用于鉴定内在无序蛋白多重磷酸化的核磁共振波谱法

本方法的总体目标是利用核磁共振波谱技术，以 Tau 蛋白为案例，鉴定固有无序蛋白上的多位点磷酸化修饰。该方法有助于解答与疾病相关的分子调控中的关键问题，例如磷酸化修饰对蛋白与其分子伴侣相互作用的影响。该技术的主要优势在于，我们能够识别无序蛋白中特定位点的磷酸化，并将其与结构和功能变化相关联。

该方法可深入了解蛋白质功能，还可应用于其他蛋白质，例如 aPtc 病毒 DNA 蛋白的无序残基。该技术的应用可拓展至治疗领域，用于开发蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂。本方法将由本课题组的博士生 Clement Danis、Clement Despres、Luiza Bessa 和 Hamida Merzougui 演示。

首先，在一个1.5毫升的塑料离心管中，将50微升感受态BL21细胞与100纳克质粒DNA轻柔混匀，使每微克质粒DNA可形成1000万至1500万个菌落。将细胞混合物置于冰上30分钟后，于42摄氏度进行42秒的热激处理。随后将离心管重新放回冰上冷却5分钟，再加入1毫升室温的LB（Luria Bertani）培养基。

将细菌悬液在37摄氏度下轻轻振荡孵育30分钟。使用涂布棒将100微升细胞悬液均匀涂布于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。将筛选平板在37摄氏度下孵育15小时。

接下来，将300毫克氮-15和碳-13标记的培养基、1克氮-15氯化铵以及2克碳-13标记的葡萄糖溶于10毫升M9培养基中。使用0.2微米滤器将同位素溶液过滤灭菌至M9培养基中。用巴斯德吸管从筛选平板上挑取一单菌落，悬浮于20毫升LB培养基中，LB培养基中添加100微克/毫升氨苄青霉素。

将接种后的培养基在37摄氏度下孵育约六小时。使用塑料分光光度计比色皿，通过细菌培养物十倍稀释液一毫升测定600纳米波长处的光密度（OD600）。随后，将20毫升饱和的LB培养物加入含有氨苄青霉素的一升M9生长培养基中，置于二升带导流板的锥形玻璃培养瓶内。

将培养瓶放入程序控温培养箱中，设置温度为10摄氏度，转速为50 RPM。编程设定培养箱在第二天清晨自动切换至200 RPM和37摄氏度。取1毫升细菌培养液，使用塑料比色皿在分光光度计中测定OD600。

当 OD600 达到约 1.0 时，加入 400 微升 1 摩尔的 IPTG 储存液，以诱导重组 tau 蛋白的表达。将细菌细胞在 37 摄氏度下继续培养 3 小时后，于 5,000 × g 离心 20 分钟收集菌体。将细菌细胞沉淀解冻，并在 45 毫升阳离子交换缓冲液 A 中充分重悬，该缓冲液需新鲜添加 1× 蛋白酶抑制剂混合物和 DNase I 1。

使用高压均质机在20,000 PSI条件下裂解细菌细胞，需进行三到四次循环以充分裂解细胞。将裂解后的细胞在20,000 ×g条件下离心40分钟，以去除不溶性物质。将细菌细胞提取物置于水浴中，75摄氏度加热15分钟。

几分钟后将观察到白色沉淀。然后，将加热后的提取物在15,000 ×g 条件下离心20分钟，保留含有热稳定型tau蛋白的上清液。接下来，使用快速蛋白液相色谱系统，以强阳离子交换树脂装填的5毫升柱床进行阳离子交换层析。

将流速设定为2.5毫升每分钟，并用CEX A缓冲液平衡层析柱。接下来，使用样品泵上样60至70毫升加热后的tau蛋白提取物，收集穿流液用于分析，以确认tau蛋白是否高效结合到树脂上。用CEX A缓冲液洗涤树脂，直至280纳米处的吸光度恢复至基线水平。

使用FPLC系统，以10个柱体积的梯度将CEX B缓冲液比例升至25%，达到250毫摩尔氯化钠；随后用5个柱体积的梯度将CEX B缓冲液比例升至50%，达到500毫摩尔氯化钠；最后在2个柱体积内将梯度升至100% CEX B缓冲液，达到1摩尔氯化钠。

在洗脱步骤中收集1.5毫升的组分。随后，对含有tau蛋白的合并组分进行缓冲液置换。使用FPLC系统，以15毫摩尔/升碳酸氢铵缓冲液平衡装有53毫升G25树脂床的脱盐柱。

将流速设置为每分钟5毫升，通过5毫升进样环将tau样品注入色谱柱。收集280纳米处吸收峰对应的组分。在将样品分装至各管之前，合并所有含tau的组分。

选择这些离心管时，应使溶液的体积远小于离心管的总体积。接下来，在将tau样品于-80摄氏度冷冻以备后续冻干前，使用针头在管盖上打孔。将4毫克冻干的氮15和碳13标记的erk磷酸化tau溶于400微升NMR缓冲液中。

加入5%的氘代氧化物以实现核磁共振波谱仪的磁场锁定，并加入1毫摩尔的TMSP作为核磁共振信号的内标。同时，加入10微升浓度为40 EK的完全蛋白酶抑制剂混合物储备液。使用带长针头的电子移液器或巴斯德吸管将样品转移至5毫升核磁共振管中。

使用推杆封闭核磁共振管。通过移动推杆，除去推杆与液体之间夹带的任何气泡。将核磁共振管放入旋转器中。

使用合适的量规调整旋转器中的垂直位置，使大部分样品溶液位于核磁共振（NMR）线圈内部。接下来，在磁体控制系统窗口中点击“lift”以启动NMR仪器的气流。小心地将装有样品管的旋转器置于磁体孔道顶部的气流中。

然后停止气流，使样品管在磁体内的探头中下降到位。待样品在25摄氏度下平衡后，在命令行中输入ATMM，以对探头进行半自动调谐和匹配，从而优化功率传输。然后点击“磁体控制系统”窗口中的锁定按钮，启动光谱仪的磁场频率锁定功能。

通过在命令行中输入 TopShim GUI 打开匀场窗口，启动匀场程序，以优化样品位置处磁场的均匀性。然后在匀场窗口中点击“开始”。检查残余 B0 标准偏差，以确认匀场参数是否达到最佳状态。

接下来，校准 P1 参数，即质子射频脉冲的持续时间，单位为微秒。该参数用于实现质子自旋磁化强度的 90 度旋转。通过水分子中质子的一维谱图，以获得 360 度脉冲为目标进行校准。

通过将O1参数设置为一维谱中质子水的频率，来调整频率偏移。最后，在命令行中输入ZG以开始采集一维质子谱。重组tau蛋白纯化的代表性结果显示出在洗脱梯度过程中于280纳米处出现的主要吸收峰。

该峰对应于色谱图上方凝胶电泳中观察到的纯化 tau 蛋白。重组纯化 tau 蛋白的脱盐色谱图显示，在 280 纳米处的吸收峰与电导率峰之间分离良好，表明蛋白脱盐效果理想，适用于后续冻干步骤。900 兆赫兹下重组氮-15标记 tau 蛋白的一维核磁共振谱证实，可检测到来自该蛋白样品的核磁共振信号。

良好的信噪比表明基本采集参数设置正确。磷酸化蛋白的二维谱图具有良好的分辨率，共振峰尖锐且分离清晰。谱图中用红框标出区域内的共振峰对应于磷酸化残基。

观看本视频后，您应能够制备带有易于识别标签的重组蛋白，纯化该蛋白，并设置核磁共振谱图数据采集的基本参数。一旦掌握，若安排得当，该实验方案可在两周内完成。请注意，核磁共振波谱技术使用非常强的磁体，切勿携带金属物品靠近。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，这些蛋白质对蛋白酶降解较为敏感，因此必须采取多种预防措施以避免样品降解。完成该操作后，可进一步采用固态核磁共振（solid state NMR）等其他方法，研究无序蛋白常形成的类淀粉样聚集物。该技术建立后，为化学生物学领域的研究人员探索具有治疗潜力的活性化合物提供了体外模型系统的研究途径。