Name: 用于检测实验方案蓝藻与抗体基因芯片液体和固体样品 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学习使用荧光微阵列免疫分析法检测液体和固体样品中的多种蓝藻菌株。该方法可在三至四小时内同时监测多个样品，适用于环境监测、水资源管理和微生物生态学研究。

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我们感谢马德里自治大学的 Antonio Quesada 博士提供蓝细菌菌株。本工作由以下机构资助： 研究项目总司副司长办公室 西班牙的 经济与竞争力部 （西班牙经济与竞争力部，项目编号：AYA2011-24803 和 ESP2014-58494-R）

1. 免疫原的制备
<ol>
	<li>在表1所述条件下，于相应的培养基中培养每种蓝藻菌株。 
	注意：每种蓝藻菌株的培养基和培养条件列于表1中。除K17外，所有蓝藻菌株均来自西班牙马德里自治大学Antonio Quesada研究组。抗Planktothrix rubescens的抗体由西班牙北部Vilasouto水库中该蓝藻形成的单一种类水华自然样本制备获得。</li>
	<li>使用血细胞计数板在光学显微镜下对细胞数量进行定量，获得对数生长后期或稳定期培养物中约108 个细胞/mL的浓度。</li>
	<li>取5 mL培养液，以2,000 × g离心5分钟，收集细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于10 mL离心管中的5 mL 1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，使细胞浓度约为108 个细胞/mL。</li>
	<li>使用便携式手持超声处理器，对悬浮液进行超声处理，共5个循环，每个循环30秒，每次循环间在冰上暂停30至60秒；或以最大振幅（30 kHz）将离心管浸入细胞破碎仪的水浴中进行处理，以实现细胞的均质化和裂解。</li>
	<li>对每种蓝藻菌株重复步骤1.3–1.5。 
	注意：超声处理可导致细胞破裂并释放细胞内含物。蛋白质和多糖是良好的免疫原，而某些特定分子（如脂质和核酸）本身不能引发体液免疫应答，因此必须与多糖或蛋白质等载体结合，以增加其分子复杂性。此外，超声处理可释放可能触发抗体产生的细胞内物质。</li>
</ol>
2. 多克隆抗体的制备
<ol>
	<li>将步骤 1.5 中获得的超声处理后的细胞裂解液 0.5 mL 与 0.5 mL 完全弗氏佐剂混合，制备第一剂免疫原，并交由动物设施操作人员用于多克隆兔抗体的制备。</li>
	<li>按照上述方法再制备三剂，用于抗体生产过程中的后续记忆加强；将步骤 1.5 中获得的相同匀浆液/裂解液 0.5 mL 与 0.5 mL 不完全弗氏佐剂混合，交由动物设施以完成抗体生产流程。</li>
	<li>每开展一次新的抗体生产流程，均需重复步骤 2.1 和 2.2。 
	注意：通常抗体生产会委托给专业的动物设施或公司完成，因为动物实验需要相应的许可资质和专业培训。相关公司会提供血清样本中抗原特异性抗体含量的相对酶联免疫吸附测定（ELISA）检测结果。</li>
</ol>
3. 抗体纯化
<ol>
	<li>通过蛋白A亲和层析法，从第2步收集的免疫血清和前免疫血清中纯化免疫球蛋白G（IgG）组分。一些基于柱式系统的商用纯化试剂盒效果良好；请遵循供应商提供的说明进行操作。</li>
	<li>当纯化试剂盒未提供脱盐系统时，需在抗体洗脱后更换缓冲液至0.1× PBS，可通过透析或使用截留分子量为100 kDa（或更低）的离心过滤装置完成。</li>
	<li>通过测定280 nm处的吸光度，或采用比色法（如Bradford23、Lowry24或双辛可宁酸（BCA）25）测定抗体浓度。 
	注意：应避免在洗脱缓冲液中使用含氨基的缓冲体系（例如 Tris缓冲液），因为这些基团会与经环氧基团活化的固相表面竞争结合抗体。抗体纯化后，必须通过ELISA检测其活性。</li>
</ol>
4. 荧光抗体标记
<ol>
	<li>将第3节中获得的纯化抗体用荧光染料标记（例如， 一种远红荧光染料）通过将含有可标记1 mg蛋白质的商用染料小瓶溶解于100 &#181;升二甲基亚砜（DMSO）。加入2 &#181;将溶解的染料以每50 μL终体积中加入2 mg/mL浓度的抗体制剂中，每种抗体制剂加入L量的染料 &#181;50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 8.5）中</li>
	<li>在室温及1,200 rpm的振荡平台上，持续振荡孵育标记反应1小时。</li>
	<li>通过尺寸排阻色谱法纯化标记的抗体例如， 使用截留分子量范围为1.5至30 kDa的凝胶（装填于层析柱中），按照供应商建议进行操作。</li>
	<li>在洗脱液中测定 280 nm 和 650 nm 处的吸光度，并根据试剂供应商的建议计算标记效率。 
	注意：最多 50 x 50-&#181;L抗体标记反应可使用单个试剂瓶中的荧光染料对1 mg蛋白质进行标记。建议在步骤4.3之后用铝箔包裹试管，或使用不透光的0.5 mL离心管，以避免荧光淬灭。对于IgG抗体，每摩尔抗体使用3–7摩尔染料可实现最佳标记效果。</li>
</ol>
5. CYANOCHIP 的制备
<ol>
	<li>打印溶液中的抗体与对照
	<ol>
		<li>准备 30 &#181;将每种纯化抗体以1 mg/mL的终浓度溶于商用1×蛋白质点样缓冲液中，并加入0.01%（v/v）Tween 20（一种非离子型去污剂），配制成点样溶液。 
		注意：或者，抗体溶液可包含20%甘油、1%（w/v）蔗糖（或海藻糖，作为防腐剂）和0.01%（v/v）Tween 20，溶于碳酸盐缓冲液（pH 8.5）中。</li>
		<li>准备 30 &#181;作为对照，每种打印溶液取 L：（a）含 0.01% (v/v) Tween 20 的 1× 蛋白质打印缓冲液；（b）用含 0.01% (v/v) Tween 20 的 1× 蛋白质打印缓冲液稀释至 1 mg/mL 的蛋白A纯化的免疫前血清；（c）用含 0.01% (v/v) Tween 20 的 1× 蛋白质打印缓冲液稀释至 1 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）。</li>
		<li>准备 30 &#181;L 的荧光标记纯化前免疫血清，以不同浓度处理（例如， 从 50 &#181;微克/毫升至1 &#181;g/mL) 溶于含 Tween 20 的 1× 蛋白质点样缓冲液中，步骤同 5.1.1。这些样品将用作荧光定位标记，并在点样后用于相对荧光强度的定量。</li>
		<li>加入30 &#181;将步骤 5.1.1、5.1.2 和 5.1.3 中制备的点样溶液各 100 L 加入高质量的 384 孔微孔板中，用于微阵列制造，例如聚丙烯材质的微孔板。 
		注意：蛋白打印缓冲液可提高抗体的质量和稳定性，Tween 20 可均一化斑点形态并促进蛋白质偶联。建议将 384 孔微孔板置于 4 °C 保存 &#176;使用前置于室温。于 -20 保存 &#176;C 条件下长时间保存。聚丙烯具有较低的 DNA、蛋白质、细胞提取物和小分子固有结合性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体在载玻片上的点样 
	注意：使用不同的芯片点样平台（如接触式、分针式或非接触式设备，包括压电喷墨打印机）将抗体打印到活化的显微镜载玻片上。 &#34;喷墨&#34; 技术。在此工作中，CYANOCHIP 通过使用能够点样纳升级别抗体的机器人系统（点样仪）以接触式打印方式常规制备 &#181;米级
	<ol>
		<li>将打印室的环境条件设置为20 &#176;C 和 40 - 50% 相对湿度。</li>
		<li>设置载玻片基质（例如， 75 mm × 25 mm 环氧活化显微镜载玻片，用于在每张载玻片上制备多个相同的抗体微阵列。</li>
		<li>将每种纯化的抗体（包括对照和参考框架）以三点重复模式点样；在此条件下，斑点直径为180 - 200 &#181;微米直径。</li>
		<li>打印后，将载玻片在室温下静置至少30分钟使其干燥，然后于4℃保存 &#176;C；在野外工作时，载玻片可在室温下运输和保存数月。 
		注：CYANOCHIP 以每张载玻片 3 x 8 个或 1 x 9 个相同的微阵列形式打印，每个微阵列具有三重重复点阵格式。每个阵列的尺寸不得超过 24 孔垫圈反应室的尺寸（通常在 3 x 8 杂交室中为 7.5 x 6.5 mm）。</li>
		<li>在使用微阵列分析环境样品之前，需通过多重荧光夹心微阵列免疫法（FSMI）测定每种抗体的工作稀释度，绘制滴定曲线。针对每种抗体，使用相应免疫原的标准浓度（103 - 104 细胞/mL）以及荧光标记抗体的系列稀释液（稀释比例为1:500至1:32,000）。最适抗体浓度对应于滴定曲线上最大信号强度的50%。此外，每种抗体的灵敏度和特异性必须按照Blanco所述方法进行测定 等22.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 荧光夹心微阵列免疫测定法（FSMI）用环境多组分提取物的制备
<ol>
	<li>液体样品的多组分提取物
	<ol>
		<li>使用无菌注射器取 1 - 100 mL 液体样品例如， 来自水库岸边的水）；样本量在很大程度上取决于目标物的潜在浓度。</li>
		<li>通过将水样过滤过3-&#181;m 孔径、47 mm 直径的聚碳酸酯滤膜；细胞浓度介于 103 - 108 每毫升细胞数达到可检测水平有利于实现阳性检出，但实际浓度未知。</li>
		<li>用刮刀将滤膜上收集的生物量刮下，加入1 mL改良的含Tween 20强化的Tris缓冲盐溶液（TBSTRR；0.4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCl, 和0.1% Tween 20），转移至15 mL离心管中，以回收生物量。</li>
		<li>使用手持式超声处理器均质并分散样品，方法如步骤1.5所述，或仅通过反复吹打混匀；此步骤用于为微阵列分析制备样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固体样品的多分析物提取
	<ol>
		<li>称取最多0.5 g的固体样品（例如， 将岩石、土壤或沉积物样品放入10 mL离心管中，加入最多2 mL的TBSTRR缓冲液。</li>
		<li>将超声探头浸入管中，或将管子浸入强效超声探头的水浴中，或使用手持式超声仪进行超声处理。在冰上操作，以30 kHz频率至少进行5次30秒的超声循环，每次间隔30秒。</li>
		<li>使用10 mL注射器连接直径为10至12 mm、孔径为5至20 μm的滤器，过滤以去除沙子、黏土及其他粗颗粒物质。&#181;m 孔径尼龙滤膜过滤器。将样品通过滤膜推入1.5 mL离心管中。若滤膜堵塞，可振荡混匀注射器中的悬浮液，并更换新的滤膜；此步骤所得滤液用于后续免疫检测（步骤7）。 
		注意：TBSTRR 的缓冲能力取决于样品类型。制备环境提取物后，应立即进行免疫测定，以避免分析物受到酶降解的影响。或者，可在环境提取物中添加蛋白酶抑制剂，并于 -80 ℃ 冷冻保存。 &#176;C，直至进行下一步。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 荧光夹心微阵列免疫测定法（FSMI）
<ol>
	<li>封闭 CYANOCHIP 
	注意：使用前立即处理打印好的载玻片，以封闭载玻片上所有游离的环氧基团，并去除未共价结合的过量抗体。
	<ol>
		<li>将微阵列浸入含有5% (w/v) BSA的0.5 M Tris-HCl (pH 9) 溶液中，置于洁净表面（例如培养皿或50-mL离心管），在摇床平台上轻柔振荡5分钟。或者，将载玻片正面朝下放置于100至200 µL上述溶液液滴上，静置3至5分钟，然后继续操作。</li>
		<li>使用带塑料尖头的镊子小心夹取载玻片；尽量避免触碰微阵列区域。轻轻将载玻片在纸巾上敲击以去除多余液体。随后将其浸入含2% (w/v) BSA的0.5 M Tris-HCl (pH 8) 溶液中，在摇床平台上轻柔振荡孵育30分钟。</li>
		<li>使用适配载玻片的商用微量离心机进行短时离心（200 - 300 ×g，1分钟）干燥载玻片。或者，通过在纸巾上轻轻敲击使载玻片干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多分析物样本提取液与微阵列的孵育
	<ol>
		<li>将载玻片放入商用微阵列杂交反应盒中，该反应盒具有24个孔以容纳多个微阵列；请遵循供应商说明进行操作。</li>
		<li>完成载玻片与反应盒组装后，向每个孔中加入最多50 µL样本提取液或其在TBSTRR中的稀释液。</li>
		<li>对每个待分析样本重复步骤7.2.2。</li>
		<li>作为空白对照，向反应盒中至少两个独立的孔内各加入50 µL TBSTRR缓冲液。</li>
		<li>在室温下孵育1小时，期间每15分钟用移液器吹打混匀一次，或保持轻微振荡。或者，在4 °C下孵育12小时。 
		注意：根据微阵列的排布使用相应的孵育垫圈。步骤7.2.5中的孵育时间和温度为经验参数，通常取决于每对抗原-抗体的亲和力及结合动力学。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤
	<ol>
		<li>将反应盒倒置并轻轻敲击在洁净的吸水纸上，以去除孔内样本。</li>
		<li>向每个孔中加入150 µL TBSTRR，洗涤后按上述方法去除缓冲液。</li>
		<li>重复步骤7.3.2三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与荧光检测抗体孵育
	<ol>
		<li>向每个孔中加入50 µL抗体混合液，其中包含17种抗不同蓝藻菌株的抗体，每种抗体均以荧光染料标记，并溶于含1% (w/v) BSA的TBSTRR中。通过各抗原/抗体对的滴定实验确定混合液中每种荧光抗体的浓度（0.7至2 µg/mL） 22。</li>
		<li>在室温下孵育1小时，操作同步骤7.2.5所述；或在4 °C下孵育12小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗去未结合的荧光抗体
	<ol>
		<li>按照步骤7.3的方法去除未结合的荧光抗体。</li>
		<li>拆卸反应盒，将载玻片浸入0.1x PBS（例如置于50-mL离心管中）进行快速漂洗。</li>
		<li>按照步骤7.1.3的方法干燥载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 荧光扫描
<ol>
	<li>使用荧光扫描仪，在远红荧光染料的最大发射荧光峰处对载玻片进行荧光扫描。通过降低激光增益值等不同扫描参数，获取微阵列的多张图像。 
	注意：避免信号饱和的斑点（> 65,000 荧光计数）——此类斑点超出量程，可能导致定量误差。</li>
</ol>
9. 图像处理与数据分析
<ol>
	<li>使用商业软件进行图像分析与定量；该软件可提供整个微阵列中每个点的荧光强度（FI；单个点所有像素的中位数或平均值）。减去点周围的局部背景：FI = FIspot - FIlocal background。</li>
	<li>保存FI数据，并使用电子表格程序打开。</li>
	<li>将空白芯片所得数值作为阴性对照，用于识别并剔除假阳性结果。应用以下公式计算每个抗体点的FI：FI = (FIsample - FIblank)，其中FIsample为样品提取物微阵列中FIspot - FIlocal background的值，FIblank为空白微阵列中FIspot - FIlocal background的值。</li>
	<li>额外设定一个2至3倍微阵列平均FI值的截断阈值，以降低假阳性的可能性；这对于图像质量较差或信噪比较低的情况尤为重要。</li>
	<li>根据需要绘制图表和/或进行进一步分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种使用CYANOCHIP的多重荧光夹心免疫测定法，CYANOCHIP是一种包含17种抗体的微阵列，可用于检测和鉴定多种蓝藻属22。这些cyanobacteria代表了淡水生境中最常见的底栖和浮游蓝藻属，其中一些种类能够产生毒素。近年来，荧光夹心免疫测定技术已被用于环境领域中微生物和/或生物分析物的鉴定26,27,28。该方法主要基于两个步骤：（i）将捕获抗体固定于芯片上，以特异性结合测试样品中的分析物；（ii）使用荧光标记的抗体（示踪或检测抗体）对分析物-抗体复合物进行检测。由于夹心免疫测定要求分析物上至少存在两个可接近的抗体结合位点（即表位）才能发生反应，因此任何阳性荧光信号均表明样品中存在相对较大且结构复杂、寡聚或多聚形式的分析物，这些分析物与用于制备捕获抗体的抗原相同或高度相似。
尽管该方法所需样品体积小、样品前处...

在包括生物医学、环境生态学和天体生物学在内的许多领域中，对复杂天然微生物群落中微生物的检测与监测至关重要。Cyanobacteria 是一类原核微生物，以其在淡水中形成水华（细胞过度增殖）的能力而广为人知。它们分布广泛，许多种类能够产生毒素，不仅对人类健康构成潜在威胁，还会造成生态影响。因此，开发快速且灵敏的方法，用于早期检测土壤和水体中的cyanobacteria和/或其毒素，显得尤为必要。为此，已开发出一种多重荧光夹心微阵列免疫分析法（FSMI），作为供水管理者决策的辅助工具，从而有助于实施恰当的水资源管理方案。
已开发出多种方法用于检测和鉴定土壤与水体中的蓝藻细胞及蓝藻毒素，包括光学显微镜技术、分子生物学技术和免疫学技术。这些方法在所提供信息的类型上可能存在显著差异。显微镜技术基于细胞形态以及色素的检测 体内 来自蓝藻色素（如藻蓝蛋白或叶绿素a）的荧光1尽管这些方法快速且成本低廉，可用于实时和频繁监测，能够提供有关类型和数量的信息 蓝细菌 存在于样本中时，它们无法提供有关潜在毒性的信息。此外，这些方法需要一定的专业知识，因为区分亲缘关系相近的物种通常非常困难2为了克服这些局限性，必须结合生物学和生物化学筛选实验以及物理化学方法，对微囊藻毒素进行鉴定和定量，同时辅以光学显微镜检测。
酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质磷酸酶抑制试验（PPIA）以及小鼠神经化学检测是用于检测蓝藻毒素的生化筛查方法的示例。尽管前两种方法具有快速和高灵敏度的优点，但在使用ELISA时可能出现假阳性结果，而PPIA仅限于检测三类毒素。小鼠生物测定法是一种定性技术，其灵敏度和精确度较低，且需要特殊的许可和培训。此外，该方法无法提供样品中所含毒素种类的信息。蓝藻毒素也可通过其他分析方法进行鉴定和定量，例如高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）或基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）。然而，只有在具备用于测定复杂样品中单个毒素浓度所需的参比标准品时，这些方法才可行3,4。此外，这些方法耗时较长，需要昂贵的仪器、试剂和样品前处理过程，并且必须由经验丰富且具备专业技能的人员操作。
基于分子的方法已被应用于检测、鉴定和定量 蓝细菌 及其相应的蓝藻毒素，这得益于基因组数据库中已发布的序列信息（例如， 美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）。在这些方法中，包括基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，该技术需要设计用于DNA扩增的引物组合，并依赖于不同蓝藻物种DNA序列的先验知识。虽然基因检测（如藻蓝蛋白操纵子）可实现属水平的准确鉴定，但某些物种或菌株可能无法通过该方法检出。然而，毒素编码基因（如微囊藻毒素操纵子中的基因）能够促进在产毒生物含量较低的样品中对毒素的鉴定5然而，通过PCR检测到毒素标记物并不一定意味着环境中存在毒性。此外，为分析整个物种范围而开发的引物组 蓝细菌 且样本中存在产毒生物的种类仍未完全明确，仍需进一步研究以鉴定未知物种。其他非基于PCR的分子技术包括荧光法 原位 杂交（FISH）和DNA微阵列
在过去的二十年中，微阵列技术在许多应用领域中变得越来越重要，尤其是在环境监测方面。DNA微阵列可用于区分物种和分析物4,6,7,8,9,10，但该技术被认为非常耗时且劳动密集，涉及多个步骤（例如，微阵列性能、DNA提取、PCR扩增和杂交）。因此，基于抗体的检测方法，如夹心式和竞争性免疫微阵列，因其耗时较少，已成为检测多种环境分析物的一种重要且可靠的高通量方法11,12,13。抗体能够特异性识别其靶标化合物，并检测微量的分析物和蛋白质，加之几乎可以针对任何物质制备抗体，这使得抗体微阵列成为环境研究中的强大技术。此外，该方法能够在单次检测中实现多重分析，检测限可达ppb至ppm级别，是其主要优势之一14。
基于抗体的生物传感器已被证明是环境监测中检测多种病原体和毒素的灵敏且快速的工具15,16,17,18,19,20,21尽管DNA方法涉及多个步骤，基于抗体的微阵列仅需少量样本前处理，主要依赖于在适当溶液缓冲液中进行的短暂裂解步骤。Delehanty 和 Ligler15 报道了基于抗体夹心免疫分析法同时检测复杂混合物中的蛋白质和细菌分析物，该方法可检测低至4 ppb的蛋白质浓度以及104 细胞的菌落形成单位/mL。Szkola 等21 已开发出一种廉价且可靠的多重微阵列，可同时检测可能用于生物战的蛋白质毒素和小分子毒素。该方法在不到20分钟内实现了对蓖麻毒素的检测，检测限低至3 ppb。近期，CYANOCHIP——一种基于抗体微阵列的生物传感器——用于 原位 检测有毒与无毒 蓝细菌，已被描述22该微阵列可用于鉴定水体环境中难以通过显微镜识别的潜在蓝藻水华。微阵列的检测限为102 - 103 大多数物种的细胞，使该生物传感器成为一种经济高效的多重检测与鉴定工具 蓝细菌即使在物种水平上也是如此。所有这些特性使得抗体微阵列技术，尤其是本研究中介绍的方法，相较于上述技术更为快速和简便。
本研究展示了利用基于抗体微阵列的生物传感器检测土壤和水样中cyanobacteria存在的两个实验实例。该方法基于夹心免疫分析格式，操作简便、结果可靠，仅需极小的样品体积和极为基本的样品前处理。该方法耗时短，可方便地在野外进行。

<table><tbody><tr><td>0.22 mm 孔径滤器</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>用于免疫原的制备</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp; 5424R 微型离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>用于免疫原的制备</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4 (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011036</td><td>50 mM 磷酸钾，150 mM NaCl，pH 7.4</td></tr><tr><td>超声波处理器 UP50H</td><td>Hielscher</td><td></td><td>用于免疫原的制备</td></tr><tr><td>完全弗氏佐剂&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td>免疫增强剂</td></tr><tr><td>不完全弗氏佐剂</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F5506</td><td>用于加强免疫注射</td></tr><tr><td>Protein A 抗体纯化试剂盒&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURE1A&amp;nbsp;</td><td>用于 IgG 的分离</td></tr><tr><td>截留分子量&amp;lt;100 kDa 的离心过滤装置</td><td>Millipore</td><td>UFC510096-96K</td><td>用于 IgG 的分离</td></tr><tr><td>苯甲酰化透析管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7884-10FT</td><td>用于 IgG 的分离</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 柱&amp;nbsp;</td><td>GE-HealthCare</td><td>GE27-5330-02</td><td>用于 IgG 的分离</td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500 mL</td><td>用于定量抗体浓度</td></tr><tr><td>MicroBCA 蛋白定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td>用于定量抗体浓度</td></tr><tr><td>2x 蛋白点样缓冲液</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>S00537</td><td>打印缓冲液；含 0.01% Tween 20 的 1x PBS 中含 30–40% 甘油</td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9416</td><td>非离子型去垢剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9418</td><td>打印对照&amp;nbsp;；封闭试剂</td></tr><tr><td>384 孔微孔板</td><td>Genetix</td><td>X6004</td><td>用于抗体点样</td></tr><tr><td>多片载玻片机器人点样仪</td><td>Digilab MicroGrid II TAS 点样仪</td><td></td><td>用于抗体点样</td></tr><tr><td>环氧基底玻璃载玻片</td><td>Arrayit 公司</td><td>VEPO25C</td><td>抗体点样的固体支持物</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-647 琥珀酰亚胺酯&amp;nbsp;</td><td>Molecular probes</td><td>A20006</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8418</td><td>荧光染料溶剂</td></tr><tr><td>Heidolph Titramax 振荡平台摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>用于抗体标记&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 柱&amp;nbsp;</td><td>Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>用于纯化标记抗体</td></tr><tr><td>棕色安全密封 0.5 mL 管</td><td>Sarstedt</td><td>72,704,001</td><td>用于储存标记抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>用于定量抗体浓度和标记效率</td></tr><tr><td>3 &amp;micro;m 孔径、47 mm 直径聚碳酸酯滤膜</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td>用于细胞浓缩</td></tr><tr><td>1 M Trizma 盐酸溶液 pH 8</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T3038</td><td>用于 TBSTRR 的制备；封闭载玻片</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>用于 TBSTRR 的制备</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m 尼龙滤膜&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NY2004700</td><td>用于环境提取物的制备</td></tr><tr><td>10–12 mm 滤器支架</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td>用于环境提取物的制备</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P8340</td><td>用于环境提取物的储存</td></tr><tr><td>1 M Trizma 盐酸溶液 pH 9</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T2819</td><td>用于封闭载玻片</td></tr><tr><td>Heidolph Duomax 1030 摇床</td><td>VWR</td><td></td><td>用于封闭载玻片；孵育过程&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VWR Galaxy miniarray 微型离心机</td><td>VWR</td><td>C1403-VWR</td><td>用于干燥载玻片</td></tr><tr><td>多孔微阵列杂交盒</td><td>Arrayit 公司</td><td>AHC1X24</td><td>每张载玻片可进行 24 个检测的盒式装置</td></tr><tr><td>GenePix 4100A 微阵列扫描仪&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>荧光扫描仪</td></tr><tr><td>GenePix Pro 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>用于图像分析和定量的软件</td></tr></tbody></table>

检测实验方案 蓝细菌 使用抗体微阵列芯片检测液态和固态样品

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

全球变暖和富营养化使一些水生生态系统成为真正的生物反应器，引发蓝藻的快速且大规模增殖；这带来了显著的健康和经济影响。许多蓝藻菌株可产生毒素，仅需少量细胞即可对环境造成不可逆的损害。因此，水体管理机构和行政部门需要快速高效的早期预警系统，以获得可靠数据，支持其预防性或治理性决策。本文报告了一种利用含有17种具有分类学分辨能力抗体（Abs）的抗体微阵列芯片（CYANOCHIP）在野外检测产毒蓝藻菌株的实验方案。文中描述了一种多重荧光夹心微阵列免疫测定法（FSMI），可同时监测在淡水生态系统中频繁形成水华的17种蓝藻菌株，其中部分为产毒菌株。在同一张显微镜载玻片上打印了多个完全相同的CYANOCHIP微阵列（最多达24个重复），以实现对相似数量样本的同步检测。液体样本可直接与抗体（Abs）孵育，或先通过1至3 μm滤膜过滤浓缩细胞后再进行检测。固体样本（如沉积物和研磨岩石）则首先在孵育缓冲液中使用手持式超声波破碎仪进行均质化和分散处理，随后经5–20 μm滤膜过滤以去除粗颗粒，滤液再与抗体进行孵育。免疫反应通过最终与17种荧光标记抗体的混合物孵育而显色，并由便携式荧光检测仪读取结果。整个过程约需3小时，其中大部分时间为两次各1小时的孵育阶段。输出结果为一幅图像，其中亮斑代表蓝藻标志物的阳性检出。

本研究描述了一种多重免疫测定法，用于同时鉴定最重要的淡水蓝藻物种（表1），该方法基于CYANOCHIP抗体微阵列。微阵列可采用打印在显微镜载玻片上的3 × 8格式。每个微阵列包含一组17种抗体，以三重复点样模式打印，同时包括相应的前免疫抗体和牛血清白蛋白（BSA）作为阴性对照。微阵列还包含一个荧光边框，通过使用荧光标记的前免疫抗体，便于定位微阵列的图案22（图1）。
该微阵列在实地进行了测试 原位 对采自为马德里市供水的淡水洛索亚水库（Lozoya Reservoir）岸边的水样进行分析。样品处理方法如上所述，主要的阳性免疫反应对应于针对浮游生物的抗体 蓝细菌，例如 微囊藻 spp.（K4 和 K5），以及底栖的颤藻目（Oscillatoriales），例如 Leptolyng...

饮用水源中蓝藻毒素的存在是供水管理机构关注的主要问题。为评估水体污染风险，本文介绍了一种利用抗体微阵列芯片在现场检测液体和固体样品中蓝藻菌株的实验方案。

全球变暖和富营养化使一些水生生态系统表现为真正的生物反应器，从而引发蓝藻的快速且大规模生长；这一现象已……

本实验的总体目标是利用荧光微阵列免疫分析法检测液体和固体样品中多种蓝藻菌株的存在。该方法有助于回答环境监测和水资源管理领域中的关键问题，例如在藻华尚不可见于肉眼之前，检测产毒前体毒素细菌的存在。该技术的主要优势在于，可在三至四小时内同时检测多种蓝藻菌株和多个样品，既可在现场也可在实验室中进行。因此，该方法可为生物多样性研究提供见解，也可应用于其他领域，如农业设施监测、极端环境中的生命探测或行星探索。通常，初次接触该方法的人员不会遇到困难。由于样品处理简单且结果易于解读。根据文本方案制备并纯化抗体后，向含有标记染料的商用小瓶（含一毫克蛋白质）中加入100微升DMSO。待染料溶解后，向每50微升抗体溶液中加入2微升染料，对纯化的抗体进行标记。将标记反应在室温下置于振荡平台上持续振荡孵育一小时。根据文本方案纯化标记后的抗体，取少量样品加入分光光度计，测定280和650纳米处的吸光度。按照供应商的建议计算标记效率。制备CYANOCHIP时，将每种纯化抗体与蛋白打印缓冲液（1X）和体积分数为0.1%的Tween 20混合，配制成终浓度为每毫升含1毫克抗体的溶液，每种抗体准备30微升。同时准备以下打印溶液作为对照，每种30微升：含体积分数0.1% Tween 20的1X蛋白打印缓冲液。将每种蛋白A纯化的前免疫血清以1毫克/毫升的浓度溶于含0.1% Tween 20的1×蛋白打印缓冲液中，并加入1毫克/毫升BSA。将上述制备好的打印溶液每孔30微升加入高质量384孔微孔板中。根据文本方案设置好打印机器人和载玻片基底后，将所有抗体及对照以三份重复的点样模式点样至载玻片上，点样直径约为180至200微米。在环境采样时，使用无菌注射器收集1至100毫升液体，并通过孔径为3微米的滤膜过滤样品以浓缩细胞。如有需要，可从岩石或土壤中采集固体样品，并将其保存在无菌试管中。样品可在小型野外实验室中进行检测。加入1毫升提取孵育缓冲液以回收滤膜上收集的生物量，并使用刮勺将滤膜刮入15毫升离心管中。使用手持式超声处理器，或通过反复吹打数次，使该聚集体充分混匀并均质化。此外，在另一个10毫升离心管中称取最多0.5克的固体样品，并加入最多2毫升提取缓冲液。将超声探头浸入试管中，使用手持式超声处理器或其他超声设备进行超声处理。在保持样品处于冰浴的同时，以30千赫兹频率至少进行五个30秒的超声循环，每次超声之间间隔30秒。为制备免疫测定用的滤液提取物，使用10毫升注射器连接孔径为5至20微米的尼龙滤膜过滤装置，将溶液过滤至1.5毫升离心管中，以去除沙粒、黏土及其他粗颗粒物质。将芯片点阵面向下，将玻片置于100至200微升封闭液液滴上，孵育3至5分钟。使用塑料尖头镊子，避开芯片区域，小心夹起玻片。将玻片浸入新鲜封闭液中，在轻微振荡条件下孵育30分钟。为干燥载玻片，将其放入适用于显微镜载玻片的离心机中短暂离心。按照试剂盒说明书，将载玻片放入一个 3×8 孔的微阵列杂交盒中。或者，在修改抗体点样模式后，可使用定制的杂交盒（例如此处所示的杂交盒），也可直接使用盖玻片进行装置。在完成载玻片和样本盒的组装后，将每种样品提取物或其在提取孵育缓冲液中的稀释液最多50微升，用移液器加入样本盒的每个孔中。或者，可将样品加载到其他孵育装置中，或直接使用盖玻片。作为阴性对照，向样本盒中至少两个独立的孔内各加入50微升TBSTRR缓冲液。将样品在室温下孵育一小时，每15分钟用移液器吹打混匀一次；或者在4摄氏度下孵育12小时。洗涤微阵列时，将卡盒倒置，轻轻在洁净的吸水纸上轻拍。然后向每个孔中加入150 µL提取孵育缓冲液进行洗涤，并像之前一样通过在吸水纸上轻拍去除缓冲液。重复洗涤三次。向每个孔中加入50 µL含有17种抗蓝细菌菌株抗体的荧光抗体混合物。将样品在室温下孵育1小时，或在4°C下孵育12小时。洗涤芯片时，小心将芯片盒平放，轻轻在干净的吸水纸上轻拍。然后加入150微升提取孵育缓冲液，再通过在纸巾上轻拍去除缓冲液。重复洗涤三次。然后拆卸玻片盒，将玻片浸入0.1X PBS溶液中快速漂洗。同前快速离心以干燥玻片。使用荧光扫描仪，在远红荧光染料的最大发射峰处扫描玻片的荧光信号。通过改变增益值，以不同的扫描参数对微阵列进行多次成像。最后，加载网格，根据文本方案对数据进行定量、处理和分析。本视频中展示的CYANOCHIP多重免疫测定法用于同时鉴定本表所列的最重要淡水蓝藻物种。采集自淡水水库岸边的水样通过微阵列检测法进行了分析。主要的阳性免疫反应对应于浮游性蓝藻微囊藻属（Microcystis）和底栖性蓝藻Leptolyngbya属的抗体。对于浮游性的念珠藻目（Nostocales）中的Aphanizomenon属、Anabaena属、微囊藻（Microcystis flos-aquae）以及底栖性Rivularia属，获得的荧光信号较弱。还通过检测南极干燥微生物垫来验证该微阵列，以测试是否存在蓝细菌标记物。抗体对底栖蓝细菌、鱼腥藻属（Anabaena species）和细鞘丝藻属（Leptolyngbya species）产生了阳性反应。使用针对浮游蓝细菌的抗体还检测到额外的阳性免疫反应，例如微囊藻属（Microcystis species）、束丝藻属（Aphanizomenon species）和红环丝藻（Planktothrix rubescens species）。最后，这些信号来自针对其他底栖物种的抗体，包括束丝藻属（Tolypothrix species）和鱼腥藻属（Anabaena species）的抗体。一旦掌握该技术，若操作得当，排除抗体制备和平衡步骤，整个过程可在三到四小时内完成。通过同时孵育样品与荧光标记抗体，可节省约一小时时间。在进行这些操作时，重要的是要记住将荧光抗体混合物配制好，并确保抗体处于其最佳工作稀释浓度。完成这些步骤后，还可采用其他方法，如光学显微镜观察、DNA提取及特异性PCR扩增，以回答更多问题，例如土壤中的浓度或确认所检测到的菌株类型。该技术建立后，将为环境监测领域的研究人员探索水体、双培养过程、淡水管理或微生物生态学研究提供新的途径，而无论样品类型如何。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用荧光标记抗体、操作抗体微阵列、进行多重免疫测定，以及分析和解读微阵列免疫测定结果。请务必注意，超声操作可能存在危害，在执行这些实验步骤时，应始终采取预防措施，例如佩戴听力保护装置或其他特定防护措施。

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用于检测实验方案蓝藻与抗体基因芯片液体和固体样品

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我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

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使用电化学传感器进行细菌检测与鉴定

该视频展示了一种基于细胞的检测方法，用于检测抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G，该方法使用含有未转染细胞和表达水通道蛋白-4的转染细胞的生物芯片。此方法可用于视神经脊髓炎谱系疾病的诊断，诊断依据为生物芯片上出现强烈的绿色荧光。...

一种检测血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G的实验方法

本视频展示了一种利用抗体微阵列芯片检测环境样品中蓝细菌菌株的方法。含有多种细菌的样品与固定在芯片上的抗体发生相互作用，通过荧光标记的抗蓝细菌菌株抗体进行免疫染色，可在不同位点观察到特异性荧光信号，从而揭示特定蓝细菌菌株的存在。...

一种利用抗体微阵列芯片检测蓝细菌菌株的技术

本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。...

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

本文介绍了一种用于在大体积农业用水中对食源性病原体进行一体化浓缩、富集及终点比色检测的方案。该方法通过改良莫尔棉签（Modified Moore Swabs,...

基于比色法的纸质检测 大肠杆菌, 沙门氏菌 和 spp. 单核细胞增生李斯特菌 从大量农业用水中

本文视频介绍了一种基于体外微阵列的 in vitro...

DNA亲和纯化芯片（DAP-chip）法用于确定细菌双组分调控系统的目标基因

基于细胞的检测方法是一种广泛用于检测血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G的常用技术。该方法可应用于视神经脊髓炎谱系障碍的临床诊断和科学研究。...

基于细胞法检测人血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G

基于电润湿的数字微流控技术是一种利用电压驱动微升体积液滴的表观接触角变化来实现液滴操控的方法。将该技术与功能化磁珠相结合，可集成多种实验室单元操作，用于基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的病原体样本制备与鉴定。...

基于电润湿的数字微流控平台用于自动化酶联免疫吸附测定

多种细菌性病原体可引起呼吸道感染，若未能准确检测并及时治疗，可能导致严重的健康问题。通过环介导等温扩增技术 对这些病原体进行快速且准确的检测，有助于在临床环境中有效管理和控制呼吸道感染。...

基于微流控芯片的环介导等温扩增技术快速检测引起下呼吸道感染的细菌性病原体

学习使用荧光微阵列免疫分析法检测液体和固体样品中的多种蓝藻菌株。该方法可在三至四小时内同时监测多个样品，适用于环境监测、水资源管理和微生物生态学研究。

检测实验方案蓝细菌使用抗体微阵列芯片检测液态和固态样品

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检测实验方案 蓝细菌 使用抗体微阵列芯片检测液态和固态样品

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