用于检测实验方案蓝藻与抗体基因芯片液体和固体样品
2017年2月7日
供人类饮用的淡水水库中存在蓝藻毒素是水管理当局的主要关注点。为了评估水污染的风险，本文描述了一种使用抗体微阵列芯片对液体和固体样品中的蓝藻菌株进行现场检测的方案。
该程序的总体目标是使用荧光微阵列免疫测定法确定液体和固体样品中是否存在多种蓝藻菌株。这种方法可以帮助回答环境、监测和水管理领域的关键问题，例如在水华变得肉眼可见之前，存在产生毒素的原毒素细菌。该技术的主要优点是可以在原位或实验室三、四小时内同时监测多种蓝藻菌株和多个样品。
因此，这些方法可以提供对生物多样性的见解。它还可以应用于其他领域，例如监测农业设施、应变环境中的生命检测或行星探索。一般来说，刚接触这种方法的人不会挣扎。
因为样品处理简单，结果更容易解释。根据文本方案生产和纯化抗体后，将 100 微升 DMSO 加入含有用于标记的染料的商业小瓶中，即 1 毫克蛋白质。染料溶解后，将 2 μL 染料添加到 50 μL 每种抗体制剂中，以标记纯化的抗体。
在振动平台上连续搅拌，将标记反应物在环境温度下保持 1 小时。根据文本方案纯化标记的抗体后，将一小份等分试样加载到分光光度计中，并测量 280 和 650 纳米处的吸光度。按照供应商的建议计算标签效率。
要制备 CYANOCHIP，将每毫升抗体 1 毫克混合在 1X 蛋白打印缓冲液中，制备 30 μL 每种纯化抗体，每体积为 01% 的 Tween 20。准备 30 微升以下打印溶液作为对照。1X 蛋白质打印缓冲液，每体积 Tween 20 体积的 01%。
每种蛋白 A 在含 01% Tween 20 的 1X 蛋白打印缓冲液中以每毫升 1 毫克/mL 的浓度纯化免疫前血清，以及每毫升 1 毫克的 BSA 和含 01%Tween 20 的 1X 蛋白打印缓冲液。每孔将 30 微升制备的打印溶液添加到高质量的 384 孔微孔板中。根据文本方案设置打印机器人和载玻片底物后，将所有抗体和对照以大约 180 至 200 微米光斑直径的一式三份点样点到载玻片上。
在环境中采样时，使用无菌注射器收集 1 至 100 毫升液体，并通过使样品通过 3 微米孔径过滤器来浓缩细胞。如果需要，从岩石或土壤中收集固体样品，并将其保存在无菌管中。样品可以在小型现场实验室中进行检测。
加入 1 毫升提取孵育缓冲液以回收过滤器中收集的生物质，并使用空间将过滤器刮入 15 毫升管中。使用手持式超声处理器，或通过上下吹打数次，使样品聚集和均质化。此外，在单独的 10 mL 试管中称取至 0.5 g 固体样品，并加入至多 2 mL 的提取缓冲液。
将超声仪探头浸入管中，并使用手持式超声处理器或其他超声设备进行超声处理。将样品保存在冰上，以 30 kHz 的频率执行至少 5 个 30 秒的循环，在两次超声处理之间停止 30 秒。要制备用于免疫测定的滤液提取物，请使用 10 毫升注射器与 5 至 20 微米孔径的尼龙过滤器支架耦合，将溶液过滤到 1.5 毫升管中，以去除沙子、粘土和其他粗物质。
将微阵列芯片点朝下，将玻片放在 100 至 200 微升的封闭液滴上，孵育 3 至 5 分钟。使用塑料镊子，避开微阵列区域，小心地拿起载玻片。将玻片浸入新鲜的封闭溶液中，并在轻微搅拌下孵育玻片 30 分钟。
要干燥载玻片，请将其放入适用于显微镜载玻片的离心机中并短暂旋转。按照提供者的说明在 3 x 8 孔微阵列杂交盒中设置载玻片。或者，在修改抗体打印模式后，设置一个定制的盒，如此处所示，或者简单地使用盖玻片进行设置。
在载玻片和溶壳盒组装后，将最多 50 微升的每种样品提取物或提取孵育缓冲液中的稀释液移液到溶壳盒的每个孔中。或者，将样品加载到其他孵育装置中，或者简单地使用盖玻片。作为空白对照，将 50 微升 TBSTRR 缓冲液移液到盒的至少两个单独的孔中。
将样品在环境温度下孵育 1 小时，每 15 分钟移液混匀，或在 4 摄氏度下孵育 12 小时。要清洗微阵列芯片，请将凝胶盒放下，然后小心地将其敲击到干净的吸水纸上。然后通过向每个孔中加入 150 微升提取孵育缓冲液来洗涤孔，并像以前一样敲击吸收性纸去除缓冲液。
再重复洗涤 3 次。向每个孔中加入 50 微升含有 17 种抗蓝藻菌株抗体的荧光抗体混合物。将样品在环境温度下孵育 1 小时或在 4 摄氏度下孵育 12 小时。
要清洗微阵列芯片，请小心地将盒放下，然后将其轻轻敲击在干净的吸水纸上。然后加入 150 微升提取孵育缓冲液，然后用纸巾轻敲将其取出。重复洗涤 3 次。
然后拆卸溶包盒，将玻片浸入 0.1X PBS 溶液中进行快速冲洗。像以前一样快速离心以干燥载玻片。使用荧光扫描仪扫描载玻片，以查找远红荧光染料的最大发射峰处的荧光。
通过更改增益值，以不同的扫描参数拍摄微阵列的几张图像。最后，加载网格，量化，然后根据文本协议对数据进行处理和分析。本视频中演示的 CYANOCHIP 多重免疫测定法用于测试本表中列出的最相关的淡水蓝藻物种的同时鉴定。
使用微阵列分析法分析在淡水水库岸边收集的水样。主要的阳性免疫反应对应于针对浮游蓝藻微囊藻物种和底栖 leptolyngbya 物种的抗体。浮游 nostocales aphanizomenon 物种、anabaena 物种、水体微囊藻和底栖 rivularia 物种的荧光信号较低。
还通过测定南极干燥微生物垫来验证微阵列，以检测蓝藻标志物的存在。抗体对底栖蓝细菌、anabaena 物种和 leptolyngbya 物种产生阳性反应。使用浮游蓝细菌抗体检测到额外的阳性免疫反应，例如微囊藻属、aphanizomenon 属和 Planktothrix rubescens 属。
最后，这些信号是从其他底栖物种的抗体中获得的，包括 tolypothrix 物种和 anabaena 物种。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在三到四个小时内完成，不包括抗体生产和流平。通过样品和荧光抗体同时孵育，可节省 1 小时。
在尝试这些程序时，请务必记住以最佳工作稀释度准备好荧光抗体混合物和抗体。遵循这些程序后，可以执行其他方法，如光学显微镜或 DNA 提取和特定的 PCR 扩增，以回答其他问题，如土壤浓度或确认检测到的菌株类型。开发后，该技术将为环境监测领域的研究人员在双培养过程中探索水体、淡水管理或微生物生态学研究铺平道路，无论样本类型如何。
观看本视频后，您应该对如何使用荧光标记抗体、作抗体微阵列、进行多重免疫分析以及分析和解释微阵列免疫分析结果有很好的了解。不要忘记使用超声波可能很危险，因此在执行这些程序时应始终采取预防措施，例如佩戴护耳装置或其他特定的护理措施。
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概述
本文介绍了一种使用荧光微阵列免疫分析法在现场检测液体和固体样品中的蓝藻菌株的协议。这种方法对于评估淡水水库中蓝藻毒素污染的风险至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 环境监测
- 水资源管理
- 微生物生态学
背景
- 蓝藻毒素对人类健康构成重大风险。
- 及早检测毒素可以预防健康危害。
- 监测生物多样性对生态学研究至关重要。
- 这种方法可应用于农业和行星探索等多个领域。
研究目的
- 同时检测多种蓝藻菌株。
- 在可见水华发生之前提供毒素存在的见解。
- 增强水安全和管理实践。
使用的方法
- 用于检测的荧光微阵列免疫分析法。
- 现场和实验室样品测试。
- 在短时间内监测多个样品。
- 该方法在各种环境背景下的应用。
主要结果
- 在多种样品中成功检测到蓝藻菌株。
- 在三到四小时内得到快速结果。
- 能够同时监测多个菌株。
- 提供生物多样性和生态健康方面的见解。
结论
- 该方法对早期检测有害蓝藻有效。
- 它可以显著帮助水资源管理和安全。
- 潜在应用范围超出水源监测，扩展到农业和探索领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, multiplex detection of cyanobacterial strains using antibody microarray chips enables early risk assessment of toxin-producing organisms in water sources. This capability supports environmental monitoring programs and informs preventive actions before visible blooms or toxin accumulation occur. The approach enhances predictive confidence for water safety and ecosystem management, directly impacting public health and resource stewardship.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables simultaneous interrogation of multiple cyanobacterial targets for toxin risk assessment.
- Supports functional validation of antibody specificity and taxonomic resolution in complex samples.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing toxin producers from non-producers at early detection stages.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, multiplexed immunoassay platform for high-throughput environmental sample screening.
- Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts for comparative analysis across samples and timepoints.
- Enables rapid assay turnaround, supporting timely decision-making in monitoring workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by detecting early molecular indicators of ecosystem health threats.
- Supports continuity from field detection to laboratory confirmation and further molecular analyses.
- Reduces risk of late-stage intervention by providing actionable data at the pre-bloom stage.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplex immunoassay positions at the interface of environmental surveillance and early hazard identification, bridging field sampling with laboratory analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cyanobacterial diversity and toxin potential in environmental matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for rapid sample triage and prioritization.
- Analytics: Provides fluorescence-based measurements enabling statistical comparison of strain abundance and distribution.
- Translational Research: Facilitates linkage between environmental detection and downstream molecular confirmation or risk modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable microarray platform adaptable to diverse sample types and monitoring campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in early toxin risk detection and target validation.
- Operational Value: Streamlines sample processing and data acquisition for field and laboratory teams.
- Strategic Value: Enables proactive intervention, reducing downstream remediation costs and health risks.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted resource allocation and prioritization in environmental monitoring portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay setup, fluorescence detection, and data interpretation.
- Needs access to portable fluorescence scanners and microarray handling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample collection, processing, and assay protocols.
- Adaptable to both liquid and solid environmental matrices with minor protocol adjustments.
- Dependent on antibody quality and specificity for reliable taxonomic resolution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Fluorescence Antibody Labeling
2:05
CYANOCHIP Production
3:13
Preparation of Environmental Multi-analyte Extracts for Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay
4:42
Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay
5:20
Incubation of Multi-analyte Sample Extract with Microarray and Washing
6:42
Fluorescent Antibodies and Scanning Fluorescence
7:53
Results: Cyanobacteria Detection Using the CYANOCHIP Multiplex Immunoassay
9:17
Conclusion
