饲养并在隐藏甲壳虫双链RNA介导的基因敲除，白腹皮蠹

该程序的总体目标是探索 Dermestes maculatus 中的基因功能，这是一种新的昆虫模型系统，代表了甲虫的不同分支，并促进了基础和应用研究问题的研究。这种方法可以通过测试 Dermestes 胚胎和成人的基因功能来帮助回答发育生物学、进化生物学等领域的关键问题。该技术的主要优点是 RNA 干扰可用于靶向任何基因，仅基于序列信息，即使没有完整的基因组序列也是如此。

这里介绍的方法不仅提供了一种研究 Dermestes 基因功能的方法。它们还可以用于开发新的昆虫模型系统，并可能用于控制害虫。要为 D.maculatus 准备饲养笼，首先将一层薄薄的木屑铺入一个中等大小的昆虫笼中。

将一段聚苯乙烯泡沫塑料放入笼子中，让幼虫有一个化蛹的环境。在笼子里加入 20 到 50 只成年甲虫或晚龄幼虫。将湿猫粮放入培养皿或称重舟中，作为食物来源。

用网布盖住笼子，然后将其放入培养箱中。在开始胚胎收集之前，首先仔细检查笼子里是否有任何胚胎并取出它们。笼子清理干净后，将一个拉伸的棉球放入笼子中，并在 30 摄氏度下孵育菌落。

在适当的时间窗口之后，收集棉球，带走在场的任何成虫，然后将它们放回笼子中。在一张黑色的建筑纸上，轻轻捏住棉球，慢慢撕成细丝，这样任何存在的鸡蛋都会落在黑纸上。取一个标准的培养皿盖，用一张黑色滤纸盖住内部。

沿着标准显微镜载玻片的边缘粘贴一条双面胶带。将显微镜载玻片放在培养皿盖中的黑色滤纸上。拿起含有收集的胚胎的纸，轻轻敲击以将胚胎转移到培养皿盖上。

使用画笔，将胶带上的胚胎垂直于载玻片对齐，前端或后端朝向边缘。要开始 RNAi，首先将 2-4 μL dsRNA 加入 20 μL 微量加载器移液器吸头中。将吸头插入预先拉好的玻璃毛细管（称为针头），然后轻轻地将溶液移液到针头中。

将针头固定到玻璃毛细管支架中，然后将毛细管支架组装到显微作器中。接下来，小心地将载玻片与胚胎一起转移到解剖显微镜的载物台上。移动载玻片，将一个胚胎带入视野中心并聚焦显微镜。

在观察解剖镜的同时，用显微作器定位毛细管的尖端。将尖端靠近行中第一个胚胎的末端。打开氮气或空气供应，然后将电磁阀输入选择开关设置为真空。

设备，将喷射压力调节器调整到 10-15 psi。打开毛细管，有色的 dsRNA 溶液将充满尖端，准备注射。向前移动毛细管尖端，轻轻刺穿胚胎。

在理想的压力设置下，没有胚胎液会流入毛细管。踩下脚踏开关，将 dsRNA 弹出到胚胎中，直到分配适量。将尖端留在胚胎内约两秒钟，然后小心地将其取出。

注射完所有胚胎后，将载玻片放入培养皿中。在培养皿中加入一个湿棉球，注意不要让它接触到载玻片。盖上培养皿并用密封膜包裹。

用 dsRNA 类型、浓度、日期、时间和注射胚胎的数量标记它。最后，将培养皿放入 30 摄氏度的培养箱中，直到胚胎孵化。要进行 pRNAi，首先从菌落中收集蛹。

将雄性和雌性蛹分到两个单独的培养皿中，并将它们放入 30 摄氏度的培养箱中。每天检查平板上是否有封闭的甲虫，并将这些个体转移到雄性和雌性成虫的两个单独的培养皿中。喂养这些成虫并每隔一天维护板，直到有足够的成虫关闭以开始注射。

成年池完成后，麻醉一只雌性甲虫，用一只手抬起个体腹侧，另一只手拿着注射器。轻轻穿透胸骨 2 和 3 之间的 segmacoria 膜。检查注射器秤，并缓慢分配每位女性约 2 微升。

注射后，保持针头稳定至少 5 秒钟，然后小心地将其拔出。将注射的雌性转移到装有猫粮的培养皿中。适当地标记这道菜。

将培养皿放入 30 摄氏度的培养箱中。24 小时后，将注射的雌性转移到迷你笼中，并添加相同数量的未注射的年轻雄性。给笼子贴上标签，并加入猫粮。

将笼子放入 30 摄氏度的培养箱中，以便交配。然后可以检查所得的后代以确定 pRNAi 的影响。该图像显示了注射了 DS GFP（绿色荧光蛋白）作为对照的 pRNAi 个体的后代。

在这里，与野生型个体一样，后代孵化时每节有一条有色条纹。相邻的着色条纹由非着色间隙隔开。在配对 pRNAi 之后，受影响的后代孵化出融合的相邻色素条纹，表明节段边界有缺陷。

表型严重程度是可变的，但融合始终出现在某些边界区域，表明类似配对规则的缺陷。同样，配对敲除后未孵化胚胎的角质层表型显示腹段丢失，体长缩短。用 engrailed 抗体对早期胚胎进行染色以检查分子缺陷，显示对照个体中每个节段的表达强度相等。

相比之下，在 Dmac 配对 dsRNA 注射雌性后代的交替条纹中检测到表达降低。这种表达减少的模式与在受影响的孵化幼虫中观察到的有缺陷的角质层模式一致。在这里，我们首次提出了在 Dermestes maculatus 的早期胚胎发育过程中使用 RNA 干扰敲除目标基因的方案。

在尝试这些程序时，重要的是要记住在适当的阶段使用胚胎或女性成年人。一旦掌握，可以在半小时内注射大约 100 个胚胎或 10 个雌性成虫。在此程序之后，可以进行其他方法，如胚胎染色或定量 PCR，以回答有关基因调控机制的其他问题。

看完这个视频后，你应该对如何建立一个 Dermestes 实验室菌落，以及对这种甲虫进行胚胎和亲本 RNA 干扰有一个很好的了解。目前，只有少数昆虫模型可用于功能研究。这里介绍的技术为研究人员将 Dermestes 用作模型系统铺平了道路，扩大了适合分子遗传学分析的昆虫范围。