物质结合……

单分子力谱技术的总体目标是确定氨基酸或肽与不同表面之间相互作用的黏附力及作用性质。这一问题的研究有助于回答表面化学领域中的关键问题，并可用于新型复合材料和脊索动物的开发。该技术的主要优势在于，它能够在单分子水平上提供目标分子与表面之间相互作用的信息。首先，购买带有硅探针的氮化硅原子力显微镜（AFM）悬臂梁，其标称悬臂梁半径为2纳米。将探针安装到支架上。通过将每个AFM悬臂梁浸入乙醇中20分钟进行清洗，然后在室温下干燥。接下来，将探针放入等离子体腔室中，用氧气等离子体处理悬臂梁5分钟。制备含有15份甲基三乙氧基硅烷和1份3-氨基丙基三乙氧基硅烷的溶液，并在惰性气氛下将悬臂梁悬置于溶液上方3厘米处。注意探针和探针 holder 不得接触硅烷混合物。此外，硅烷对湿气高度敏感，因此这些操作必须在惰性气氛中进行。密封后，将干燥器连接至真空泵，并抽真空两小时，以在悬臂梁表面形成两种混合硅烷化合物的单分子层。小心取出探针，将其放置于预热至 70 摄氏度的加热板上。将探针头静置干燥10分钟。随后在室温下冷却，再将其浸入Fmoc-PEG-NHS溶液中，于室温下反应1小时。接着，将探针头浸入氯仿中5分钟，然后再转入DMF中浸泡5分钟。在DMF中孵育后，将探针尖端浸入含20%哌啶的DMF溶液中30分钟，以脱除连接的PEG分子上的Fmoc保护基团。随后，再次将探针尖端浸入DMF中4分钟，接着浸入N-甲基-2-吡咯烷酮中额外4分钟。为将氨基酸偶联至探针尖端，将其浸入氨基酸偶联溶液中1.5小时，该溶液总浓度为30毫摩尔每升（mmol/L），并含有5毫升N-甲基-2-吡咯烷酮。为了用乙酰基保护剩余的游离或未反应的 PEG 残基，将探针尖端浸入由四份乙酸酐、一份二异丙基乙胺和 N-甲基-2-吡咯烷酮组成的 0.65 摩尔混合液中，持续 30 分钟。随后依次将带有肽氨基酸功能化修饰的探针尖端分别浸入 NMP、氯仿、50% 乙醇和水中，每次各 4 分钟，最后在空气中干燥探针尖端。使用市售环氧树脂将所需的测试表面固定在原子力显微镜（AFM）的金属样品台上。然后，将金属支架放入原子力显微镜（AFM）的玻璃支架中，该玻璃支架呈小型培养皿形状。用TRIS缓冲液填充玻璃支架，再将金属支架放置在探针支架下方的AFM载物台上。接下来，将原子力显微镜（AFM）探针安装到AFM的光学玻璃上。将光学玻璃块放入AFM探头中，并将AFM探头放置在载物台上。接下来，校准弹簧常数范围为10至30皮牛顿每纳米的原子力显微镜悬臂梁。一次典型的力测量会得到力-距离曲线，如图所示。第一个峰表示针尖与表面之间的非特异性相互作用，第二个峰则对应特异性黏附事件。通过数百条力-距离曲线，可以绘制黏附事件数量与作用力的关系直方图。对这些直方图进行高斯拟合，可确定最可能的作用力值。观看本视频后，您应能充分理解如何利用氨基酸或肽对原子力显微镜

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洞察氨基酸和多肽与无机材料的使用相互作用的单分子力谱

本视频演示了使用傅里叶变换红外光谱法研究淀粉样肽自组装形成富含β片层的超分子结构的过程。将一束红外光穿过具有高折射率的晶体，记录晶体与样品界面处的能量吸收情况。通过分析样品蛋白质在红外光谱特定区域的特征吸收峰，可鉴定其二级结构，从而有助于确认超分子组装体的形成。...

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