Name: 应用改良袖套技术的小鼠胰腺移植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 学习小鼠胰腺移植改良袖套技术，用于研究缺血再灌注损伤对移植物存活的影响。该模型通过无缝合血管吻合方法，为移植生物学和早期移植物损伤机制研究提供可靠实验平台。

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本工作获得了资助编号 #2008-1-596 和 #UNI-0404/1956 的支持 &#34;蒂罗尔科学基金会（TWF）&#34; （https://www.tirol.gv.at/en/）以及蒂罗尔州政府资助项目编号 #2013-042018 &#34;MUI-Start 资助计划&#34; 因斯布鲁克医科大学

为避免同种免疫反应，并严格研究缺血再灌注损伤相关的移植物损害，应采用同系型供体-受体配对。在本方案中，使用雄性C57BL6（H2b使用体重为26至28克的10至12周龄小鼠作为体型匹配的供体-受体配对。所有动物均饲养于屏障级无病原体设施中，并按照符合 &#34;实验室动物护理原则&#34; 由中国医学研究学会制定的 &#34;实验动物护理和使用的指南&#34; 由美国国家科学院制定，并由美国国立卫生研究院出版（NIH 出版物编号 86-23，1985 年修订版）。本手稿中描述的实验已获得奥地利教育、科学与文化部批准（BMWF-66.011/0056-II/3b/2011）。
1. 胰腺获取
<ol>
	<li>使用27号（G）针头，通过腹腔内（i.p.）注射赛拉嗪（5 mg/kg体重）和氯胺酮（100 mg/kg体重）对供体动物进行麻醉。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除腹部区域的毛发，并用胶带将小鼠仰卧位固定在手术区域。</li>
	<li>用浸有氯己定的纱布对手术区域进行三次擦拭消毒。</li>
	<li>使用剪刀沿中线做腹部切口，并向双侧肋缘下延伸。用无菌棉签轻轻将内脏向左外翻，并用湿润纱布包裹。用蚊式钳向上提起剑突，以充分暴露腹腔，便于后续操作。</li>
	<li>使用19 G针头，向下腔静脉（IVC）注入400 µL无菌的1:4肝素-氯化钠溶液以实现肝素化。拔出针头后，通过横断主动脉放血的方式处死动物。</li>
	<li>用弯头镊子轻轻分离纤维组织，在肠系膜上动脉起始处与右肾动脉之间解剖腹主动脉。游离腹主动脉下方并用8/0丝线结扎。</li>
	<li>辨认连接幽门后段十二指肠与肝脏门部的肝十二指肠韧带。在远端结扎后，于胆囊管汇入处下方切断胆管，并尽可能向远端游离并横断门静脉，以保证受体吻合时有足够的长度。</li>
	<li>使用弯头镊子从先前结扎处（见步骤1.6）开始钝性分离腹主动脉。用弯头镊子游离主动脉周围组织，以8/0丝线结扎，并用剪刀横断。
	<ol>
		<li>使用双极电凝镊凝固所有腰动脉分支，并尽可能靠近膈肌处用剪刀横断主动脉，以提供足够的血管吻合长度。最后，在左肾动脉上方横断已结扎的主动脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过腹主动脉，使用19 G注射器以顺行方式灌注5 mL 4 °C的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）灌注液对胰腺进行灌洗，直至门静脉流出液变清亮。操作时施加低压以避免水肿形成。 
	注意：为避免因温缺血导致移植物损伤而引入偏倚，应快速且标准化地完成步骤1.5至1.9。</li>
	<li>使用无菌棉签将内脏复位至腹腔内。</li>
	<li>使用弯头镊子从幽门后段十二指肠开始逐步分离胰腺，向前推进直至抵达屈氏韧带。在此过程中，应识别胰腺与十二指肠壁之间的无血管结缔组织区域。
	<ol>
		<li>使用弯头镊子钝性分离这些区域，以游离胰腺与十二指肠之间的桥接血管。对每根游离出的血管结构绕行8/0丝线并结扎。</li>
		<li>最后，用剪刀朝向十二指肠壁方向横断该血管结构。以相同方式，使用8/0丝线将胰腺与肠系膜、横结肠及胃部分离。 
		注意：在此过程中，胆胰管将被结扎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胃向上提起，辨认从脾脏至胃的胃脾韧带及短胃支，并用剪刀切断。保留脾脏附着于获取的移植物上。 
	注意：为最大限度减少移植物复温，应持续使用装有冰上保存的4 °C HTK灌注液的10 mL注射器（配19 G针头）对胰腺进行冲洗。</li>
	<li>最后，用镊子夹住脾脏，将胰腺从供体部位取出（图1B），并转移至受体动物。
	<ol>
		<li>或者，为诱导严重的缺血再灌注损伤，可在植入受体动物前将移植物置于无菌、4 °C的灌注液中保存16小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 受体准备
<ol>
	<li>使用27 G针头，通过腹腔注射给予受体动物赛拉嗪（5 mg/kg体重）和氯胺酮（100 mg/kg体重）进行麻醉。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除右侧颈外侧区域的毛发，将小鼠仰卧位放置于手术区域，并用胶带固定四肢。注意避免过度拉伸前肢，以免影响呼吸。</li>
	<li>使用浸有氯己定的纱布对手术区域进行三次擦拭消毒。</li>
	<li>从颈静脉切迹至右侧下颌角，做一右侧旁正中略偏斜的皮肤切口。</li>
	<li>钝性分离并游离右侧颈外静脉的侧支血管，使用双极电凝镊凝固后，用剪刀切断。</li>
	<li>将下颌下唾液腺的右叶向头侧抬起，辨认其血管蒂，使用双极电凝镊进行电凝，随后用剪刀切断已电凝的血管蒂，摘除该腺叶。</li>
	<li>参照步骤2.5，辨认颈外静脉的所有内侧分支，使用双极电凝镊电凝后，用剪刀切断。用弯头镊尽可能向头侧游离颈外静脉，并使用两根8/0丝线结扎，两结扎线之间保留适当间距。</li>
	<li>用直剪刀在先前放置的两根结扎线之间切断颈外静脉。</li>
	<li>将颈外静脉近端穿过聚乙烯套管（内径0.75 mm，外径0.94 mm），并用静脉微血管夹固定套管手柄。</li>
	<li>剪除血管残端的结扎线，将血管外翻覆盖于套管上，并用一圈8/0丝线环扎固定外翻的血管（图1A）。</li>
	<li>在近端和远端电凝右侧胸锁乳突肌的浅层部分，用剪刀切断并移除该部分肌肉。</li>
	<li>轻柔游离颈总动脉，于分叉下方钝性分离，并使用两根结扎线进行结扎，注意避免结扎颈动脉分叉处。在两结扎线之间剪断血管。</li>
	<li>参照步骤2.9，将颈总动脉近端穿过聚酰胺套管（内径0.57 mm，外径0.6 mm），并用动脉微血管夹固定。</li>
	<li>剪除血管残端的结扎线，使用血管扩张器轻柔扩张管腔。将血管外翻覆盖于动脉套管上，并用一根8/0丝线固定（图1A）。</li>
</ol>
3. 植入
<ol>
	<li>使用脾脏作为操作手柄，将移植物置入受体颈部区域，使移植物头部朝向外侧，尾部连同脾脏朝向内侧，血管残端朝向腹侧偏尾侧。用棉签辅助将移植物调整至合适位置。</li>
	<li>轻柔地将胰腺移植物的门静脉拉至受体动物已外翻的颈外静脉上，并固定于合适的套管（见步骤 2.10）。用一圈8/0丝线结扎固定。</li>
	<li>将移植物腹主动脉残端拉至受体动物外翻的颈总动脉上。用环形8/0丝线结扎固定（图1C）。</li>
	<li>在脾门附近辨认脾血管，用弯头镊子从下方分离血管，以8/0丝线结扎后切断脾血管以切除脾脏。最后剪短结扎线。</li>
	<li>使用持夹钳，先取下静脉套管上的夹子，再取下动脉夹。 
	注意：若移植成功，胰腺移植物将立即恢复灌注，呈现均匀的粉红色，并可见动脉搏动（图1D）。</li>
	<li>用常温生理盐水润湿移植物。</li>
	<li>用直头镊子取下静脉套管的手柄部分。</li>
	<li>用连续缝合方式以6/0缝线关闭手术切口。</li>
</ol>
4. 术后护理（终点）
<ol>
	<li>操作后，使用19 G针头皮下注射（s.c.）最多0.5 mL生理盐水，以补充术中液体丢失。</li>
	<li>将受体动物置于加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>清醒后，将受体动物送回饲养设施，在此可自由摄取食物和饮水（ad libitum）。</li>
	<li>为预防术后疼痛，手术结束后立即给予：(1) 丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重）每12小时一次，持续前5天；(2) 卡洛芬 4 mg/kg 体重，每12小时皮下注射一次，持续第一周。</li>
	<li>为评估营养摄入是否充足，每日监测每只受体动物的体重（g）。若体重较手术当天下降超过10–15%、出现精神萎靡、行动障碍、背部严重弯曲，或手术部位发生感染，即达到实验终点。
	<ol>
		<li>在此情况下，以及达到临床终点后，采用终末性异氟烷吸入法处死动物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

与缺血再灌注损伤（IRI）相关的移植物损害是实体器官移植中固有的问题，其特征是微循环功能紊乱。在缺血阶段多种代谢产物积聚，再灌注时主要由活性氧和活性氮介导的炎症级联反应被激活，从而导致移植物组织损伤4。这一级联反应可能不仅危及移植的短期效果，也影响长期预后，因而显著影响患者的生存率14。迄今为止，联合肾胰腺移植是治疗终末期肾病合并1型糖尿病患者的最佳疗法15。多项研究表明，成功的联合肾胰腺移植不仅能恢复并保护糖尿病受者中肾移植物的功能，还能稳定甚至逆转继发性并发症，包括神经病变以及微血管和大血管病变16,17,18。
尽管在动物研究中持续推行“减量、替代、优化”（3R原则），但诸如缺血-再灌注损伤（IRI）等复杂病理生理过程在体外（in vitro）条件下几乎无法重现。因此，动物模型仍被认为是转化研究的理想工具19,20。与大鼠或其他动物模型相比，本文所述的小鼠模型具有多项优势，包括可获得大量遗传背景明确的近交系小鼠（例如 转基因和基因敲除品系）、丰富的分子分析工具，以及操作简便且成本低廉21。该模型的一个主要优势在于采用无缝合套管技术。通过使用本文所述技术，可实现&#62;90%的成功率，显著优于以往报道的模型22。采用这种无缝合技术，我们显著减少了低血容量性休克、血栓形成以及吻合口狭窄等常见并发症12。该方法的另一优势在于移植物位于腹腔外，有利于受体术后快速恢复。此外，颈部移植位置非常适用于活体（in vivo）分析，例如在无张力条件下将移植物外置进行活体成像22。
该模型的主要缺点是胰管的阻塞，这与临床实际情况不符。在此模型中，外分泌引流通过结扎胆胰管来实现。长期来看，这会导致腺体出现明显纤维化和萎缩，但不会引发移植物胰腺炎22。由于我们早在移植后第30天就观察到了外分泌组织的这种退化，因此认为该模型不适合用于长期观察。相比之下，内分泌功能未受影响，使得受体的血糖监测成为评估移植物功能的一种简便的日常手段13,23,24。
这些特性使得该模型成为分析与长时间保存或不同保存溶液及技术相关的早期移植物损伤的理想选择。为了在此模型中获得最佳成功，必须考虑若干关键步骤。胰腺本身对操作极为敏感。因此，在器官获取和移植过程中使用棉签轻柔操作，可最大限度减少机械性损伤。应避免使用镊子直接夹取腺体，因为这不可避免地会导致严重的移植物损伤。出于同样原因，脾脏与胰腺一同获取，并作为操作手柄使用。这一做法在临床实践中也已确立。另一个需要注意的问题是冷灌注，通过主动脉残端使用4 °C的组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（histidine-tryptophan-ketoglutarate）灌注液进行灌注。通过轻柔灌注移植物，可避免腺体过度肿胀。剩余的灌注液应用于湿润移植物，以在器官获取期间保持其低温状态。
在受体准备方面，仔细分离颈外静脉和颈总动脉是成功进行血管重建的基础。尤其需要完全暴露静脉，不仅要切断所有属支，还需清除周围脂肪组织，以避免残留脂肪组织造成的外部压迫和狭窄。选择合适的套管直径至关重要。根据共同经验，对于体重在25至28克的小鼠，动脉套管内径宜为0.57毫米，静脉套管内径则宜在0.75至0.8毫米之间。必须精确、整齐地切割套管边缘，以防止撕裂血管残端。血管（尤其是动脉）的扩张最好使用尖端精细的血管扩张器来实现。一般经验是，血管应能扩张至套管管腔直径的两倍。在将血管外翻并固定于套管上的过程中，建议将血管夹置于皮瓣下方以固定其位置，从而便于完成这一关键步骤。
如前所述，无缝线套管技术是一种简便的血管吻合方法，可在5分钟内完成。然而，移植物在受体颈部区域的准确定位对于实现正确的再血管化至关重要。因此，必须预先考虑到移植物在颈部区域的最终理想位置，以确保静脉和动脉均能安全、平直且无张力地完成吻合。应避免使用过长的血管，因为这可能导致因扭曲而引起的流出道梗阻。出于同样原因，在静脉吻合侧完成再灌注后，也应移除套管手柄。对于胰腺移植物局部出血的情况，使用棉签对出血部位轻柔压迫5分钟可有效实现止血，这是处理此类并发症的唯一有效方法。即使电灼止血具有高度选择性，也几乎均会导致移植物因坏死性胰腺炎而丧失功能。
综上所述，我们建立了一种采用无缝合套管技术的小鼠胰腺移植方法，该技术在显微外科操作上可行，且成功率高。由于导管阻塞导致胰腺进行性纤维化，该模型最适合用于研究移植早期的移植物损伤。本论文旨在帮助研究人员在其实验室中安全地建立该模型。

胰肾联合移植（SPK）目前是治疗糖尿病合并终末期肾病患者的标准疗法。成功的移植可实现长期的胰岛素脱离，同时伴随糖尿病微血管病变的稳定甚至逆转，并显著提高患者的生活质量1。然而，与其他常见的实体器官移植（如肾移植和肝移植）相比，胰腺移植物更易受到缺血再灌注损伤（IRI）的影响。据报道，其发生率高达35%，不仅威胁移植物存活，甚至影响患者的生存率2,3。
氧化应激、微循环障碍、促炎性细胞因子和黏附分子表达增加，最终导致内皮细胞活化及其完整性丧失，这些均被认为是非同种异体移植物损伤的原因4。迄今为止，缺血-再灌注损伤（IRI）的确切分子机制在很大程度上仍不清楚，且可能因器官不同而有所差异。
尽管利用体外（in vitro）模型已取得重大进展，但动物模型的建立对于深入理解胰腺移植后与缺血-再灌注损伤（IRI）相关的移植物改变的分子机制至关重要。已有多种胰腺移植模型在啮齿类动物中建立5,6，但仅有1种在小鼠中报道7。这一高度复杂的显微外科手术的主要缺陷是术后存活率较低，仅为46%。然而，小鼠模型是移植相关研究的最佳模型，因为可对其应用最广泛的分子分析工具。基于在小鼠多种器官移植中积累的丰富显微外科经验8,9,10，我们开发出一种新的、高度可重复的小鼠异位颈部胰腺移植技术，采用无缝合套管法，成功率超过&#62;90%。该技术显著减少了吻合相关并发症的发生，并与缝合技术相比实现了更高的成功率11。迄今为止，仅有Liu et al12报道过一种成功率相近的小鼠模型，但目前尚未有使用该模型的研究发表。

<table><tbody><tr><td>外膜剪</td><td>S&amp;T</td><td>S-00102</td><td>直型</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>FST</td><td>&amp;nbsp;11271-30</td><td>弯曲尖端 0.17 × 0.1 mm</td></tr><tr><td>Yasargil 7 mm微型永久夹</td><td>Aesculap</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>S&amp;T</td><td>B1 00396 V</td><td></td></tr><tr><td>血管扩张器</td><td>S&amp;T</td><td>D-5a.2, 00125</td><td></td></tr><tr><td>血管夹施夹器</td><td>S &amp;T</td><td>CAF-4 00072</td><td>用于静脉套管</td></tr><tr><td>血管夹施夹器</td><td>Aesculap</td><td>FE572K&amp;nbsp;</td><td>用于动脉套管</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Portex Ltd</td><td></td><td>内径 0.75 mm，用于静脉套管</td></tr><tr><td>聚酰亚胺管</td><td>Vention Medical&amp;nbsp;</td><td>141-0051</td><td>内径 0.8 mm（可替代 Portex Ltd 的聚乙烯管）</td></tr><tr><td>聚酰亚胺管</td><td>Vention Medical</td><td>141-0033</td><td>内径 0.57 mm，用于动脉套管</td></tr><tr><td>双极电凝镊</td><td>Micromed</td><td>140-100-015</td><td></td></tr><tr><td>8/0 丝线结扎线</td><td>Catgut GmbH, Merkuramed</td><td>17209008</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK 溶液</td><td>Dr. Franz K&amp;ouml;hler Chemie</td><td>59997</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮 Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>32554</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 Graeub</td><td>aniMedica GmbH</td><td>50855</td><td></td></tr></tbody></table>

采用改良套管技术的小鼠胰腺移植模型

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

小鼠模型在移植研究中具有多种优势，包括易于操作、拥有大量遗传背景明确的品系，以及可获得最广泛的分子探针和试剂用于实验 体内 以及 体外 研究。基于我们在多种小鼠移植模型中的经验，我们建立了一种小鼠异位胰腺移植模型，旨在分析严重缺血再灌注损伤相关早期移植物损伤的潜在机制。与先前描述的缝合技术不同，本文介绍了一种采用无缝合套管技术的新手术方法。 
近年来，我们已在小鼠身上完成了超过300例胰腺移植手术，总体成功率超过&gt;90%，这一成功率在小鼠胰腺移植领域前所未有。这种无缝合套管技术用于移植物血管重建的核心步骤包括两个主要环节：（I）将受体血管拉过聚乙烯/聚酰胺套管，并用环形结扎线固定；（II）将供体血管套入外翻的受体血管之上，并用第二道环形结扎线固定。由此形成的内皮层连续性可显著减少血栓形成性病变，实现高通畅率，最终达到高手术成功率。
在此模型中，通过将供体移植物的腹主动脉拉至受体动物翻转的颈总动脉上，完成动脉吻合。移植物的静脉引流则通过将移植物的门静脉拉至受体翻转的颈外静脉上实现。本文详细描述了器官获取与器官移植手术的关键步骤，使具备显微外科技术的研究人员能够在其实验室中成功开展移植手术。

在过去的十年中，我们完成了超过300例小鼠胰腺移植手术。在建立该方案后，总体生存率达到了 &gt;90%。术后出血是失败的主要原因，其次是移植物血栓形成继发致死性坏死性移植物胰腺炎。在这两种情况下，动物均在24小时内达到实验终点并被实施安乐死。本组实验中未出现任何神经功能障碍、吞咽困难等症状及手术部位感染。
为了研究移植移植物的内分泌功能，从而验证该模型的可行性，在手术前4天，通过单次腹腔注射链脲佐菌素（312.5 mg/kg 体重）诱导受体小鼠出现高血糖。若小鼠血糖水平 >300 mg/dL，则被视为高血糖状态。图2A 显示了不同组小鼠的血糖水平。接受未经历16小时长时间冷缺血的移植物的小鼠在移植后24小时内恢复至正常血糖水平，并在整个观察期间维持这一代谢状态。相比之下，未接受移植的小鼠则持续处于高血糖状态。由于我们关注的是缺血再灌注损伤相关移植物损害对内分泌功能的影响，因此增设了第三组，该组移植物经历了16小时的长时间冷缺血时间（CIT）和45分钟的热缺血时间（WIT）。接受此类移植物的小鼠未能恢复至正常血糖水平，并在48小时后因发生严重胰腺炎而被实施安乐死，该模型已证实此种情况具有致死性13。
该模型适用于多种旨在研究缺血再灌注损伤相关早期移植物损害的项目。进一步的研究包括移植后2小时进行的共聚焦活体荧光显微镜检查，以量化微循环紊乱。通过向阴茎静脉注射0.3 mL浓度为0.4%的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（分子量150 000），增强移植物微血管的对比度。 图2B 显示了未经长时间冷缺血时间（CIT）暴露的 naive 小鼠胰腺及移植胰腺移植物的正常毛细血管模式图2C。相比之下， 图 2D 显示了将胰腺移植物暴露于 prolonged CIT 后微循环的破坏情况。
<img alt="组织样本中的手术吻合方法；A-D 展示了不同的缝合技术及其特写。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1术中图片。 (A术中显示用于吻合的受体血管。外部颈静脉（1）已外翻并套在静脉用聚乙烯套管上，并用环形8/0丝线结扎固定。类似地，颈总动脉（2）已外翻并固定在较小的动脉用聚酰胺套管上。标尺长度为1 mm。 (B) 胰腺移植物 原位以外门静脉（1）和用于血管吻合的腹主动脉残端（2）。脾脏（3）与胰腺一并获取，用作操作把手；在移植物再灌注前将切除脾脏。比例尺：1 cm。 (C) 术中吻合口观察。门静脉（1）被拉过外翻的颈外静脉袖口（2），并用8/0丝线环扎固定。同样，腹主动脉的主动脉残端（3）被拉过外翻的颈总动脉袖口（4）。标尺：1 mm。 （D） 再灌注5分钟后灌注良好的胰腺移植物术中图像：静脉和动脉夹移除后，成功移植的胰腺移植物呈现均匀的粉红色。脾脏在再灌注前已被切除（1：结扎的脾血管）。比例尺1 cm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="血糖水平图表及显微镜图像，显示组织在100 μm尺度下的结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54998/54998fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2胰腺移植物的内分泌功能与共聚焦显微镜分析 体内 荧光显微镜技术 图 2A 显示了一条线图，展示了未接受冷缺血处理（CIT）的移植小鼠（n = 10，PTX w/o CIT，蓝色线）、未移植小鼠（n = 11，no PTX，红色线）以及接受经历 prolonged CIT 处理移植物的小鼠（PTX + 16 h CIT，n = 10，绿色线）的血糖水平。所有受体小鼠均通过腹腔注射 312.5 mg/kg b.w. 链脲佐菌素（streptozotocin）诱导为高血糖状态。所有接受无 CIT 移植物的小鼠在整个观察期（50 天）内均存活，并维持完整的内分泌功能；而未移植小鼠在整个观察期间持续处于高血糖状态。接受暴露于 16 h CIT 移植物的小鼠未能恢复血糖正常，且因体重下降超过 10–15%，在移植手术后 48 小时被实施安乐死。存活至整个观察期结束的小鼠在第 50 天完成最后一次血糖测量后被安乐死。移植移植物中的微循环在移植后 2 小时通过共聚焦活体荧光显微镜进行评估。 naïve 胰腺作为对照。 图2B 显示在未处理的胰腺中存在规律的毛细血管模式。在未经历 prolonged CIT 的移植移植物中，同样可见规律的毛细血管网。图 2C）。相比之下，在经历长时间冷缺血时间（CIT）的移植移植物中，可观察到微循环的破坏图 2D比例尺 100 µm图中数据以±标准差表示。PTX：胰腺移植；CIT：冷缺血时间；w/o：无 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54998/54998fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

在腹部实体器官移植中，胰腺移植物容易发生严重的缺血再灌注损伤相关性移植物损害，最终导致早期移植物丢失。本方案描述了一种采用无缝线套环技术的小鼠胰腺移植模型，非常适合用于分析这些早期有害性损伤。

小鼠模型在移植研究中具有多种优势，包括易于操作、拥有大量遗传背景明确的品系，以及……

我的名字是Benno Cardini，来自因斯布鲁克医科大学内脏、移植和胸外科的Daniel Swarovski研究实验室。今天，我们将向您展示一种采用改良套管技术的小鼠胰腺移植模型。通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪对供体动物进行麻醉，并剃除腹部区域的毛发。然后将受体动物置于手术区域，保持仰卧位，用氯己定对手术区域消毒三次。接着，从耻骨区域至剑突处行正中腹切口，并向两侧肋缘下扩大切口，以获得更好的手术视野。随后将内脏向左侧外翻暴露，向肾下腔静脉注射肝素。下一步，在左肾静脉交叉处近端识别腹主动脉，游离该动脉并在该位置进行结扎。随后，转移至肝脏门部，识别并解剖靠近肝脏的胆总管，并在靠近胰腺处将其结扎。最后，在结扎线近端横断胆总管。接下来，在靠近肝脏的位置解剖门静脉，以获得足够的长度用于静脉吻合。提示：在门静脉上保留一小块肝组织，以便后续更容易识别。然后，在主动脉周围组织中游离左侧肾静脉并结扎。然后横断肾静脉及主动脉周围组织，保持在结扎线右侧。接着从腹腔干至膈肌水平钝性分离腹主动脉，在靠近膈肌处游离腹主动脉并在此处将其横断。随后识别并凝固所有腰动脉分支，并将其横断。现在在先前结扎线下方横断主动脉。通过主动脉切口用冰冻灌注液灌注胰腺，直至观察到门静脉流出灌注液。上方可见灌注后的门静脉，下方为灌注后的主动脉。现在将内脏复位至腹腔，并使用8-0丝线逐步结扎，将胰腺与肠道分离。从幽门后区域开始，在十二指肠下方穿两次线，将8-0丝线穿过十二指肠下方，然后结扎，并锐性分离胰腺与十二指肠。此操作需反复进行，直至到达屈氏韧带。操作过程中必须避免损伤十二指肠，否则可能因污染而导致移植物无法用于实验。当胰腺完全与十二指肠分离后，继续处理肠系膜，将其游离、结扎并切断。参照之前的步骤，通过分离胰腺与横结肠之间的连接，进行结扎并最终横断。现在采用相同的方法，在结扎后通过锐性解剖分离胰腺与胆道区域。随后，采用钝性解剖法将胰腺从胃部分离。识别胃左动脉，结扎并横断。最后，将附着脾脏的胰腺完整切除，并置于冰冻的再灌注液中，直至后续移植。操作中以脾脏作为牵拉手柄。参照供体操作，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉受体动物，并剃除颈部区域的毛发。随后将供体动物置于手术区域，呈仰卧位，用氯己定对颈部区域消毒三次。接着，从颈静脉切口至右侧下颌角进行皮肤切口。 接着，辨认右颈外静脉的所有侧支，游离并分离这些侧支，在双极电凝后予以切断。随后，钳夹右下颌下腺下极，向头侧提起，在对其供血血管进行双极电凝后，分离下颌下腺。此时，在双极电凝后切断右颈外静脉的所有内侧支。尽可能靠头侧双重结扎颈外静脉，并在结扎线之间将其切断。将颈外静脉的近端穿过聚乙烯套管。此处需注意，套管的手柄应朝向手术操作者。下一步，从外侧放置微血管静脉夹。随后用肝素湿润静脉，移除结扎线，轻柔地将静脉拉过聚乙烯套管。最后，用8-0丝线在套管外对静脉进行环形结扎，结扎时在后方打一个结，前方打三个结，以固定静脉。为暴露右侧颈总动脉，先在近端和远端凝固后，游离并横断右侧胸锁乳突肌。随后轻柔地游离颈总动脉，注意避免损伤邻近结构，如迷走神经。与静脉处理类似，尽可能向头侧方向对颈总动脉进行双重结扎，并于两结扎线之间将其切断。现在将血管穿过动脉套管。最后，从内侧用微血管夹固定动脉套管。接下来，移除结扎线，并使用血管扩张器扩大动脉管腔。在管腔充分扩张后，将动脉拉过动脉套环。最后，参照静脉的处理方法，用8-0丝线结扎固定动脉。此处可见已完成修复的静脉和动脉，准备进行动静脉吻合。进行移植时，将移植物置于颈部湿润的纱布上。然后，将门静脉穿过一根8-0丝线环圈，剪短静脉以实现无张力吻合，接着将门静脉拉过静脉套管。最后，用一圈8-0丝线固定静脉。类似于静脉的操作，将主动脉残端穿过结扎环并缩短主动脉。然后，将主动脉拉过动脉套管，最后用一圈8-0丝线结扎固定。在再灌注前，辨认脾脏血管并予以结扎，随后锐性分离并切除脾脏。再灌注时，先移除静脉夹，随后移除动脉夹。移植物充分再灌注的表现包括动脉可见搏动以及整个移植物呈现粉红色。用常温生理盐水溶液润湿移植物。在关闭切口前，移除静脉套管的手柄，以避免血管扭曲。最后，使用6-0连续缝合线缝合切口，并皮下注射0.5毫升常温生理盐水。为验证模型有效性，我们检测了移植胰腺的内分泌功能。小鼠在手术前四天通过链脲佐菌素预处理诱导为高血糖状态，若血糖水平高于300毫克/分升则被视为高血糖。该曲线图显示了未移植的活体对照小鼠的血糖水平（红色），以及未经历长时间冷缺血的胰腺移植受体小鼠的血糖水平（蓝色）。此外，还显示了经历16小时冷缺血时间的胰腺移植物受体小鼠的血糖水平（绿色）。活体小鼠在整个观察期间均保持低血糖状态。相比之下，未经历 prolonged cold ischemia time 的胰腺移植物移植后，受体小鼠在24小时内恢复血糖正常，证实了移植物的内分泌功能。而经历16小时冷缺血时间的移植物移植后，并未使受体恢复正常的血糖水平。更重要的是，该组所有小鼠均因缺血-再灌注损伤导致的早期移植物损伤，需在48小时内实施安乐死。本视频介绍了一种采用无缝线套管技术的小鼠胰腺移植方法。该技术在显微外科操作上可行，且成功率极高。然而，由于胰腺进行性纤维化及导管阻塞，我们认为该模型最适合用于研究早期缺血再灌注损伤相关的移植物损伤。

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