Name: 支架支持胰岛移植糖尿病小鼠附睾脂肪垫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学习小鼠胰岛分离与支架支持移植技术，将胰岛种植于脱细胞支架后植入糖尿病小鼠附睾脂肪垫。该方法可有效逆转高血糖，为糖尿病治疗研究提供可靠的实验方案。

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作者感谢冠昊生物科技股份有限公司的Wei Zhang提供了脱细胞支架。感谢彭小红的有益讨论。本研究由国家自然科学基金（项目编号：31322021）提供资金支持。

所有实验均经北京大学实验动物福利与使用委员会（IACUC，批准号：COE-LuoY-1）批准。
1. 胰岛分离
<ol>
	<li>试剂与仪器的准备
	<ol>
		<li>将胶原酶P粉末（2 U/mg）用HBSS重悬，配制成5 mg/mL溶液，并通过一个滤器过滤 0.22 µm 过滤以去除细菌。在15 mL锥形管中制备含胶原酶P的0.6 mL分装溶液，并于-20 °C. 
		注意：使用时，每份等分试样用HBSS稀释，配制成6 mL工作液，终浓度为0.5 mg/mL或1 U/mL（足以处理3只小鼠）。工作液置于冰上，供1小时内立即使用。工作液不得重复使用或再次冷冻。</li>
		<li>通过向HBSS中加入FBS（2.5%）和P/S（1%）配制中和溶液；将溶液置于冰上保存。每处理6只小鼠需准备60 mL中和溶液。</li>
		<li>在RPMI 1640培养基中添加D-葡萄糖（7 mM）、胎牛血清（10%）和青霉素-链霉素溶液（1%），配制胰岛培养基。</li>
		<li>对手术器械进行高压灭菌 115 °C 30分钟，15 psi压力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰腺的膨胀。
	<ol>
		<li>按照步骤1.1.1所述，为6只小鼠（12周龄）配制12 mL胶原酶工作液。用9 mL工作液填充10 mL注射器，并将注射器连接至27 G静脉穿刺针。将注射器置于冰上保存，并在1小时内使用该溶液。</li>
		<li>通过颈椎脱位处死小鼠。将小鼠仰卧置于纸巾上，尾部朝向操作者。用70%乙醇喷洒整个小鼠身体，使其完全湿润。</li>
		<li>使用解剖剪和镊子，从生殖区开始向横膈膜方向做V形切口。将胸部皮肤向外翻折，完全暴露腹腔。</li>
		<li>将肠管移至小鼠右侧，暴露胰腺和胆总管。用镊子小心夹住十二指肠并轻轻牵拉，直至胆管绷紧图1A-1 和 A-2).</li>
		<li>找到通向肝脏的门静脉和胆管。用显微止血钳夹住门静脉和胆管。 
		注意：夹闭可防止过度出血以及胶原酶进入肝脏。</li>
		<li>用镊子夹住肠道的同时，找到连接胆管与十二指肠的壶腹部位置。将27G静脉注射针经壶腹部插入胆总管图1B-1 和 B-2).</li>
		<li>分配约 200 µL 加入胶原酶工作液以检查插管是否完全通过胆管。如果胶原酶溶液开始充盈胆管（ 图1C-1 和 C2），针头位于导管腔内；使用动脉止血钳夹闭包含针头的导管段，并在1分钟内以缓慢且恒定的速度注入剩余的2 mL溶液（图2A-1, A-2，以及 B-1). 
		注意：如果导管周围的组织开始膨胀（图2B-2），说明针已刺穿胆管壁，需重新调整针的位置并再次尝试胆管插管。同样，如果十二指肠开始膨胀（图 2C-1 和 C-2），需要调整动脉止血钳并重新插管胆管。随着胶原酶溶液灌注进入胰腺，靠近十二指肠的组织首先膨胀，随后是靠近胰尾的区域。胰尾部（脾叶）的灌注对于最大化胰岛产量至关重要。</li>
		<li>胰腺完全充盈后（图2C-1），将小鼠肠管推向左侧，从降结肠处开始分离并切除胰腺。用镊子提起肠管，并用另一把镊子将肠管与胰腺分离。继续操作直至胰腺与胃上部完全脱离。最后将胰腺从腹腔中提起，并将其与残留的脾脏组织完全剪离。 
		注意：整个分离过程应迅速进行，因为消化在去除过程中仍在持续。</li>
		<li>将胰腺置于一个空的15 mL圆锥形离心管中，并置于冰上。对剩余小鼠重复上述操作。所有胰腺须在1小时内立即进行后续1.3步骤的处理，以防止胶原酶P过度消化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="解剖图和解剖图像显示手术设置中的胆管、壶腹、肝脏、肾脏。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1：照片显示胆管插管及用胶原酶溶液灌注胰腺的操作过程。（A1）牵拉十二指肠，使胆管绷紧。（壶腹：十二指肠表面呈三角形的乳白色区域；胆管：表面呈绳索状的乳白色结构）。（B1）从壶腹处将针头插入胆管。（C1）通过注射酶液使胰腺膨胀。（A2、B2 和 C2）分别为 A1、B1 和 C1 中所示操作的示意图。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="导管灌注实验示意图，显示染料注射过程及导管和十二指肠的变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：插管操作的故障排除。（A1）针尖插入胆管管腔内。（A2）导管中充满酶溶液。（B1）针头插入胆管管腔，导管内充满蓝色染料。（B2）由于插管不当，针头位于胆管下方，注入蓝色染料后仅观察到囊状结构膨胀。（C1）成功插管的标志是胰腺出现膨胀。（C2）由于夹闭不当，蓝色染料进入十二指肠并引起膨胀。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>胰岛的消化与纯化
	<ol>
		<li>将含有灌注胰腺的锥形管置于 37 °C 17 分钟 
		注意：孵育时间可能因动物的年龄和物种而异。</li>
		<li>通过加入 7 mL 中和溶液并将试管置于冰上终止消化反应。</li>
		<li>通过剧烈振荡试管来解离组织（例如， 10 秒内匀浆 20 次，直至获得细小的组织颗粒。 
		注意：如果胰腺未能完全解离，胰岛产量将会很低。</li>
		<li>将消化后的组织样本通过0.5 mm金属滤网过滤，以去除未消化的组织块。将胰岛悬液收集至新的50 mL锥形管中。</li>
		<li>将离心管在 230 x g 条件下离心 3 分钟，并 4 °C 小心倾倒上清液，避免扰动组织沉淀。</li>
		<li>将来自3只小鼠的沉淀物用4 mL多蔗糖密度梯度溶液重悬，轻轻涡旋或吹打数次。沿管壁缓慢加入4 mL HBSS，覆盖在多蔗糖溶液上层。 
		注意：两种溶液应形成明显分层，具有清晰的界面。 
		注意：加入 HBSS 时应小心操作，避免扰动底部的聚蔗糖密度梯度。</li>
		<li>将悬液在 900 × g 条件下离心 20 分钟，并 4 °C 通过选择非常慢的加速度来实现。离心结束时不使用刹车。 
		注意：此步骤用于从外分泌细胞中纯化胰岛，大部分胰岛将迁移至多蔗糖溶液与HBSS层之间的界面，而大部分外分泌细胞则沉降至底部。</li>
		<li>使用大口径15 mL移液管完全移除8 mL上清液。将溶液通过倒置的70-µm 筛网 
		注意：胰岛将被进一步纯化并保留在滤器中，而外分泌细胞则会通过滤膜。 
		注意：聚蔗糖密度梯度对细胞具有毒性；过滤步骤将有助于胰岛摆脱聚蔗糖。</li>
		<li>用移液器将2 mL冷中和液加入35 mm培养皿中。将细胞滤筛翻转至正面朝上，将滞留胰岛的一面浸入溶液中，轻轻晃动以释放胰岛。</li>
		<li>在显微镜下使用20-逐个挑选胰岛µL 带白色吸头的移液器 
		注意：胰岛呈淡黄色、致密的细胞团块（图3A），而在解剖显微镜下，污染的外分泌组织或细胞呈暗黑色且结构疏松。</li>
		<li>将约200个胰岛置于含2 mL培养基的35 mm培养皿中，孵育于 37 °C 在含有5% CO₂的培养箱中2 12 小时。 
		注意：通常可从一只12周龄的C57BL/6J小鼠中收获150–300个胰岛。胰岛在培养过程中容易形成聚集体，较大的胰岛（&gt;300 µm) 易发生中心坏死（图1B，插图）。充分振荡悬液，使培养皿中的胰岛均匀分散，减少结团。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 支架上的胰岛培养
注：DCS 的孔隙率约为 79%，厚度约为 0.6 mm，孔径范围为 12 至 300 µm。
<ol>
	<li>将支架切成7-mm的圆片，用70%乙醇浸泡，并用HBSS洗涤。将支架放入24孔组织培养插件中。 
	注意：过夜培养后，新鲜胰岛呈现明亮、致密的形态，边界光滑（图3B）。</li>
	<li>轻轻晃动培养皿，使用带白色吸头的20 µL移液器从皿中央收集胰岛。用移液器将胰岛转移至支架上（每支架250个胰岛），并向孔中加入2 mL培养基。移植前培养12小时。</li>
</ol>
3. 在EFP位点进行胰岛移植
<ol>
	<li>在受体小鼠中诱导糖尿病。
	<ol>
		<li>将 C57BL/6J 小鼠（10 周龄以上）放入新笼中，提供饮水但不提供食物。在诱导糖尿病前禁食 10 小时。</li>
		<li>通过混合 0.1 M 柠檬酸与 0.1 M 柠檬酸钠，配制 pH 值为 4.2–4.5 的缓冲液。将 STZ（10 mg/mL）溶解于新配制的缓冲液中，并通过 0.22 µm 滤器过滤以灭菌。 
		注意：STZ 对光敏感，10 分钟内会失活；务必在注射前现配现用。</li>
		<li>以每只 C57BL/6J 小鼠 140–150 mg/kg 的剂量，对每只小鼠进行腹腔注射 STZ。 
		注意：剂量因动物年龄和品系而异。建议在正式实验前，先对目标品系进行小规模剂量优化试验。</li>
		<li>在 STZ 注射后第 2、3、4 天，采集尾静脉血，使用血糖仪监测血糖水平。 
		注意：若动物连续两天出现高血糖（非禁食血糖 &gt; 16.7 mM），即可进行胰岛移植。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胰岛移植至 EFP 部位。
	<ol>
		<li>通过腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉小鼠。将小鼠仰卧置于纸巾上，尾巴朝向操作者。广泛剃除腹部毛发，以清除切口周围区域的毛发。用胶带固定四肢，并交替使用酒精和碘伏棉片以环形方式彻底擦拭皮肤，对切口部位进行消毒。用无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露切口区域。在靠近生殖器区域的中线位置，通过腹膜壁做一 7 mm 的切口。 
		注意：手术过程中使用的所有器械（包括手套）均应无菌。</li>
		<li>用镊子轻柔地夹取并从腹腔中取出 EFP。将 EFP 展平于湿润的无菌纱布上。将含有胰岛的支架放置于 EFP 上，并折叠 EFP 以包裹移植物。使用可吸收的 6-0 缝线缝合 EFP，确保胰岛与 EFP 之间直接接触。用浸有无菌生理盐水的棉签润湿 EFP 表面，防止其干燥。</li>
		<li>轻柔地将 EFP 放回腹腔内。通过缝合腹膜壁并用伤口夹夹闭皮肤层来关闭切口。</li>
		<li>皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）作为镇痛剂。</li>
		<li>皮下注射 1 mL 生理盐水，以防止脱水。</li>
		<li>将小鼠置于加热垫上的笼中，直至其从麻醉中恢复。</li>
		<li>两天后通过采集尾静脉血检测非禁食血糖水平。若需取出移植物，重复上述移植操作，轻柔地拉出 EFP，使用 3-0 缝线结扎靠近附睾的脂肪垫末端，阻断血管，取出 EFP 移植物，并保存用于组织学分析。 
		注意：取出胰岛后，受体小鼠应在 3 天内再次出现高血糖，以确认移植物功能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

胰腺灌注和消化时间是影响胰岛产量和质量的两个关键参数。Moskalewski 首次报道使用粗制胶原酶混合物消化剪碎的豚鼠胰腺11。Lacy et al. 报道了将酶注入导管系统以灌注胰腺，显著提高了胰岛产量12。通过导管灌注酶可使胰腺表面积最大程度地暴露于酶中，与消化剪碎的胰腺相比，能够实现更均匀的消化，并释放出更多完整的胰岛13。根据我们的经验，成功插管胆管并完成整个胰腺的灌注是获得高胰岛产量的前提条件。这是因为与靠近十二指肠的胰腺组织相比，胰腺尾部（脾叶）实际上含有更多的胰岛。文献中报道了两种胆管插管方法：i）在靠近肝脏的位置插入针头，同时阻止酶进入十二指肠13,14；ii）在靠近十二指肠的位置插入针头，同时阻止酶进入肝脏15。本文采用后一种技术，该方法无需弯曲针头或重新定位小鼠。按照本方案，一名训练有素的研究...

1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性内分泌疾病，患者的胰岛细胞被免疫系统破坏，导致其终生依赖外源性胰岛素注射。埃德蒙顿方案（Edmonton protocol）是胰岛移植临床研究中的一个里程碑；该方案通过门静脉输注胰岛，并将其移植至肝内部位1。然而，供体胰岛来源不足和胰岛移植后植入效果差这两个主要障碍，限制了胰岛移植的广泛应用2。通常需要从三名尸体供体中获取胰岛才能逆转一名患者的高血糖状态；这主要是由于胰岛分离过程的得率较低以及移植后的胰岛丢失。特别是，尽管移植后的胰岛处于富氧血液环境中，但与血液的直接接触常引发即刻性血液介导的炎症反应（IBMIR），从而导致胰岛的急性丢失。从长期来看，患者体内胰岛的逐渐丢失被认为是临床组中糖尿病逆转率下降的原因，该逆转率在移植后第一年可达90%，至2年和5年时分别下降至30%和10%3。
胰岛移植到肝外部位已成为一种有吸引力的策略，可在将移植物限制于更明确位置的同时，减少胰岛与血液的直接接触，相较于肝内输注具有优势。近年来，已有研究在肾包膜、眼、肌肉、脂肪垫以及皮下空间等部位开展，结果表明这些部位的胰岛能够存活并发挥功能，恢复正常的血糖水平4。此外，这些部位的胰岛可被取出，使得活检甚至后续的替换操作成为可能。因此，肝外部位在临床移植中展现出巨大潜力5。
基于生物材料的支架已广泛用于细胞移植和组织工程研究。三维（3D）支架通常具有多孔结构，可作为细胞模板以引导细胞的空间结构与排列，也可作为储库实现生物活性信号的可控释放。已有研究采用聚合物材料（如聚乙交酯-L-丙交酯）6、聚二甲基硅氧烷7和热塑性聚氨酯8制备支架，用于在腹膜外前间隙（EFP）移植胰岛。与直接移植胰岛相比，使用支架可防止胰岛泄漏至腹腔内，从而减少胰岛丢失9,10，并提供机械保护、调节局部炎症反应。因此，支架有望被开发用于促进移植部位胰岛的植入与存活7。
本研究旨在展示一种在小鼠模型中使用脱细胞支架（DCS）进行包膜下腹膜前（EFP）胰岛移植的范例。近年来，来源于细胞外基质的支架材料因其相比合成材料具有更优异的生物相容性和更接近天然的多孔结构而受到广泛关注。本文描述了一种高效、稳定的胰岛分离方案，可从C57BL/6J小鼠中获得高产量的胰岛。随后将胰岛接种于牛心包来源的脱细胞支架（DCS）上，并将移植物移植至同基因型糖尿病小鼠的EFP部位。移植后，小鼠在10天内恢复血糖正常，并维持 normoglycemia 长达100天，直至移植物被移除。

<table><tbody><tr><td>解剖剪</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 直径金属网</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>动脉止血钳</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微止血钳</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可吸收性6-0 PGLA缝合线&amp;nbsp;</td><td>JINHUAN</td><td></td><td>带针</td></tr><tr><td>伤口夹</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌铺巾</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 静脉注射针头</td><td>JINGHUAN</td><td>0.45x15 RWSB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 未经处理&amp;nbsp;培养皿</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤器</td><td>Pall</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 S1</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>移液器（2–20 &amp;mu;L）</td><td>Axygen</td><td>AP-20</td><td>AXYPET&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C14175500CP</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 P</td><td>Roche</td><td>COLLP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11879-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Gibco</td><td>A24940-01</td><td></td></tr><tr><td>血糖仪</td><td>Roche</td><td></td><td>ACCU-CHEK</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>链脲佐菌素</td><td>Sigma</td><td>V900890</td><td>Vetec&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>J&amp;K</td><td>C0073</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>碘伏</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J，10–12 周龄</td><td>VitalRiver</td><td></td><td>中国北京</td></tr><tr><td>脱细胞支架</td><td>冠昊生物</td><td>131102</td><td>中国广州</td></tr></tbody></table>

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

胰岛移植在临床上已被证实对治疗1型糖尿病有效。然而，目前的肝内移植策略可能引发急性全血反应，并导致胰岛移植存活率较低。本文报道了一种在糖尿病小鼠模型中将胰岛移植至肝外部位——附睾脂肪垫（EFP）的可靠方案。文中描述了从C57BL/6J小鼠中高产量分离和纯化胰岛的流程，以及通过将胰岛接种于脱细胞支架（DCS）上，并将其植入经链脲佐菌素诱导糖尿病的同系C57BL/6J小鼠EFP部位的移植方法。含有500个胰岛的DCS移植物在10天内即可逆转高血糖状态，而未使用DCS的游离胰岛则至少需要30天。正常血糖水平可维持长达3个月，直至移植物被取出。综上所述，DCS可增强胰岛在肝外EFP部位的植入效果，且该部位易于获取，可能为研究支架材料及其他实现成功胰岛植入所需的移植参数提供一个可重复且实用的平台。

与结扎缝合技术相比，我们采用显微止血钳进行夹闭的方法更为简便且节省时间。从6只小鼠中分离并纯化约1,200个胰岛大约需要4小时。在光学显微镜下，新分离的胰岛通常边缘粗糙（图3A）。胰岛在经历分离过程后恢复一段时间，会呈现明亮、致密的形态，并具有光滑的表面。然而，分离过程带来的应激仍可能诱导细胞死亡，导致胰岛表面细胞脱落，不健康的胰岛常含有深色坏死核心（图3B）。我们测量了来自5只小鼠的945个胰岛的直径，计算得出胰岛平均直径为130.42 ± 41.75 µm（图3C）。
为避免受体产生免疫排斥，我们在C57BL/6J小鼠中进行了同系移植。通常，将500个负载DCS的胰岛移植至EFP部位，可在10天内逆转高血糖，而游离胰岛组则需30天。血糖正常水平可维持约100天，直至移植物...

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。

胰岛移植在临床上已被证实对治疗1型糖尿病有效。然而，目前的肝内移植策略……

大家好，我是来自北京大学生物医学工程系Lowe博士实验室的Kai Wang。目前，1型糖尿病患者主要通过注射胰岛素进行治疗，但这种方法无法完美模拟胰岛分泌胰岛素的生理过程。通过胰岛移植来替代丢失的胰岛，能够实现稳定的血糖控制，避免严重的血糖波动。然而，大量制备高质量胰岛的需求以及较低的移植定植效率限制了其在临床上的广泛应用。今天，我将向您展示胰岛分离的过程，以及将支架支持的胰岛移植到糖尿病小鼠附睾脂肪垫中的操作步骤。这些步骤需要对组织结构有充分的了解，并具备熟练的手术操作技能。用乙醇喷洒整个身体。从生殖区域开始做V形切口。从右侧取出小鼠的肠道。用止血钳夹住门静脉和胆管。用镊子小心夹住十二指肠，并牵拉十二指肠直至胆管绷紧。将静脉注射针经十二指肠大乳头插入胆总管。使用超细止血钳夹住含有针头的导管段。以缓慢且恒定的速率注入胶原酶溶液。胰腺完全膨胀后，将肠管从小鼠左侧推出。可见胰管已完全膨胀。从降结肠起始端开始，移除胰腺。用镊子提起肠管，并用另一把镊子将肠管与胰腺分离。继续分离胰腺，直至其完全与胃的上部脱离。最后，将胰腺从腹腔中取出，并切断其与残留脾脏的连接。将胰腺放入锥形管中，置于冰上运输。孵育灌注后的胰腺。加入中和溶液以终止消化过程。通过剧烈振荡试管来分离两种悬液。将消化后的组织样本通过金属滤网过滤，收集胰岛悬液至新的锥形管中，离心处理。小心倒出上清液，避免扰动组织沉淀物。用移液管将沉淀物在Histopaque中上下吹打数次，重新悬浮。沿离心管管壁缓慢将HBSS加入至Histopaque溶液的上层。两种溶液应形成明显分层，具有清晰的界面。将悬液离心20分钟。大多数胰岛会迁移至Histopaque与HBSS层的界面处。移除全部上清液，并将溶液通过倒置的滤网。胰岛将被滤网截留。将截留有胰岛的滤网表面浸入溶液中，轻轻振荡以释放胰岛。在显微镜下用手挑选分离的胰岛。将胰岛收集到新的培养皿中。如果导管周围组织开始膨胀，说明针头已穿过胆管壁。需要重新调整针头位置，并再次尝试插管胆管。随着溶液注入，胰腺逐渐充盈，靠近十二指肠的组织首先膨胀，随后是靠近胰尾的区域。如果十二指肠开始膨胀（如图中蓝色染色所示），应调整动脉夹，并重新夹闭胆管。将小鼠置于仰卧位。剃除腹部毛发，然后用碘伏擦拭以对皮肤进行消毒。用无菌手术巾覆盖小鼠。在靠近生殖区域的腹部中线处，通过腹膜壁做一小切口。轻轻抓住并从腹腔中拉出附睾脂肪垫。将脂肪垫铺展在湿润的纱布上。将含有胰岛的支架放置在脂肪垫上，并折叠脂肪垫以包裹移植物。缝合脂肪垫，以固定包裹在脂肪垫内的胰岛。轻柔地将脂肪垫放回腹腔内。缝合腹膜壁以关闭小鼠腹部切口。使用伤口夹夹住皮肤层。皮下注射适当剂量的镇痛药和抗生素。新鲜分离的胰岛在光学显微镜下通常具有粗糙的边缘。胰岛一旦从分离过程中恢复，会显得明亮、致密，并具有光滑的表面。计算得出的胰岛平均直径约为130微米

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

支架支持胰岛移植糖尿病小鼠附睾脂肪垫

本方案旨在小鼠肾包膜下清晰、简便地移植胰岛或细胞。细胞在最终用于移植的导管中被浓缩成团。该技术操作简便，可减少对细胞和小鼠造成的应激损伤。...

将胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下

已提出移植分离的胰岛可能成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。本文介绍一种从小鼠胰腺中分离胰岛并将其移植至肾包膜下空间的方法。...

小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

介绍了一种在小鼠体内进行网膜移植胰岛的方法。分离的胰岛与水凝胶混合后，将混合物植入糖尿病小鼠的网膜囊内。随后监测血糖水平，并进行免疫组织化学分析。...

一种将胰岛移植至小鼠大网膜的方法

胰岛移植是一种实现1型糖尿病患者血糖正常化的方法。本文重点介绍通过门静脉途径进行移植的技术，以维持糖尿病小鼠的正常血糖水平。...

小鼠模型中胰岛的门静脉移植

本文介绍了一种基于水凝胶的细胞治疗体内验证方案，以胰岛移植为例进行说明。人网膜基质胰岛原位植入（hOMING）技术可将细胞-水凝胶混合物植入网膜层之间，靠近血管分布区域，从而在适宜的代谢环境中最大限度地提高细胞植入效率。...

利用人网膜基质胰岛填充技术（hOMING）进行网膜内胰岛移植

本方案描述了一种小鼠胰岛分离及将其移植至腹股沟皮下白色脂肪组织的方法。将分离的同系小鼠胰岛利用基底膜水凝胶移植到小鼠受体体内。监测受体的血糖水平，并对胰岛移植物进行组织学分析。...

小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）移植模型

这种脂肪包裹的胰岛移植方法适用于检测腹膜腔内植入的胰岛。值得注意的是，该方法无需使用生物结合剂或缝合。...

利用附睾白色脂肪组织进行脂肪包裹的胰岛移植

本文介绍了在小鼠体内成功实施门静脉内胰岛移植的优化手术步骤。该手术是一种具有临床相关性但技术上具有挑战性的外科操作。...

小鼠肝内胰岛移植过程中减少输注后门静脉出血的方法

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小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

基于心动图模型对二尖瓣血流进行分析，已实现对全球舒张功能的准确、基于因果关系的量化 通过 参数化舒张期充盈（Parametrized Diastolic Filling, PDF）模型。PDF...

通过基于运动学模型的跨瓣血流分析及参数化舒张充盈形式对整体舒张功能进行定量评估

学习小鼠胰岛分离与支架支持移植技术，将胰岛种植于脱细胞支架后植入糖尿病小鼠附睾脂肪垫。该方法可有效逆转高血糖，为糖尿病治疗研究提供可靠的实验方案。

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

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