Name: 实验和有限元议定书调查中性和带电溶质的跨关节软骨运输 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 了解利用实验与有限元方法研究关节软骨中分子跨膜运输的技术。该方法通过微计算机断层扫描测定扩散系数与固定电荷密度，为软骨生物力学研究提供可靠的实验与计算平台。

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作者谨向乌得勒支大学医学中心（UMC Utrecht）发育力学团队的 Jeroen van den Berg 先生和 Matthijs Wassink 先生致以诚挚感谢，感谢他们在骨软骨栓包裹过程中的协助。本研究得到了荷兰关节炎基金会资助项目的资助。

注意：本方案改编自近期研究论文中的实验与计算步骤6,8,9。该方案在图1中进行了图示说明。
尸体材料经乌得勒支大学兽医学院许可后收集。
1. 样品与浴液准备
<ol>
	<li>使用定制钻头从马尸股骨髁钻取圆柱形骨软骨栓（直径为8.5 mm）图1喷洒冷的磷酸盐缓冲液（PBS）以防止过热及随之发生的软骨损伤。</li>
	<li>使用塑料收缩套管对骨软骨塞进行热缩处理，以最大限度减少上覆灌注液的侧向扩散。
	<ol>
		<li>将软骨朝上的骨软骨柱先装入塑料收缩套管内，随后用热风加热。在软骨表面放置湿润的棉片，以防止热损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备带电有限浴液（例如， 650 µL，420 mM，碘克沙酸盐，分子量（MW）= 1,269 Da，电荷 = -1）和中性（650 µL，420 mM，碘克沙醇，MW = 1,550 Da）溶质分别处理。</li>
	<li>使用注射器将制备好的有限浴液加载到软骨表面，并在包裹的样品上放置软木塞，以防止在室温实验期间蒸发（图2A为了研究中性溶质的转运，将碘克沙醇溶液置于软骨表面；为了研究带负电荷溶质的转运，将碘他拉酸溶液置于软骨表面。</li>
</ol>
2. 成像与图像处理
<ol>
	<li>将用软木塞隔离的包裹样品放置在连接于显微CT电动载物台的定制支架上。放置样品时，确保覆盖有对比剂溶液的软骨表面朝上。</li>
	<li>使用显微CT（体素尺寸为40 × 40 × 40 µm3，扫描时间为2分钟，管电压为90 kV，管电流为180 µA）对包含软骨、软骨下骨板和有限浴液区域的视野进行多次时间点扫描，直至达到平衡状态（48小时）（图2A）。当浓度值随时间不再变化时，即达到平衡状态。</li>
	<li>基于初始图像对不同时间点的3D图像进行配准，以便使用制造商提供的软件（例如，Analyze）定位感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>在使用制造商软件处理之前，将重建的3D显微CT图像转换为2D标记图像文件格式（TIFF）序列。</li>
	<li>在软件中对软骨进行全局分割（ImageJ&gt;调整&gt;阈值），以区分软骨、软骨下骨及上方的浴液。</li>
	<li>使用前一步生成的软骨掩膜，获取不同时间点软骨的平均灰度值（ImageJ&gt;分析&gt;测量）。</li>
	<li>根据初始浴液浓度和软骨中对比剂的初始浓度，利用线性校准曲线将平均灰度值转换为溶质的实际浓度。已有数据支持灰度值与对比剂浓度之间存在线性关系。</li>
	<li>绘制溶质浓度随实验时间点的变化曲线。</li>
</ol>
3. 计算建模
注意：本问题中的扩散假设发生在一维（沿 z 轴方向），符合实验的边界条件。因此，几何构型可任意创建。
<ol>
	<li>构建基于有限浴液的软骨多区域模型：1）软骨由表层（占总软骨厚度的20%）、中层（占总软骨厚度的50%）和深层（占总软骨厚度的30%）组成12；2）在FEBio中建立有限浴液模型13,14（图2B）。</li>
	<li>在FEBio中为软骨不同区域及浴液分配力学和物理属性。假设杨氏模量为10 MPa，足以抵抗上覆浴液施加的渗透压，从而保护软骨免受过度变形。
	<ol>
		<li>使用10-3 mm4/Ns的液压渗透率和0的泊松比。在模拟中使用浴液的实际溶质扩散系数8,9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成网格（8节点三线性六面体单元），并在边界附近进行细化（图2B）8,9。</li>
	<li>双相-溶质模型
	<ol>
		<li>在浴液中施加初始溶质浓度以及对应的等效应力。参见文献9,15中关于等效应力的描述。</li>
		<li>以瞬态模式运行模型，根据各软骨区域规定的扩散系数获得溶质浓度随时间变化的曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多相模型 
	注意：通过在浴液和组织中各添加两种单价反离子，可避免浴液与组织之间的电势波动。
	<ol>
		<li>对于稳态模型：在软骨和上覆浴液中使用相同的等效流体压力和浓度，同时将固定电荷密度（FCD）逐步增加至目标值。</li>
		<li>对于瞬态模型：通过保持浴液中的溶质扩散系数足够高，以形成充分搅拌的有限浴液。从浴液-空气界面将溶质注入浴液，使其达到目标浓度。</li>
		<li>瞬态过程：移除上一步中设定的溶质浓度边界条件，并将有限浴液的扩散系数恢复为其实际值。</li>
		<li>运行模型，基于不同软骨区域中施加的FCD和扩散系数，获得溶质浓度-时间曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FEBio-MATLAB接口
	<ol>
		<li>开发MATLAB代码，以自动在FEBio中执行模拟并绘制浓度-时间曲线（FEBio-MATLAB接口）8,9。</li>
		<li>利用FEBio-MATLAB接口更改软骨区域中的扩散系数和FCD。在FEBio中运行模型，并提取溶质浓度-时间曲线8,9。</li>
		<li>将获得的溶质浓度-时间曲线与实验数据进行比较，并基于最小均方根误差（RMSE）确定各软骨区域中的一组扩散系数和FCD值8,9。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="使用钻头、股骨内侧髁和显微CT制备及分析骨软骨塞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54984/54984fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 实验装置。A) 使用定制钻头进行样本提取的流程。B) 采用显微CT成像监测扩散过程的步骤。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="关节软骨示意图，包含有限浴液；结构研究分层：表层、中层、深层。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54984/54984fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：示意图。 A) 实验设计。B) 多区域计算模型，包含软骨的有限浴液、表层、中层和深层区域及其对应的网格结构。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Arkill, K. P., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solute+transport+in+the+deep+and+calcified+zones+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Solute transport in the deep and calcified zones of articular cartilage.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (6), 708-714 (2008).</li>
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<li>Tavakoli Nia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggrecan+Nanoscale+Solid-Fluid+Interactions+Are+a+Primary+Determinant+of+Cartilage+Dynamic+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Aggrecan Nanoscale Solid-Fluid Interactions Are a Primary Determinant of Cartilage Dynamic Mechanical Properties.</a> ACS Nano. 9 (3), 2614-2625 (2015).</li>
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<li>Arbabi, V., Pouran, B., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+mechanical+and+physical+properties+of+cartilage+by+coupling+poroelastic-based+finite+element+models+of+indentation+with+artificial+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Determination of the mechanical and physical properties of cartilage by coupling poroelastic-based finite element models of indentation with artificial neural networks.</a> Journal of Biomechanics. 49 (5), 631-637 (2016).</li>
<li>Kokkonen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computed+tomography+detects+changes+in+contrast+agent+diffusion+after+collagen+cross-linking+typical+to+natural+aging+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Computed tomography detects changes in contrast agent diffusion after collagen cross-linking typical to natural aging of articular cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1190-1198 (2011).</li>
<li>Decker, S. G., Moeini, M., Chin, H. C., Rosenzweig, D. H., Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+Distribution+of+Fluorescent+Solutes+near+the+Articular+Surface+of+Mechanically+Injured+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adsorption and Distribution of Fluorescent Solutes near the Articular Surface of Mechanically Injured Cartilage.</a> Biophysical Journal. 105 (10), 2427-2436 (2013).</li>
<li>Silvast, T. S., Jurvelin, S. J., Tiitu, V., Quinn, T. M., Töyräs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bath+Concentration+of+Anionic+Contrast+Agents+Does+Not+Affect+Their+Diffusion+and+Distribution+in+Articular+cartilage+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Bath Concentration of Anionic Contrast Agents Does Not Affect Their Diffusion and Distribution in Articular cartilage In Vitro.</a> Cartilage. 4 (1), 42-51 (2013).</li>
<li>Silvast, T. S., Jurvelin, J. S., Lammi, M. J., Töyräs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pQCT+study+on+diffusion+and+equilibrium+distribution+of+iodinated+anionic+contrast+agent+in+human+articular+cartilage+-+associations+to+matrix+composition+and+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">pQCT study on diffusion and equilibrium distribution of iodinated anionic contrast agent in human articular cartilage - associations to matrix composition and integrity.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 17 (1), 26-32 (2009).</li>
<li>Pouran, B., Arbabi, V., Villamar, J., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Contrast agent's transport across healthy articular cartilage under various bath conditions. Orthopaedic Research Society Annual Meeting, Las Vegas, Nevada, , (2015).</li>
<li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of a biphasic-solute model in predicting diffusive properties of osteochondral interface. International Workshop on Osteoarthritis Imaging (IWOAI), Oulo, Finland, , (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提出了一种结合有限元建模的实验方案，用于研究中性溶质和带电溶质在关节软骨中的扩散行为。根据我们近期的研究，所提出的模型能够准确描述中性溶质（双相-溶质）和带负电溶质（多相）在关节软骨不同区域的传输过程8,9。普遍认为，在骨关节炎（OA）进展过程中，关节软骨的关键组分（如带负电的糖胺聚糖大分子和胶原纤维）逐渐丧失，导致其功能受限21,22,23,24。利用本研究中提出的技术，有望评估关节软骨的健康状况。在OA中，中性溶质的传输可能增强，主要原因是溶质与糖胺聚糖及胶原之间的相互作用减弱。另一方面，带负电溶质的传输可提供有关蛋白聚糖固定电荷浓度的信息，从而反映OA进展的程度。
基于先前研究中有限浴概念的提出而建立的...

分子转运在关节软骨的稳态维持、治疗药物向关节软骨的递送以及增强对比的软骨成像中起着至关重要的作用1,2,3。影响转运速率的因素包括软骨的整合性与完整性、溶质的电荷与尺寸，以及与软骨接触的溶液环境的渗透压和浓度4,5,6。由于关节软骨不同区域含有不同浓度和排列方向的主要细胞外基质分子（即蛋白聚糖（PGs）和II型胶原），中性或带电溶质在各区域间的转运可能存在差异1,7,8,9,10,11。更重要的是，带电溶质的转运高度依赖于细胞外基质中蛋白聚糖所携带的负性固定电荷浓度，而该浓度在关节软骨中由表层向深层逐渐增加8,9。随着骨关节炎（OA）的进展，这些参数——特别是固定电荷密度（FCD）、胶原纤维的取向以及软骨内水分含量的变化——可能发生改变，因此研究软骨内扩散过程具有重要意义。
在本研究中，提出了一种基于先前已建立的实验与计算研究6,8,9的实验方案，旨在利用中性与带电溶质在有限浴扩散模型中精确研究不同边界条件下的扩散行为。所提出的实验方法包括对包含软骨及有限浴的系统进行显微计算机断层扫描成像（micro-CT），并结合先进的双相-溶质及多相有限元模型进行分析。这些模型能够获取中性和带电分子在关节软骨不同区域的扩散系数以及固定电荷密度（FCD）。通过使用这些模型，可更深入理解扩散过程中中性和带电分子的行为，进而用于研究软骨与上方有限浴之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>Hexabrix</td><td>Guerbet</td><td>15HX005D</td><td>带负电荷的对比剂</td></tr><tr><td>Visipaque</td><td>GE healthcare</td><td>12570511</td><td>中性对比剂</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td>培养基</td></tr><tr><td>micro-CT</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>监测扩散</td></tr><tr><td>冰点渗透压仪</td><td>Advanced instruments</td><td></td><td>测量溶液渗透压</td></tr></tbody></table>

一种用于研究中性和带电溶质在关节软骨中跨膜转运的实验与有限元分析方案

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

骨关节炎（OA）是一种致残性疾病，与关节软骨及软骨下骨的退变密切相关。关节软骨的退变会显著损害其承载负荷的功能，因为软骨会经历严重的化学降解，即 蛋白聚糖丢失和胶原纤维破坏。研究OA过程中化学损伤机制的一种有前景的方法是将软骨样本暴露于外源性溶质中，并监测分子的扩散行为。软骨损伤程度（即 关键大分子的浓度与分布状态）会影响外源性溶质在穿过关节软骨时的碰撞能量损失，从而产生与健康软骨不同的扩散特征。在本研究中，我们介绍了一种基于先前建立的实验性微计算机断层扫描（micro-CT）和有限元建模的实验方案，该方案包含多个步骤。首先利用micro-CT记录带电与非带电碘化分子的运输过程，随后应用双相-溶质和多相有限元模型，获取软骨不同区域的扩散系数和固定电荷密度。

此处提供的代表性结果摘自以往的研究论文6,8,9,16。
在骨关节炎中，关节软骨发生显著变化，最重要的是糖胺聚糖丢失和胶原纤维损伤 17,18,19这些变化可能会影响溶质在关节软骨中的扩散行为 20,21我们研究了两种碘化对比剂的轴向扩散。 即 碘克沙醇（电荷 = 0）和碘昔兰（电...

我们提出了一种利用近期开发的实验与数值方法研究带电及不带电分子在关节软骨中跨膜运输的实验方案。

骨关节炎（OA）是一种致残性疾病，与关节软骨及软骨下骨的退变相关。关节软骨的退变……

本实验的总体目标是利用实验和数值方法，研究带电与不带电分子在关节软骨中的跨组织传输。该方法有助于回答与关节软骨物理特性相关的关键问题，例如不同区域中的扩散系数和固定电荷密度。该技术的主要优势在于采用了一种基于微型计算机断层扫描的有限路径实验模型，用于研究放射性不透光分子的传输过程。开始样品制备时，在钻取钻孔区域的同时喷洒室温磷酸盐缓冲液（PBS），钻出一个直径为8.5毫米的圆柱形骨软骨栓。将骨软骨栓插入一段长约2.5厘米的热缩管中，使骨层与管端齐平，然后用湿润的棉球覆盖软骨表面。接着使用热风枪加热，使热缩管收缩并紧贴骨软骨栓的侧面。在管内软骨表面加载有限体积的420毫摩尔碘克沙酸盐或碘昔醇溶液，分别用于制备带负电荷或中性溶质环境。用软木塞封闭管的开口端。将样本置于安装在微计算机断层扫描仪（micro-CT）电动载物台上的样品架中，确保封塞端朝上。扫描包含软骨、软骨下板和有限浴液的视野。在接下来的48小时内定期重复扫描，直至软骨中的对比剂浓度不随时间发生变化。在仪器软件中，将不同时间点的三维图像相对于初始图像进行配准，并将重建后的图像转换为二维TIFF文件序列。将图像导入图像处理程序，并复制图像以分别分割浴液区域和软骨下骨。接着，手动填充软骨下骨中的孔洞，并去除浴液区域中的冗余像素。然后通过数学方法将分割后的浴液区域和软骨下骨图像相加。使用魔棒工具定义软骨掩模的轮廓，并将其添加到感兴趣区域管理器中。测量软骨的平均灰度值。根据浴液和软骨中的初始浓度，利用线性校准曲线将浴液和软骨中的平均灰度值转换为溶质浓度。绘制溶质浓度随时间的变化曲线。为了开始使用 FEBio 软件对扩散进行计算建模，需构建基于有限浴的软骨多区域有限元模型，其中表层区域占软骨厚度的 20%，中层区域占 50%，深层区域占 30%。为双相溶质模型创建一个包含中性溶质信息的表格，为多相模型创建一个包含带电溶质信息的表格。为了使用多相模型模拟带电溶质的扩散，必须向浴液和软骨中添加两种单价反离子，以避免浴液与组织之间电势波动的影响。在建立软骨和有限浴液区域的模型后，需为双相溶质模型中的每个区域分配相应的力学和物理属性，即杨氏模量、渗透率、自由扩散系数和扩散系数。对于多相模型，则需为每个区域分配力学和物理属性，包括杨氏模量、渗透率、自由扩散系数、扩散系数以及固定电荷密度。接下来，生成一个包含八个节点的三线性六面体单元网格，并在边界附近进行细化。为了使用双相溶质模型模拟中性溶质的扩散，将初始溶质浓度和有效压力施加到有限浴模型上。以瞬态模式运行双相溶质模型，根据每层软骨区域的扩散系数生成溶质浓度随时间变化的曲线。对于稳态步骤中的多相模型，将软骨和有限浴液的流体有效压力和溶质浓度设为相同值，同时将固定电荷密度增加至目标值。在瞬态步骤中，通过保持浴液中的扩散系数足够高，以形成充分搅拌的有限浴液。从浴液-空气界面将溶质注入浴液，使其达到目标浓度值。然后移除上一步中设定的溶质浓度边界条件，并将有限浴液的扩散系数恢复为其实际扩散系数。通过 FEBio MATLAB 接口运行多相溶质模型，以获得基于施加的固定电荷密度以及各软骨区域扩散系数的溶质浓度随时间变化曲线。采用该方法，分别利用双相溶质模型和多相溶质模型对中性与阴离子造影剂在关节软骨中的扩散过程进行了模拟。两种模型均与实验数据高度吻合。中性对比剂碘克沙醇在不同软骨区域的扩散系数由双相溶质模型确定，而阴离子对比剂碘昔兰在不同区域的扩散系数则由多相模型确定。该技术建立后，为组织生物力学领域的研究人员探索软组织的扩散特性开辟了道路，使其能够结合实验与计算方法进行研究。观看本视频后，您应能充分理解如何设计针对关节软骨中扩散过程的实验与计算平台。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

实验和有限元议定书调查中性和带电溶质的跨关节软骨运输

介绍了一种在高水平滑液环境中培养人关节软骨细胞的三维体系。滑液最能反映关节软骨的天然微环境，且易于获取和保存。因此，该体系可用于研究软骨再生以及筛选治疗关节炎的药物。...

一种用于在滑液中培养人关节软骨细胞的三维培养系统

软骨修复是一项尚未满足的医学挑战，而基于细胞的人关节软骨组织工程技术是一种有前景的解决方案。本文中，我们描述了三维（3D）仿生水凝胶作为扩增和成熟人关节软骨细胞的理想工具。...

用于关节软骨细胞培养与软骨生成的三维水凝胶支架

我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位...

实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

关节镜手术中的探查通常用于评估软组织的状况，但这种方法一直具有主观性和定性特点。本报告介绍了一种探查装置，可在关节镜手术期间利用三轴力传感器对软组织的阻力进行定量测量。...

一种用于关节镜手术中定量测量软组织力学特性的探针装置

本方案描述了与金属植入材料对磨的骨软骨圆柱体的制备、生物摩擦学测试及分析方法。本方案包含的评估指标有代谢活性、基因表达和组织学分析。...

用于植入物的金属与关节软骨对磨的生物摩擦学测试与分析

本方案用于测定阳离子肽类载体在软骨中的平衡摄取量、渗透深度以及非平衡扩散速率。表征其转运特性对于确保产生有效的生物学响应至关重要。这些方法可用于设计具有最优电荷的药物载体，以靶向带负电荷的组织。...

阳离子肽载体在软骨内转运特性的表征

一种非侵入性建立大鼠膝关节内关节软骨损伤模型的方法

本文介绍了一种用于标记血小板裂解物来源的细胞外囊泡的实验方案，以监测其在骨关节炎模型——软骨组织外植体中的迁移和摄取情况。...

用于监测软骨组织外泌体迁移与摄取的标记方法

本实验方案描述了一种摩擦测试装置，该装置可对两个接触的生物对偶表面同时施加往复滑动和法向载荷。...

用于研究滑膜关节生物力学、力学生物学及物理调控的摩擦测试-生物反应装置

我们提供了从人源间充质干细胞生成四种组织的详细方法，这些组织用于模拟人类膝关节中的软骨、骨、脂肪垫和滑膜。这四种组织被整合到一个定制的生物反应器中，并通过微流控系统相互连接，从而构建出膝关节芯片。...

创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

我们提出了一种逐步识别和解决原子力显微镜微压痕实验中最常见问题的方法。我们以不同程度骨关节炎导致退变的原代人关节软骨组织为模型，示例说明实验中出现的各类问题。...

解决基于原子力显微镜的人类关节软骨离体组织微压痕实验中的实际问题

了解利用实验与有限元方法研究关节软骨中分子跨膜运输的技术。该方法通过微计算机断层扫描测定扩散系数与固定电荷密度，为软骨生物力学研究提供可靠的实验与计算平台。

一种用于研究中性和带电溶质在关节软骨中跨膜转运的实验与有限元分析方案

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