低密度原代海马神经元培养

该方案最初由Gary Bunker博士及其同事发表，他们通过将胚胎海马神经元悬浮于胶质细胞过滤层上方，实现了神经元的长密度和高纯度培养。这一结果对于我们其他海马体关键实验结果具有重要意义，因为它能够使神经元在低密度条件下生长，同时胶质细胞污染极少。因此，该培养体系非常适合对培养中的成熟神经元进行高分辨率成像以及形态学和功能分析。

本方案的体外成熟步骤应能加快新生命个体的适应过程，因为该操作流程中存在多个关键阶段难以描述，而本方案可引导您逐步完成。本方案包含三个独立的细胞群体，这些群体对于培养高质量的原代神经元至关重要。这些过程包括胶质细胞培养、盖玻片的制备与包被，以及海马神经元的分离与制备。

首先，应按照书面实验方案获取新生期大鼠的皮层组织。尽管此处未直接展示，但请注意，本方案中后续所示的解剖步骤与皮层解剖所用步骤几乎完全相同。因此，在本视频后续展示的海马解剖过程中，将重点突出相关操作步骤。

从书面方案的第六步开始，移除收集到的皮层组织中的HBSS，然后用剪刀将组织尽可能剪碎。加入足量的HBSS至切碎的组织中，以转移组织块至一个50毫升的锥形管中，再通过添加HBSS将总体积调至12毫升。分别加入1.5毫升2.5%胰蛋白酶和10毫克/毫升DNA溶液，颠倒混匀，然后将所得混合物在37°C水浴中孵育12分钟。

使用玻璃巴斯德吸管将组织吹打10至15次，然后在水浴中再孵育3分钟。确保任何组织碎片均已沉降到管底，随后将上清液过滤至含有5毫升BGS的50毫升锥形管中。向含有未消化组织碎片的管中加入13.5毫升HBSS和1.5毫升2.5&trypsin，颠倒混匀，然后在水浴中继续孵育10分钟。

孵育后，将残留的组织吹打10至15次，然后过滤至含有初始滤液的离心管中。接着，用额外的3毫升BGS通过滤膜冲洗滤器。此时，可将滤液分装至多个离心管中，以简化后续离心平衡及细胞沉淀的重悬。

将悬浮液在130 G条件下离心6分钟。离心后，注意观察到沉淀底部因含有血液成分而略显微红色。移除上清液，然后向每根试管中加入1毫升胶质细胞培养基，注意不要扰动沉淀。将各沉淀中无此微红色外观的部分转移至新的50毫升锥形管中。

每只幼鼠加入最多2毫升胶质细胞培养基以重悬合并的组织，将每2毫升细胞悬液转移至含有18毫升预温胶质细胞培养基的75平方厘米培养瓶中。将培养瓶置于37摄氏度、5%CO2培养箱中孵育。细胞接种后次日，更换每瓶中的培养基为新鲜胶质细胞培养基。

请注意，此时的培养物中将含有星形胶质细胞及其他非靶细胞类型的混合物。为了去除非星形胶质细胞类型的细胞，须在接种后约四天对培养瓶进行剧烈振荡。具体操作为：先用 HBSS 清洗培养瓶，然后向每个培养瓶中加入 10 毫升新鲜 HBSS，并用力振荡 5 至 10 次。

吸除HBSS，再用HBSS冲洗两次。随后加入20毫升胶质细胞培养基，将培养瓶放回孵箱中继续培养。需注意，尽管此过程较为剧烈，但所需培养的星形胶质细胞仍会牢固贴附于培养瓶表面。

为了维持星形胶质细胞培养，每周更换两次新鲜的胶质细胞培养基，直至细胞达到融合状态。一旦细胞融合，可根据书面实验方案所述将其冻存以备将来使用。根据书面实验方案所述，胶质细胞必须在神经元培养开始前至少14天接种至培养皿中。

将盖玻片浸入浓硝酸中，并在室温下超声处理30分钟。注意，浓硝酸具有极强腐蚀性，操作时需小心。另需注意，部分实验室倾向于使用陶瓷染色架，将盖玻片在浓硝酸中浸泡过夜。

根据机构指南，在化学通风橱中小心弃去硝酸，然后用去离子水冲洗盖玻片三次。将盖玻片浸入水中，再次超声处理30分钟。接着移除水，并再用去离子水冲洗盖玻片三次。

将盖玻片浸入50毫升水中，然后进行高压灭菌。在无菌超净工作台中去除水，加入20至30毫升乙醇进行冲洗。再加入20至30毫升乙醇，随后将盖玻片和乙醇转移至100毫米的培养皿中。

使用钝头镊子将盖玻片转移至60毫升的培养皿中，每皿放置四到五片，然后将盖玻片斜靠在培养皿边缘，使其自然风干。待乙醇完全挥发后，将盖玻片恢复至水平位置。将10克石蜡放入耐热玻璃瓶中熔化，并保持温度在约150至200摄氏度。

理想的温度可能需要稍作调整，温度不正确会导致难以制备出合适尺寸的石蜡足。将巴斯德移液管浸入石蜡中，然后迅速接触每张盖玻片边缘附近的三个位置。石蜡液滴将凝固成珠状，高度约为3至5毫米，直径为1至2毫米，用于在盖玻片上的神经元与下方的胶质单层之间形成间隔。

取含有预先制备的带石蜡足的盖玻片的培养皿。向每张盖玻片表面加入200 µL的多聚-L-赖氨酸和硼酸盐缓冲液，室温下覆盖孵育过夜。涂层表面应与石蜡微珠所在表面一致。

若清洗得当，聚-L-赖氨酸应能顺利铺展，覆盖盖玻片表面。次日早晨，用无菌水浸泡盖玻片清洗两次，每次两小时。最后一次清洗后，将水更换为每皿4毫升的铺板培养基。

请注意，使用多聚赖氨酸包被后，盖玻片表面不得干燥。将盖玻片置于37摄氏度的培养箱中。包被后的盖玻片应在神经元培养开始前至少孵育24小时。

获取一只妊娠第18或19天的大鼠，并采用批准的方法实施安乐死。用70%乙醇喷洒大鼠腹侧，然后从耻骨区域沿中线切开，直至腹腔末端。为避免污染，此步骤中需注意仅切开皮肤。

使用 70% 乙醇对解剖器械进行灭菌，然后切开腹壁以暴露子宫。取出两个子宫角，并将其置于无菌培养皿中。在无菌超净台中，去除围绕胚胎的子宫膜，随后将胚胎断头，把头部分离并置于含有 20 毫升 HBSS 的 100 毫米培养皿中。

取出脑组织，立即放入含有2毫升HBSS、置于冰上的60毫米培养皿中。每个培养皿中仅放置两到三个脑组织，以确保后续步骤有足够的操作空间。在解剖显微镜下，从大脑半球的中线处剥离脑膜。

接下来，分离出海马体。注意，海马体可被识别为大脑半球内侧面上的新月形结构，因其外侧毗邻脑室，易于剥离。分离后，将海马体置于一个含有4.5毫升HBSS的60毫米培养皿中，并置于冰上保存。

请注意，截至目前所进行的步骤同样适用于大脑皮层的分离，区别仅在于保留的是大脑皮层而非海马体。对于皮层分离，下一步是将皮层从脑的其余部分分离，如图所示，然后像之前所示那样收集皮层组织和HBSS。待所有海马体组织均收集至HBSS后，将其转移至15毫升的圆锥形离心管中。

加入5毫升2.5%胰蛋白酶，然后在37°C下孵育10分钟。用巴斯德吸管轻轻吸除胰蛋白酶溶液，使海马组织静置在管底不受扰动。通过轻轻加入5毫升HBSS洗涤组织两次，每次在37°C下孵育5分钟，然后再次用巴斯德吸管小心吸除溶液，注意不要扰动管底的组织。

在等待前述孵育步骤的同时，准备两种不同类型的火焰抛光移液管用于组织解离。操作时，将玻璃巴斯德移液管的尖端短暂暴露于火焰中，随后检查移液管尖端。对于第一种类型，重复此步骤，直至移液管尖端边缘变得光滑，但其直径保持不变。

进行第二次操作时，重复操作直至边缘变得光滑，且尖端直径缩小约一半。需要反复练习以确定理想的直径，确保组织被充分解离成单个细胞，同时避免在此过程中损伤细胞。第二次洗涤后，加入适量的HBSS至组织总体积达到5毫升。

首先用平口普通移液器将海马组织吹打约10次，再用减小尖端直径的移液器进一步吹打5到10次。此步骤的目标是获得均匀的单细胞悬液，无或仅有极少量组织团块。使用血细胞计数板测定细胞密度。

典型的得率约为每只幼鼠80万到100万个细胞。根据实验需求，取足够体积的细胞悬液加入含4毫升铺板培养基的培养皿中，其中盖玻片经多聚-L-赖氨酸包被，使铺板密度达到每个60毫米培养皿10万至50万个细胞。将培养皿置于37°C、5% CO2培养箱中培养。

三到四小时后，将带有贴附神经元的盖玻片转移至含有胶质细胞和NBG培养基的培养皿中。操作时应确保神经元接种的一面朝下，面向胶质细胞层。每皿胶质细胞中加入四至五张盖玻片。

铺板后两到三天，加入气单胞菌素溶液，使每皿终浓度为5 μM，以抑制胶质细胞生长。每周换液一次，每次用2.5 mL新鲜培养基替换2 mL旧培养基。多加入的培养基用于补偿随时间发生的蒸发损失。

并且仅更换部分培养基，以确保胶质细胞对培养基的持续稳定作用。这些培养物通常可保持健康状态至少一个月。神经元用4%多聚甲醛固定后，再与一抗孵育，用于荧光成像。

如Tau和MAP2免疫染色所示，这些神经元发育出广泛的树突分支，具有结构良好的轴突和树突。成熟的神经元还会发育出突触棘，可通过Drebrin One的特异性定位加以识别，这些突触棘与通过突触蛋白一抗免疫染色所识别的突触前特化结构紧密相对。这些原代神经元非常适合用于神经元和突触的功能与结构研究，包括信号转导、神经元极性、细胞内物质运输以及突触发育与可塑性等方面的研究。

本视频有助于理解并准确执行该方案中的多个关键步骤。严格遵循所述方法，应可获得健康、高密度的神经元培养，具有广泛的分支结构以及形态和功能上充分发育的突触。