Name: 低密度原海马神经元文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
Description: 学习低密度原代海马神经元培养技术，通过将神经元悬浮于胶质细胞单层上方实现高纯度培养。该方法适用于高分辨率成像和成熟神经元的功能性检测，为神经科学研究提供可靠工具。

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本工作由CIHR MOP-142209基金资助，项目负责人为TJS。

所有使用实验动物的实验和方案均经曼尼托巴大学动物伦理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的指南要求。
1. 仪器、缓冲液和溶液的准备
<ol>
	<li>将所有解剖器械、玻璃巴斯德吸管、移液器吸头、过滤装置及去离子水通过高压灭菌法进行灭菌。</li>
	<li>用去离子水配制20%（w/v；1.1 M）葡萄糖储备液，并通过过滤法灭菌。4 °C保存。</li>
	<li>用去离子水配制100 mM丙酮酸钠溶液，并通过过滤法灭菌。4 °C保存。</li>
	<li>通过将10% HBSS（10倍浓缩液）、10 mM HEPES和100 U/mL青霉素-链霉素溶于去离子水中，配制无钙、无镁的Hank's平衡盐溶液（CMF-HBSS）。4 °C保存，保存时间不超过1至2个月。</li>
	<li>用CMF-HBSS配制10 mg/mL脱氧核糖核酸酶I（DNase），然后过滤灭菌，并于-20 °C保存。</li>
	<li>在最低必需培养基（MEM）中加入30 mM葡萄糖（来自无菌溶液）、95 U/mL青霉素-链霉素和10–15%牛生长血清（BGS），配制胶质细胞培养基。 
	注：如需减缓细胞增殖，可根据方案使用含5% BGS的溶液。可使用马血清替代BGS，但由于不同批次间存在差异，每批使用前均需测试。配制好的溶液于4 °C保存，保存时间不超过1至2个月。尽管许多实验室使用胎牛血清（FBS），但我们持续观察到BGS中的胶质细胞生长效果与FBS相当。BGS来源于胎牛血清，并添加了化学成分明确的组分。此外，BGS的成本显著低于FBS。</li>
	<li>在500 mL Neurobasal培养基中加入1× B27添加剂和0.5 mM L-谷氨酰胺，配制神经元生长与维持培养基（neurobasal-B27，NBG）。4 °C保存，保存时间不超过1至2个月。L-谷氨酰胺可用GlutaMAX替代，后者在培养基中更稳定。</li>
	<li>在MEM中加入30 mM葡萄糖（来自无菌溶液）、1 mM丙酮酸钠（来自无菌溶液）和10% BGS，配制神经元铺板培养基。4 °C保存，保存时间不超过1至2个月。</li>
	<li>配制1 mM阿糖胞苷（Ara-C）溶液，并通过过滤法灭菌。分装为1 mL每份，-20 °C保存。</li>
	<li>将100 mM APV溶于100 mN经滤膜灭菌的NaOH中，配制成溶液。-20 °C保存。</li>
	<li>将1 mg/mL多聚-L-赖氨酸溶于pH 8.5的硼酸盐缓冲液（50 mM硼酸和12 mM硼砂）中，并通过过滤法灭菌。分装后于-20 °C保存。可使用多聚-L-鸟氨酸替代多聚-L-赖氨酸，后者可能对细胞毒性较低。</li>
</ol>
2. 胶质细胞培养制备
<ol>
	<li>准备皮层星形胶质细胞培养
	<ol>
		<li>获取出生24小时内的大鼠幼崽。将幼崽置于冰上以进行麻醉。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒幼崽并将其断头。</li>
		<li>将头部放入含有15 mL无钙镁Hank's平衡盐溶液（CMF-HBSS）的100 mm培养皿中，置于冰上。</li>
		<li>通过剪开头皮、打开颅骨、切断脑干，分离出每只幼崽的大脑，并将其转移至含有3 mL CMF-HBSS的60 mm培养皿中，置于冰上。</li>
		<li>分离大脑半球与海马体，并剥离其周围的脑膜。需采取充分预防措施，以确保脑膜成纤维细胞的污染最小化。培养物中的脑膜成纤维细胞会与胶质细胞竞争生长，并可能损害神经元健康。将所有大脑半球收集至含有5 mL CMF-HBSS的60 mm培养皿中，置于冰上。</li>
		<li>移除CMF-HBSS，然后使用微型弹簧剪刀将收集的皮层组织尽可能切碎。</li>
		<li>向切碎的组织中加入足量CMF-HBSS。使用玻璃巴斯德移液管将组织碎片转移至15 mL离心管中，并通过添加CMF-HBSS使总体积达到12 mL。</li>
		<li>向管中加入各1.5 mL的2.5%胰蛋白酶和10 mg/mL DNase溶液。将混合物在37 °C水浴中孵育12分钟。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管吹打组织10–15次，然后继续在37 °C水浴中孵育3分钟。</li>
		<li>将上清液通过透镜纸或滤网过滤至含有5 mL BGS的50 mL离心管中，以去除未充分解离的组织块。也可使用市售的细胞滤网。</li>
		<li>向含有剩余组织碎片的离心管中加入13.5 mL CMF-HBSS和1.5 mL 2.5%胰蛋白酶，再于37 °C水浴中继续孵育10分钟。</li>
		<li>再次吹打剩余组织，然后将悬液再次过滤至含有初始滤液的50 mL离心管中。接着用3 mL BGS冲洗透镜纸。最终体积应约为38 mL。</li>
		<li>将含有解离胶质细胞的悬液在130 × g条件下离心6分钟。使用玻璃巴斯德移液管小心弃去上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。沉淀底部略呈红色，含有血液成分。</li>
		<li>将胶质细胞用1 mL胶质细胞培养基转移至新的离心管中，注意避免扰动沉淀的红色部分。</li>
		<li>每只幼崽最多加入2 mL胶质细胞培养基，以重悬所有解离的胶质细胞。例如，若使用了10只幼崽，则总重悬体积为20 mL。</li>
		<li>为每只幼崽准备一个75 cm2的细胞培养瓶。向每个培养瓶中加入18 mL预热的胶质细胞培养基。</li>
		<li>向每个培养瓶中加入2 mL细胞悬液，并在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
		<li>一天后，更换为20 mL胶质细胞培养基。此时，培养物中包含胶质细胞及其他非目标细胞类型。</li>
		<li>接种细胞四天后，剧烈震荡培养瓶以去除非星形胶质细胞。具体操作：先用CMF-HBSS冲洗培养瓶一次，然后向每个瓶中加入10 mL新鲜CMF-HBSS。剧烈震荡5–10次，随后吸除CMF-HBSS。用CMF-HBSS冲洗两次，再加入20 mL胶质细胞培养基。 
		注意：此步骤对去除非目标细胞类型至关重要，且不应导致目标星形胶质细胞的丢失。</li>
		<li>每周更换两次新鲜胶质细胞培养基，直至细胞达到汇合状态（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶质细胞冻存
	<ol>
		<li>当培养物达到汇合状态后，吸除培养基，并用10 mL CMF-HBSS洗涤细胞单层。</li>
		<li>向每个培养瓶中加入10 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，并在37 °C孵育3分钟。</li>
		<li>轻轻敲击培养瓶使细胞脱落。向每个瓶中加入1 mL BGS，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在130 × g条件下离心6分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用2 mL胶质细胞培养基重悬细胞沉淀。</li>
		<li>配制胶质细胞冻存液（1份二甲基亚砜与4份BGS）。每瓶培养物准备4个冻存管，每个管中加入0.5 mL该溶液。</li>
		<li>向每个冻存管中加入0.5 mL细胞悬液，然后将冻存管置于隔热容器中，在-80 °C冰箱中过夜缓慢冷冻。一天后，将冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复苏胶质细胞并接种
	<ol>
		<li>在神经元培养前1–2周接种胶质细胞。</li>
		<li>准备一个50 mL离心管，加入10 mL预热的胶质细胞培养基。</li>
		<li>将一管冷冻胶质细胞在37 °C水浴中解冻2–3分钟。</li>
		<li>将冻存管内容物转移至含有10 mL胶质细胞培养基的50 mL离心管中。</li>
		<li>在130 × g条件下离心5分钟，吸除上清液。</li>
		<li>用20 mL胶质细胞培养基重悬细胞沉淀。</li>
		<li>向每个培养皿（60 mm）中加入3 mL新鲜胶质细胞培养基，然后向每个培养皿中加入1 mL细胞悬液。将培养物置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
		<li>每周喂养细胞两次。若在神经元培养日前细胞密度已提前达到50%汇合度，可更换为含5% BGS的胶质细胞培养基，以减缓胶质细胞生长速度。进行神经元培养时，胶质细胞单层的理想汇合度为50%–70%。</li>
		<li>在神经元培养前1–2天，将胶质细胞培养基更换为NBG培养基（每皿6 mL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 盖玻片准备
<ol>
	<li>石蜡微珠的清洗与制备
	<ol>
		<li>将盖玻片浸入浓硝酸（70% 质量分数；注意：强腐蚀性）中，并在室温下超声处理 30 分钟。其他实验室发现，将盖玻片置于陶瓷架中，于 70% 硝酸中在室温下孵育 12–24 小时效果更佳。</li>
		<li>根据机构规定，在指定的化学通风橱中小心弃去硝酸。用去离子水冲洗盖玻片 3–5 次。</li>
		<li>将盖玻片浸入去离子水中，再次超声处理 30 分钟（若采用替代方法，则跳过此步骤）。</li>
		<li>移除去离子水，并再用去离子水冲洗盖玻片三次。</li>
		<li>将盖玻片置于 50 mL 去离子水中，通过高压灭菌进行灭菌。或者，可在烘箱中于 225 °C 灭菌 6 小时。若采用此替代方法，请直接跳至步骤 3.1.9。</li>
		<li>高压灭菌后，将盖玻片转移至无菌超净工作台以进行后续操作。</li>
		<li>移除去离子水，并用 20–30 mL 100% 乙醇冲洗。</li>
		<li>加入 20–30 mL 100% 乙醇，将盖玻片和乙醇一同转移至 100 mm 培养皿中。</li>
		<li>使用钝头镊子将盖玻片转移至 60 mm 培养皿中，每皿放置 4–5 片，将盖玻片倾斜靠在皿边缘使其自然晾干。待乙醇完全挥发后，将盖玻片平放于皿底。</li>
		<li>将 10 g 石蜡转移至合适的耐热玻璃瓶中。在加热板上加热至 150–200 °C 并维持至少 1 小时以熔化石蜡。石蜡加热的理想温度可能需要适当调整。温度不适宜可能导致难以制备出正确尺寸的石蜡微珠。熔化后的等待时间有助于确保液体内部温度均匀一致。</li>
		<li>将巴斯德吸管浸入石蜡中，然后迅速在每片盖玻片边缘附近三个位置（各点相距约 120°）轻触一下。液滴将凝固成高约 0.3–0.5 mm、直径约 1.0–2.0 mm 的微珠，用于在盖玻片上的神经元与下方胶质单层之间形成间隙（图 2）。</li>
		<li>在紫外光下对培养皿灭菌 30 分钟，然后用铝箔覆盖，于室温下保存。制备好的盖玻片可保存并使用长达一个月。石蜡微珠应在使用前至少牢固附着于盖玻片上一周，以防止在后续实验步骤中脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用聚-L-赖氨酸包被盖玻片
	<ol>
		<li>取含有先前制备好石蜡微珠的盖玻片的培养皿。</li>
		<li>向每片盖玻片表面加入 200 µL 硼酸盐缓冲液配制的聚-L-赖氨酸溶液，盖好后于室温下静置过夜。包被面应与石蜡微珠所在面相同。注意：若盖玻片清洗得当，聚-L-赖氨酸应能均匀铺展覆盖整个表面。</li>
		<li>一天后，每次用无菌去离子水浸泡 2 小时，共洗涤两次。最后一次洗涤后，每皿更换为 4 mL 神经元铺板培养基。注意：聚-L-赖氨酸包被后，盖玻片表面必须始终保持湿润，不得干燥。</li>
		<li>将含有盖玻片的培养皿放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中。包被后的盖玻片应在神经元培养前至少孵育 24 小时，以使培养基充分预适应神经元培养条件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 海马体解剖与神经元接种
<ol>
	<li>获取一只妊娠大鼠（以发现阴道栓当日为起点计算，胚胎第18-19天），采用异氟烷麻醉后断头法或其他经批准的方法实施安乐死。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒大鼠腹部，并从耻骨区域向腹腔末端做切口。为避免污染，此步骤中仅切割皮肤组织。</li>
	<li>再次用70%乙醇冲洗解剖器械，然后切开腹壁以暴露子宫。取出两个子宫角并置于无菌的100 mm培养皿中。</li>
	<li>在超净工作台内进行后续操作。去除包裹胎儿的子宫膜，断头后将胎鼠头部放入含有20 mL无钙镁Hank's平衡盐溶液（CMF-HBSS）的100 mm培养皿中。</li>
	<li>分离脑组织并立即置于含有2 mL冰上预冷的CMF-HBSS的60 mm培养皿中。每皿仅收集2-3个脑组织，以便为下一步操作留出足够空间。</li>
	<li>在解剖显微镜下，从大脑半球中线处剥离脑膜，随后分离海马体并将其置于含有4.5 mL CMF-HBSS的60 mm培养皿中。注意：海马体在大脑皮层半球内侧面呈新月形结构，因其外侧毗邻脑室，易于识别和分离。</li>
	<li>将收集的海马组织与CMF-HBSS转移至15 mL离心管中，加入0.5 mL 2.5%胰蛋白酶，于37 °C孵育10分钟。可使用木瓜蛋白酶替代胰蛋白酶，因其作用更温和，可能提高细胞得率。</li>
	<li>用巴斯德吸管轻轻吸除胰蛋白酶溶液，注意保持海马组织沉于管底不动。</li>
	<li>在37 °C条件下，用5 mL CMF-HBSS轻柔洗涤组织两次，每次5分钟。第二次洗涤后，通过添加适量CMF-HBSS使总体积至少达到5 mL。若组织来自超过10只幼鼠的海马体，可加入最多8 mL CMF-HBSS。</li>
	<li>准备两种火焰抛光的玻璃吸管用于组织解离。其中一种吸管尖端保持原有直径，但经火焰抛光使边缘光滑；另一种吸管尖端直径缩小约一半。将玻璃巴斯德吸管尖端斜向接触火焰源短暂加热，随后检查吸管尖端。
	<ol>
		<li>重复此操作直至吸管边缘光滑或直径减小。需反复练习以确定理想直径，确保组织充分解离为单细胞且不损伤细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>先用边缘光滑的常规玻璃巴斯德吸管对海马组织进行约10次吹打，再用尖端直径缩小的吸管继续吹打5至10次。目标是获得均匀的细胞悬液，无或仅有极少组织团块。</li>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度。通常，合并两个大脑半球的海马体后，每只幼鼠可获得0.8至1.0×10⁶个细胞。</li>
	<li>取适量细胞悬液接种于含聚-L-赖氨酸包被盖玻片的培养皿中，加入4 mL铺板培养基，使接种密度为每60 mm培养皿300,000个细胞。根据实验需求，细胞密度可在100,000至500,000个之间调整。</li>
	<li>3-4小时后，将附着神经元的盖玻片转移至含有胶质细胞的培养皿中，使用NBG培养基。操作时应确保神经元接种面朝下，贴近胶质细胞层。每胶质细胞培养皿加入4-5个盖玻片。</li>
	<li>铺板后2至3天，加入阿糖胞苷（Ara-C）溶液，使终浓度为每皿5 µM，以抑制胶质细胞增殖。</li>
	<li>每周换液一次，每次用2.5 mL新鲜培养基替换2 mL旧培养基。额外添加的培养基用于补偿长期培养中的蒸发损失，仅部分更换培养基可维持胶质细胞对培养环境的稳定调节作用。此类培养物通常可保持健康状态至少一个月（图3）。可通过在培养基中添加APV至终浓度100 µM以提高神经元存活率。APV为NMDA受体拮抗剂，可通过减轻谷氨酸兴奋性毒性促进神经元存活。</li>
</ol>

<ol><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-425 (1977).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+after+ChR2+in+neurons--views+from+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community.</a> Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).</li>
<li>Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cell biology of synaptic plasticity.</a> Science. 334, 623-628 (2011).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80, 704-717 (2013).</li>
<li>Luscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+AMPA+receptor+cycling+in+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity.</a> Neuron. 24, 649-658 (1999).</li>
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<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li>
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<li>Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. 2, 339-370 (1998).</li>
<li>Hanisch, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+a+source+and+target+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as a source and target of cytokines.</a> Glia. 40, 140-155 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管神经元培养的&#34;三明治&#34;法已在其他文献中有详细描述2,11，但该实验方案中多个步骤仅用文字难以充分表述，可能导致希望采用该方法的研究人员感到困扰。
该方法可分为三个主要工作流程：胶质细胞培养、盖玻片制备以及神经元培养与维持。这三项准备对于获得高质量的神经元培养均至关重要，且需注意若干关键因素。在接种神经元之前，理想的胶质饲养层应为均一的星形胶质细胞群体，并达到50–70%的融合度，以确保胶质饲养层提供充足的营养支持。必须注意使星形胶质细胞培养物中其他细胞类型的污染降至最低，尤其是小胶质细胞，因其为松散贴壁且呈圆形的细胞。小胶质细胞会释放对神经元健康和存活有害的细胞因子12。血清（无论是马血清还是牛生长血清）在不同批次间可能存在差异，因此在确定使用某一特定批次前，应仔细筛选多个批次的血清。
盖玻片的制备是另一个重要步骤。玻璃的质量及其清洗所采用的方...

大脑由复杂的神经元网络构成。通过选择性改变神经元的分子组成及其生理特性，可以研究单个神经元对网络活动和脑功能的贡献。与结构完整的脑组织相比，在培养的神经元中进行基因和化学操控相对更为简便，因为后者不受细胞异质性和组织复杂性的限制。培养的神经元能够发育出结构清晰的轴突和树突分支，并彼此之间形成广泛的突触连接。
尽管可以培养成年动物或神经系统其他区域的神经元，但胚胎海马神经元培养更常被选用，因其具有明确的锥体细胞群体且胶质细胞密度相对较低1,2。在低密度条件下培养的海马神经元特别适用于研究亚细胞定位、蛋白质转运、神经元极性以及突触发育。培养神经元也被广泛用于突触可塑性相关分子机制的研究3,4,5,6。对于某些出生后无法存活的、具有全身体质性基因敲除的小鼠，其神经元培养体系在研究特定基因在细胞和突触水平的功能方面尤为有用7。
与大脑中类似，培养的海马神经元依赖胶质细胞提供的营养支持。这使得其培养过程更为复杂，并促使人们发展出多种提供此类支持的方法。一种常用的方法是将神经元直接接种到单层胶质细胞上8，或允许从获取的海马组织中带入的污染性胶质细胞增殖，从而在神经元下方形成单层胶质细胞层9。尽管该方法已取得一定成功，但由此产生的神经元培养物纯度较低，不利于成像实验。另一种常用的神经元培养方法是完全省去胶质细胞饲养层，转而通过成分明确的生长培养基提供营养支持10。
本文介绍了神经元培养的&#34;夹心&#34;法或&#34;Banker&#34;法2,11。该方法包括将海马神经元接种在玻璃盖玻片上，随后将盖玻片悬置于由石蜡蜡珠分隔的胶质细胞单层之上。这种方法可在避免胶质细胞污染的同时，实现神经元群体的长期培养，并借助底层胶质细胞单层提供营养支持。当神经元达到足够的培养时间或成熟度时，可将承载神经元的盖玻片从胶质细胞培养皿中取出并翻转，用于成像或功能检测。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;解剖器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖弹簧剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖弹簧剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子（#5）</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子（#PP）</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（2.5%）</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 滤器支架，25&amp;nbsp;mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>用作细胞滤筛。需先装配滤膜并进行高压灭菌</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grade 105 镜头清洁纸</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>用作细胞滤筛。需先在滤器支架中装配并进行高压灭菌</td></tr><tr><td>带棉塞的玻璃巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁和酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS，10x）</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I（Dnase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>丁烷本生灯</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>Model 65</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 mm）</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 mm）</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>可替代BGS使用，但由于批间差异，每批均需测试。建议对血清进行热灭活处理。</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>可在NBG培养基中替代L-谷氨酰胺使用</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm）</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶（75 cm^2）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷（Ara-C）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>牛生长血清（BGS）</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>使用前建议进行热灭活处理。</td></tr><tr><td>B27 补充剂（50x）</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>DL-2-氨基-5-膦酰戊酸（APV）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;盖玻片制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>十水合四硼酸钠（硼砂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast 石蜡</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>重力对流烘箱</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>用于方案中讨论的替代盖玻片清洗方法</td></tr><tr><td>超声波清洗机（超声仪）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Anachemia</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷染色架</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>用于方案中讨论的替代盖玻片清洗方法</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&amp;nbsp;GmbH</td><td>1001/18</td><td>制造商至关重要，因为神经元在低质量玻璃上贴附效果不佳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>与BD注射器配合用于过滤除菌</td></tr><tr><td>注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>与VWR无菌注射器滤器配合用于过滤除菌</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形无菌离心管</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形无菌离心管</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

低密度原代海马神经元培养

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

在培养条件下研究单个神经细胞的结构和生理特性对于神经生物学研究至关重要，同时允许对单个细胞或特定神经网络进行灵活的遗传和化学操控。与完整的脑组织相比，这种简化的培养体系更易于进行操作。尽管目前已存在多种分离和培养原代神经元的方法，但每种方法均有其局限性。本实验方案描述了一种在玻璃盖玻片上培养低密度、高纯度的啮齿类动物胚胎海马神经元的方法，随后将这些盖玻片倒置悬于一层胶质细胞单层之上。这种“三明治培养”方式可在获得底层胶质细胞提供营养支持的同时，实现神经元群体的长期特异性生长。当神经元达到适当的年龄或成熟度后，可将神经元所在的盖玻片从胶质细胞培养皿中取出，用于成像或功能检测。采用该方法培养的神经元通常可存活数周，并发育出复杂的树突分支、突触连接以及具备网络活动特性。

在此原代神经细胞培养的“三明治”法中，海马神经元（图3) 在胶质细胞层上生长（图1) 由石蜡珠分隔图2）。这可确保神经元选择性地在玻璃盖玻片上生长，胶质细胞污染极少，同时从生长在组织培养皿上的胶质细胞获得充足的营养支持。通常，神经元可在培养条件下维持 &gt;3周后，细胞发育出广泛的分支结构，通过去磷酸化Tau蛋白和MAP2的免疫染色可分别清晰识别出发育良好的轴突和树突（图4成熟的神经元会发育出突触棘，可通过突触后标志物Drebrin1在这些区室中的特异性定位加以识别。这些突触棘与突触前特化结构紧密相邻，后者可通过突触小泡标志物Synapsin1的免疫染色进行鉴定。突触前与突触后位点的邻近关系表明，突触结构发育良好且定位准确。这些原代神经元非常适合用于神经元和突触的功能与结构研究，包括但不限于信号转导、神经元极性、亚细胞运输以及突触发育与可塑性等方面的研究。
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本文介绍了在胶质细胞单层上倒置培养于玻璃盖玻片的低密度原代海马神经元的培养方案。神经元层与胶质细胞层之间由石蜡蜡珠分隔。通过该方法培养的神经元适用于高分辨率光学成像和功能检测。

在培养条件下研究单个神经细胞的结构与生理特性对于神经生物学研究至关重要，并提供了灵活性……

该方案最初由Gary Bunker博士及其同事发表，他们通过将胚胎海马神经元悬浮于胶质细胞过滤层上方，实现了神经元的长密度和高纯度培养。这一结果对于我们其他海马体关键实验结果具有重要意义，因为它能够使神经元在低密度条件下生长，同时胶质细胞污染极少。因此，该培养体系非常适合对培养中的成熟神经元进行高分辨率成像以及形态学和功能分析。本方案的体外成熟步骤应能加快新生命个体的适应过程，因为该操作流程中存在多个关键阶段难以描述，而本方案可引导您逐步完成。本方案包含三个独立的细胞群体，这些群体对于培养高质量的原代神经元至关重要。这些过程包括胶质细胞培养、盖玻片的制备与包被，以及海马神经元的分离与制备。首先，应按照书面实验方案获取新生期大鼠的皮层组织。尽管此处未直接展示，但请注意，本方案中后续所示的解剖步骤与皮层解剖所用步骤几乎完全相同。因此，在本视频后续展示的海马解剖过程中，将重点突出相关操作步骤。从书面方案的第六步开始，移除收集到的皮层组织中的HBSS，然后用剪刀将组织尽可能剪碎。加入足量的HBSS至切碎的组织中，以转移组织块至一个50毫升的锥形管中，再通过添加HBSS将总体积调至12毫升。分别加入1.5毫升2.5%胰蛋白酶和10毫克/毫升DNA溶液，颠倒混匀，然后将所得混合物在37°C水浴中孵育12分钟。使用玻璃巴斯德吸管将组织吹打10至15次，然后在水浴中再孵育3分钟。确保任何组织碎片均已沉降到管底，随后将上清液过滤至含有5毫升BGS的50毫升锥形管中。向含有未消化组织碎片的管中加入13.5毫升HBSS和1.5毫升2.5&trypsin，颠倒混匀，然后在水浴中继续孵育10分钟。孵育后，将残留的组织吹打10至15次，然后过滤至含有初始滤液的离心管中。接着，用额外的3毫升BGS通过滤膜冲洗滤器。此时，可将滤液分装至多个离心管中，以简化后续离心平衡及细胞沉淀的重悬。将悬浮液在130 G条件下离心6分钟。离心后，注意观察到沉淀底部因含有血液成分而略显微红色。移除上清液，然后向每根试管中加入1毫升胶质细胞培养基，注意不要扰动沉淀。将各沉淀中无此微红色外观的部分转移至新的50毫升锥形管中。每只幼鼠加入最多2毫升胶质细胞培养基以重悬合并的组织，将每2毫升细胞悬液转移至含有18毫升预温胶质细胞培养基的75平方厘米培养瓶中。将培养瓶置于37摄氏度、5%CO2培养箱中孵育。细胞接种后次日，更换每瓶中的培养基为新鲜胶质细胞培养基。请注意，此时的培养物中将含有星形胶质细胞及其他非靶细胞类型的混合物。为了去除非星形胶质细胞类型的细胞，须在接种后约四天对培养瓶进行剧烈振荡。具体操作为：先用 HBSS 清洗培养瓶，然后向每个培养瓶中加入 10 毫升新鲜 HBSS，并用力振荡 5 至 10 次。吸除HBSS，再用HBSS冲洗两次。随后加入20毫升胶质细胞培养基，将培养瓶放回孵箱中继续培养。需注意，尽管此过程较为剧烈，但所需培养的星形胶质细胞仍会牢固贴附于培养瓶表面。为了维持星形胶质细胞培养，每周更换两次新鲜的胶质细胞培养基，直至细胞达到融合状态。一旦细胞融合，可根据书面实验方案所述将其冻存以备将来使用。根据书面实验方案所述，胶质细胞必须在神经元培养开始前至少14天接种至培养皿中。将盖玻片浸入浓硝酸中，并在室温下超声处理30分钟。注意，浓硝酸具有极强腐蚀性，操作时需小心。另需注意，部分实验室倾向于使用陶瓷染色架，将盖玻片在浓硝酸中浸泡过夜。根据机构指南，在化学通风橱中小心弃去硝酸，然后用去离子水冲洗盖玻片三次。将盖玻片浸入水中，再次超声处理30分钟。接着移除水，并再用去离子水冲洗盖玻片三次。将盖玻片浸入50毫升水中，然后进行高压灭菌。在无菌超净工作台中去除水，加入20至30毫升乙醇进行冲洗。再加入20至30毫升乙醇，随后将盖玻片和乙醇转移至100毫米的培养皿中。使用钝头镊子将盖玻片转移至60毫升的培养皿中，每皿放置四到五片，然后将盖玻片斜靠在培养皿边缘，使其自然风干。待乙醇完全挥发后，将盖玻片恢复至水平位置。将10克石蜡放入耐热玻璃瓶中熔化，并保持温度在约150至200摄氏度。理想的温度可能需要稍作调整，温度不正确会导致难以制备出合适尺寸的石蜡足。将巴斯德移液管浸入石蜡中，然后迅速接触每张盖玻片边缘附近的三个位置。石蜡液滴将凝固成珠状，高度约为3至5毫米，直径为1至2毫米，用于在盖玻片上的神经元与下方的胶质单层之间形成间隔。取含有预先制备的带石蜡足的盖玻片的培养皿。向每张盖玻片表面加入200 µL的多聚-L-赖氨酸和硼酸盐缓冲液，室温下覆盖孵育过夜。涂层表面应与石蜡微珠所在表面一致。若清洗得当，聚-L-赖氨酸应能顺利铺展，覆盖盖玻片表面。次日早晨，用无菌水浸泡盖玻片清洗两次，每次两小时。最后一次清洗后，将水更换为每皿4毫升的铺板培养基。请注意，使用多聚赖氨酸包被后，盖玻片表面不得干燥。将盖玻片置于37摄氏度的培养箱中。包被后的盖玻片应在神经元培养开始前至少孵育24小时。获取一只妊娠第18或19天的大鼠，并采用批准的方法实施安乐死。用70%乙醇喷洒大鼠腹侧，然后从耻骨区域沿中线切开，直至腹腔末端。为避免污染，此步骤中需注意仅切开皮肤。使用 70% 乙醇对解剖器械进行灭菌，然后切开腹壁以暴露子宫。取出两个子宫角，并将其置于无菌培养皿中。在无菌超净台中，去除围绕胚胎的子宫膜，随后将胚胎断头，把头部分离并置于含有 20 毫升 HBSS 的 100 毫米培养皿中。取出脑组织，立即放入含有2毫升HBSS、置于冰上的60毫米培养皿中。每个培养皿中仅放置两到三个脑组织，以确保后续步骤有足够的操作空间。在解剖显微镜下，从大脑半球的中线处剥离脑膜。接下来，分离出海马体。注意，海马体可被识别为大脑半球内侧面上的新月形结构，因其外侧毗邻脑室，易于剥离。分离后，将海马体置于一个含有4.5毫升HBSS的60毫米培养皿中，并置于冰上保存。请注意，截至目前所进行的步骤同样适用于大脑皮层的分离，区别仅在于保留的是大脑皮层而非海马体。对于皮层分离，下一步是将皮层从脑的其余部分分离，如图所示，然后像之前所示那样收集皮层组织和HBSS。待所有海马体组织均收集至HBSS后，将其转移至15毫升的圆锥形离心管中。加入5毫升2.5%胰蛋白酶，然后在37°C下孵育10分钟。用巴斯德吸管轻轻吸除胰蛋白酶溶液，使海马组织静置在管底不受扰动。通过轻轻加入5毫升HBSS洗涤组织两次，每次在37°C下孵育5分钟，然后再次用巴斯德吸管小心吸除溶液，注意不要扰动管底的组织。在等待前述孵育步骤的同时，准备两种不同类型的火焰抛光移液管用于组织解离。操作时，将玻璃巴斯德移液管的尖端短暂暴露于火焰中，随后检查移液管尖端。对于第一种类型，重复此步骤，直至移液管尖端边缘变得光滑，但其直径保持不变。进行第二次操作时，重复操作直至边缘变得光滑，且尖端直径缩小约一半。需要反复练习以确定理想的直径，确保组织被充分解离成单个细胞，同时避免在此过程中损伤细胞。第二次洗涤后，加入适量的HBSS至组织总体积达到5毫升。首先用平口普通移液器将海马组织吹打约10次，再用减小尖端直径的移液器进一步吹打5到10次。此步骤的目标是获得均匀的单细胞悬液，无或仅有极少量组织团块。使用血细胞计数板测定细胞密度。典型的得率约为每只幼鼠80万到100万个细胞。根据实验需求，取足够体积的细胞悬液加入含4毫升铺板培养基的培养皿中，其中盖玻片经多聚-L-赖氨酸包被，使铺板密度达到每个60毫米培养皿10万至50万个细胞。将培养皿置于37°C、5% CO2培养箱中培养。三到四小时后，将带有贴附神经元的盖玻片转移至含有胶质细胞和NBG培养基的培养皿中。操作时应确保神经元接种的一面朝下，面向胶质细胞层。每皿胶质细胞中加入四至五张盖玻片。铺板后两到三天，加入气单胞菌素溶液，使每皿终浓度为5 μM，以抑制胶质细胞生长。每周换液一次，每次用2.5 mL新鲜培养基替换2 mL旧培养基。多加入的培养基用于补偿随时间发生的蒸发损失。并且仅更换部分培养基，以确保胶质细胞对培养基的持续稳定作用。这些培养物通常可保持健康状态至少一个月。神经元用4%多聚甲醛固定后，再与一抗孵育，用于荧光成像。如Tau和MAP2免疫染色所示，这些神经元发育出广泛的树突分支，具有结构良好的轴突和树突。成熟的神经元还会发育出突触棘，可通过Drebrin One的特异性定位加以识别，这些突触棘与通过突触蛋白一抗免疫染色所识别的突触前特化结构紧密相对。这些原代神经元非常适合用于神经元和突触的功能与结构研究，包括信号转导、神经元极性、细胞内物质运输以及突触发育与可塑性等方面的研究。本视频有助于理解并准确执行该方案中的多个关键步骤。严格遵循所述方法，应可获得健康、高密度的神经元培养，具有广泛的分支结构以及形态和功能上充分发育的突触。

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神经科学

低密度原海马神经元文化

从特定脑区分离并培养细胞有助于研究细胞和生理参数。我们描述了一种原代细胞培养方法，可在无血清环境中获得富含神经元的培养物。...

新生大鼠（P0）海马神经元的原代培养

本方案概述了分离、通过电穿孔转染以及培养小鼠海马和皮层神经元所需的步骤。短期培养可用于轴突生长和导向研究，而长期培养则适用于突触形成和树突棘分析的研究。...

胚胎小鼠海马和皮层神经元的核转染与原代培养

我们提供一种无需使用饲养层胶质细胞的从小鼠胚胎脑中培养高纯度海马神经元的方案。...

从小鼠胚胎中分离与培养海马神经元

该视频展示了一种从小鼠海马体中培养神经元的方法。首先，对海马体进行酶消化以降解细胞外基质。随后，通过机械方法将消化后的组织分散，以分离单个神经元。最后，将这些神经元接种在胶质饲养细胞上进行培养。...

一种培养小鼠海马神经元的技术

本视频展示了冻存胚胎神经元的培养方法，包括控制性解冻、用神经基础培养基稀释，并接种至多聚-L-赖氨酸包被的培养板上。随后的孵育过程有助于神经元连接的生长与维持。...

从冻存的胚胎神经元制备低密度原代神经元培养物

本视频展示了在高密度神经元饲养层存在下培养超低密度神经元的方法。该方法建立了不同密度神经元的共培养体系，确保神经元之间紧密的物理接近。高密度神经元分泌的生长因子有助于神经元的存活和生长，从而延长超低密度神经元的维持时间。...

利用高密度神经元饲养层制备超低密度神经元培养物

原代分离的胚胎海马神经元培养物可用于研究神经元死亡过程中涉及的信号传导机制。在分离和解离海马组织之前对胚胎进行性别鉴定，可制备出分别来自雄性和雌性的培养物，从而使研究人员能够识别并研究性别特异性的细胞信号通路。...

用于研究缺血性细胞死亡通路的性别分层神经元培养

我们描述了对新生小鼠进行标记和基因分型以及从中建立原代神经元培养物的实验步骤。该基因分型方法快速、高效且可靠，可实现核酸的自动化提取。这对于新生期致死的小鼠及其培养物尤其重要，因为这些实验要求在培养前完成基因分型。...

动物快速基因分型及脑神经元原代培养的建立

原代海马神经元的低密度培养通常需要胶质细胞饲养层来提供神经营养因子并维持其长期存活。本文介绍一种简化的方法，可在存在高密度神经元饲养层的情况下，在玻璃盖玻片上培养超低密度神经元，从而有利于研究特定的神经元自主机制。...

一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法

本方案展示了如何利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质的共定位。...

超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

即用型冷冻神经元储备是评估突触功能的有力工具。本文介绍一种利用96孔板，从冷冻储备中建立简易低密度原代培养的方法。...

利用冻存胚胎海马神经元进行简便且可重复的低密度原代培养

学习低密度原代海马神经元培养技术，通过将神经元悬浮于胶质细胞单层上方实现高纯度培养。该方法适用于高分辨率成像和成熟神经元的功能性检测，为神经科学研究提供可靠工具。

低密度原代海马神经元培养

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