激光显微切割RNA测序实验设计:从玉米叶片发展的经验分析

该方法的总体目标是量化特定细胞或细胞结构域中的转录本积累，以便可以在不同结构域之间或突变型和野生型样品中的等效结构域之间进行比较。这种方法可以帮助回答发育生物学中的关键问题，例如器官结构域是如何指定的或特定突变如何影响基因表达。该技术的主要优点是转录本积累可以以微小、精确定义的结构域进行量化，这些结构域太小而无法手动解剖。

在开始此程序之前，在标准条件下将玉米幼苗培养成平地至两周龄。要解剖侧面切片的芽尖，首先在土壤线下方切除幼苗。然后用剃须刀片从茎的基部去除薄片，直到看到一个被一两片成熟叶子包围的椭圆形平静。

底座上方约 10 毫米处再做一次切割。这个 10 毫米的节段包含幼叶原基中的芽顶端分生组织。转动 10 毫米的段，使底座朝上。

平行于外侧轴进行两次切割，以获得 2 到 3 毫米厚的组织载玻片。丢弃外部两部分，保留中心切片用于固定和包埋。将组织切片浸入大约 10 毫升的农民固定物中，固定在冰上的玻璃瓶中。

解剖所有样品后，应用真空去除气泡并帮助固定剂渗透。保持真空 10 分钟，然后慢慢释放真空。更换固定剂，并在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育过夜。

第二天，继续按照文本方案中的说明处理组织以进行包埋。要铸造石蜡块，请将包埋模具放在组织包埋站的热板上，并使用镊子将组织样品转移到包埋模具上，切割表面朝下。将嵌入环放在模具顶部。

在每个模具中加入熔化的石蜡。将模具转移到冷板上，直到石蜡凝固。将石蜡块储存在装有硅胶的密封容器中，温度为 4 摄氏度。

按照标准程序从切片机上的石蜡块上切下切片，并选择包括芽顶分生组织的中间切片进行封片。要将切片安装在载玻片上，请将不含 RNase 或烘烤的载玻片放在 42 摄氏度的载玻片加热器上。滴几滴 50% 乙醇溶液以覆盖每张载玻片。

轻轻地将切片放在载玻片上，然后将切片漂浮在乙醇溶液上，直到它们膨胀。接下来，倾斜载玻片，用一次性移液管吸液除去多余的乙醇溶液。使用无绒湿巾吸走任何其他乙醇溶液。

在 42 摄氏度下干燥载玻片数小时或过夜。玻片干燥后，将它们存放在装有 4 摄氏度硅胶的密封容器中。在显微解剖当天对载玻片进行脱蜡。

准备三个玻璃 Coplin 罐，两个罐子含有约 50 毫升 100% 二甲苯，一个罐子含有约 50 毫升 100% 乙醇。将玻片浸入 1 个二甲苯中 2 分钟，将 2 个二甲苯浸入 2 分钟，将 100% 乙醇浸入 1 分钟。用无绒湿巾排干载玻片，并在室温下风干。

要开始此过程，请将载玻片固定在激光显微解剖显微镜的载物台上。激光显微切割在 RNasic 实验中成功的一个关键因素是使用形态学和分子标记物来选择用于显微切割的精确结构域。使用 5X 物镜检查载玻片，并使用芽顶分生组织顶点作为中心参考点确定每张载玻片上最中间的五个部分。

接下来，使用 10X 或 20X 物镜确定每个切片的 plastochron 七叶原基上叶状体上叶状体的位置。叶状体将可见为从叶原基的近轴表面突出的凸起。使用激光显微切割软件的绘图工具标记此位置。

选择手绘图标，将光标移动到适当的位置，然后单击并拖动鼠标进行绘制。下一步是使用尺子和矩形绘图工具测量 100 微米高的矩形，这些矩形以每个截面的唇片为中心，作为唇片样本。要使用标尺工具，请选择标尺图标，将光标移动到要测量的区域的一端，然后单击并拖动以测量该区域。

标尺的长度将显示在屏幕上。使用标尺工具测量以利微微为中心的 100 微米线段。要绘制矩形，请选择直线绘制工具并绘制四条直线。

以相同的方式，测量位于小叶矩形上方和下方 50 微米处的 100 微米矩形。这些将是刀片和护套样本。使用激光切割功能沿所选结构域的轮廓切开组织切片，并使用弹射器功能将组织的矩形从载玻片上推入管盖，对测量的矩形进行显微解剖。

在单独的试管中收集 ligule、blade 和 sheath 样品。使用相同的程序从 plastochron 七叶原基中显微解剖叶片、唇和鞘近轴表皮样品。最后，将 RNA 提取缓冲液涂在显微解剖的组织上，并按照手稿中的描述进行 RNA 提取、RNA 扩增、文库构建、测序和生物信息学分析。

当分析转录本积累并发现叶片、叶状体和鞘区的所有细胞层时，发现了 2， 359 个差异表达基因。在近轴表皮叶片、唇鞘和鞘区，发现了 3， 128 个差异表达基因。激光显微切割、 RLM 、 RNA 测序和原位杂交分析给出了一致的结果，如这些代表性基因所示。

左侧的漫画说明了所有细胞层的 LM，右侧的漫画仅说明了近轴表皮的 LM。图像中的箭头表示新出现的叶状体。在所有细胞层和表皮 LM 的叶状体中，荞叶一的积累量显着增加.窄鞘一在所有细胞层 LM 和近轴表皮 LM 的叶状区域显著上调，并在新出现的叶状尖端特异性积累。

功能未知的基因在唇状表皮 LM 中的平均计数高于所有层 LM.该转录本在表皮细胞中的积累最强烈。第四个基因 Zm PIN1a 在所有细胞层的分析中没有显著差异表达，但在仅表皮分析中在小叶中显著上调。当收集所有细胞层时，它在维管组织中的高表达可能混淆了表皮中转录本积累的差异。

在尝试此程序时，重要的是要记住，选择要显微解剖和比较的细胞结构域的选择以及显微解剖的准确性对于实验的成功至关重要。