Name: 测试癌细胞的斑马鱼的血管侵袭能力（斑马鱼） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习利用斑马鱼胚胎模型评估癌细胞的血管侵袭能力，通过荧光显微镜实时观察肿瘤细胞外渗行为。该方法为癌症转移研究提供了快速高效的体内实验平台。

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感谢乔治城大学显微成像中心的 Peter Johnson 在斑马鱼胚胎成像方面提供的帮助。显微成像共享资源平台和斑马鱼共享资源平台部分由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助项目 P30-CA051008 支持。本研究还得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所项目 CA71508（AW）和 CA177466（AW）的资助。

伦理声明：斑马鱼胚胎的制备遵循经批准的IACUC方案。这些实验严格按照乔治城大学动物护理与使用委员会的建议进行。
1. 准备用于注射的胚胎并配制储备溶液
<ol>
	<li>准备所需的斑马鱼幼鱼以评估癌细胞的血管侵袭。
	<ol>
		<li>使用Tg(kdrl:grcfp)zn1;mitfab692;ednrb1b140斑马鱼进行成对或群体交配。 
		注：我们通过将Tg(kdrl:grcfp)zn125（其在内皮细胞中表达绿色珊瑚荧光蛋白）与缺乏色素细胞的品系mitfab692;ednrb1b140（由斑马鱼国际资源中心开发）杂交，获得了Tg(kdrl:grcfp)zn1;mitfab692;ednrb1b140斑马鱼。</li>
		<li>收集卵子，清洗，并在次日去除未受精或畸形的胚胎22。</li>
		<li>将胚胎在28.5 °C下孵育，直至可用于注射癌细胞，此时斑马鱼胚胎处于受精后2天（2 dpf）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备注射用琼脂糖板。
	<ol>
		<li>每块板用25 ml 1.5%琼脂糖溶于dH2O中并加热融化。</li>
		<li>将12 ml琼脂糖倒入100 mm × 15 mm的培养皿中，静置使其凝固。</li>
		<li>重新加热剩余琼脂糖，然后将其倒入已凝固的琼脂糖板上。</li>
		<li>立即放置一个切割好的玻璃模具（3 mm × 7.2 cm宽 × 7.5 cm长），使其与琼脂糖表面呈30度角，并位于培养皿中央。 
		注：这将形成一个陡峭的60°壁和一个30°斜坡。</li>
		<li>用胶带固定玻璃模具，并让琼脂糖完全凝固。</li>
		<li>小心地移除玻璃模具，注意不要撕裂琼脂糖。 
		注：模具可保存在4 °C的dH2O中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用鱼水（0.3 g/L海盐）平衡注射板。
	<ol>
		<li>用蒸馏水冲洗板两次。</li>
		<li>向板中加入10 ml鱼水，并置于摇床上平衡10分钟。</li>
		<li>再次用鱼水进行第二次平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将受精后2天（dpf）的胚胎转移至含有鱼水的培养皿中，按注射组进行分组22。</li>
	<li>为每组准备注射后的恢复培养皿。确保恢复培养皿中含有10 ml鱼水，并添加青霉素（25 µg/ml）和链霉素（50 µg/ml）。</li>
	<li>通过将4 ml缓冲三卡因储备液（4 mg/ml，10 mM Tris，pH 7）加入50 ml含青霉素和链霉素的鱼水中，配制2×三卡因溶液。</li>
		<li>将15 mg低熔点琼脂糖溶解于10 ml 2×三卡因溶液中，制备用于固定的麻醉介质，以固定活体胚胎用于成像。 
		注：固定介质由1.5%琼脂糖组成。</li>
	<li>拉制显微注射针。
	<ol>
		<li>将玻璃毛细管放入垂直拉针仪中。使用20 mA电流和双线圈加热元件，拉制长锥形的微量移液管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用脂溶性荧光染料标记癌细胞
<ol>
	<li>在推荐的培养条件下维持癌细胞的生长。 
	注：以下细胞系维持在 DMEM + 10% FBS 中：BT-474、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468 和 SK-BR-3。以下细胞系维持在 RPMI + 10% FBS 中：HCC 1806 和 T-47D。所有细胞系在培养期间均保持在 37 oC 和 5% CO2 条件下。</li>
	<li>通过消化贴壁生长的癌细胞获得单细胞悬液。
	<ol>
		<li>先用 PBS 洗涤细胞，然后加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液处理。 
		注：胰蛋白酶消化时间取决于具体细胞系。</li>
		<li>细胞脱落后，使用含血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将中和后的细胞悬液在 200 × g 条件下离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中用于细胞计数。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪对细胞悬液进行计数，并将 100 万个细胞重悬于 200 µl 培养基中。
	<ol>
		<li>注射前使用台盼蓝染色排除法检测细胞活力。 
		注：仅应向斑马鱼胚胎中注射活细胞群体，因为死细胞的注射无法真实反映血管侵袭情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向癌细胞悬液中加入 2 µl 红色脂溶性染料，使终浓度为 1:100，充分混匀后于 37 °C 孵育 20 分钟。 
	注：染料浓度和标记时间可能需要根据不同细胞系进行优化。</li>
	<li>孵育结束后，向管中加入 1 ml 新鲜培养基，然后在 200 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>洗去癌细胞表面残留的荧光染料。
	<ol>
		<li>吸除细胞沉淀中的上清液，将沉淀重悬于 1 ml 新鲜培养基中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>重复洗涤步骤一次：吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 新鲜培养基中，再次在 200 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>第三次重复洗涤步骤：吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 新鲜培养基中，再次在 200 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除上清液，将含有 100 万个标记细胞的细胞沉淀重悬于 500 µl 新鲜培养基中。 
	注：可在培养基中添加 0.5 mM EDTA 以防止细胞聚集。</li>
</ol>
3. 将癌细胞注射至斑马鱼胚胎的前心窦
<ol>
	<li>将显微注射分配系统连接至加压气源，并接通显微注射分配系统的电源。
	<ol>
		<li>踩下脚踏开关测试压力。针头夹持器应释放出短暂的气流脉冲。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用2倍浓度的三卡因溶液对注射板进行两次平衡处理。
	<ol>
		<li>每次平衡步骤中，向注射板中加入20 ml的2倍浓度三卡因溶液，并置于摇床上震荡10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用塑料移液管将一组胚胎转移至含有2倍浓度三卡因溶液的小培养皿中。</li>
	<li>使用加样枪头将癌细胞回填至显微注射针头内。
	<ol>
		<li>将针头放入电极储存罐中，尖端朝下，使细胞沉降到针尖附近。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用塑料移液管吸取足量的2倍浓度三卡因溶液，将20–30个麻醉后的胚胎转移至注射板中。
	<ol style="margin-left: 40px;">
		<li>让胚胎在移液管尖端沉降。</li>
		<li>轻柔地将胚胎挤入注射板的槽道中，并沿槽道长度方向分散开。</li>
		<li>将胚胎排列整齐，头部朝上，腹部朝向槽道的陡坡侧。 
		注意：三卡因溶液应覆盖整个槽道长度及平坦的琼脂糖表面，但胚胎仅位于槽道内。此时胚胎已准备好进行注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用显微注射分配系统将50–100个癌细胞（2–5 nl）注射到斑马鱼胚胎的前心窦区域。
	<ol>
		<li>将针头安装至显微操作仪的针头夹持器上。</li>
		<li>将注射板置于体视显微镜下，使60度斜面位于左侧，并在25倍放大倍数下对准最上方的胚胎进行聚焦。</li>
		<li>调整显微操作仪位置，使针头在伸出时能够刺入胚胎。</li>
		<li>凭目视将针头缓慢伸出，直至接近胚胎表面。</li>
		<li>在显微镜下观察，调整针头位置，使其在进一步伸出时能准确刺入胚胎。</li>
		<li>穿过卵黄囊刺入胚胎，将针尖置于前心窦处，但不进入窦腔内部。</li>
		<li>踩下脚踏开关注入细胞。注射压力将细胞推入心脏窦腔，随后回撤针头。</li>
		<li>用右手控制注射针的伸出与回缩，同时用左手微调下一个胚胎的位置。</li>
		<li>在准备对下一块注射板进行操作时，将针头放回电极储存罐中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整块注射板完成注射后，将胚胎转移至恢复培养皿中。
	<ol>
		<li>倾斜注射板，使胚胎聚集于底部，冲洗出槽道中残留的胚胎，并用塑料移液管收集。</li>
		<li>让胚胎在移液管底部沉降。</li>
		<li>以最小体积的三卡因溶液将胚胎转移至恢复培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将恢复培养皿在28 °C条件下孵育1小时。
	<ol>
		<li>将存活的斑马鱼胚胎与死亡胚胎及其他碎片分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养皿在33 °C条件下孵育至准备进行评分，通常为24–96小时。 
	注意：该温度是在癌细胞最适生长温度37 °C与斑马鱼最适生长温度28.5 °C之间权衡确定的。</li>
</ol>
4. 渗出评分
<ol>
	<li>将待评分的胚胎放入含有三卡因溶液的培养皿中，使其麻醉。</li>
	<li>将一只已麻醉的幼鱼置于凹面载玻片上的一滴三卡因溶液中。
	<ol>
		<li>将幼鱼侧向放置，以获得尾部区域的最佳成像效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在尾部区域上下调焦，计数已成功侵出血管系统的癌细胞数量。 
	注意：此过程最好由至少两名人员共同完成，其中负责评分的人员应对所评估的实验条件设盲。
	<ol>
		<li>使用10倍物镜在复合荧光显微镜下对幼鱼进行评分；对于难以判断的情况，可使用20倍物镜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将胚胎固定在载玻片上及后续荧光成像
<ol>
	<li>融化1.5%琼脂糖/三卡因溶液，并升温至37 °C。</li>
	<li>将待成像的胚胎置于三卡因溶液中以进行麻醉。</li>
	<li>将胚胎连同一滴三卡因溶液转移至成像表面。可选择使用玻璃底培养皿或显微镜载玻片。</li>
	<li>使用玻璃移液管除去多余的三卡因溶液，使胚胎保留在成像表面上。</li>
	<li>在胚胎上方覆盖一滴融化的琼脂糖溶液。</li>
	<li>在琼脂糖凝固前迅速使用精细工具（如睫毛刷）将胚胎调整为侧向位置以便成像，特别注意使胚胎在成像表面上充分展平。</li>
	<li>将已凝固的琼脂糖液滴浸没于三卡因溶液中。</li>
	<li>对活体斑马鱼胚胎进行显微成像。</li>
</ol>
6. 改良方法：将癌细胞注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊中
<ol>
	<li>按照本方案第 (3) 部分所述方法准备显微注射分配系统和注射用培养皿。</li>
	<li>按照本方案第 (2) 部分所述方法，使用对比性荧光染料标记两个细胞群体。</li>
	<li>将 5 - 10 nl 浓度为 2 × 10⁷ 个细胞/ml 的细胞悬液注入卵黄囊中。保持注射体积恒定，以确保从每个细胞群体中注射相同数量的细胞（100 - 200 个癌细胞）。 
	注意：本实验可使用缺乏荧光血管系统的透明斑马鱼胚胎。可通过注射荧光微珠（&#60; 10 µm）或不发生内渗的细胞系，来对照控制颗粒被动进入血管系统的情况。</li>
	<li>按照本方案第 (3) 部分所述方法回收已注射的胚胎，随后筛选注射成功的胚胎。
	<ol>
		<li>使用体视显微镜筛选并转移成功注射且存活的胚胎至新的培养皿中。 
		注意：所有胚胎的卵黄中均应存在大小一致的细胞团块。若细胞团块大小不一，或有细胞位于卵黄外，则该胚胎应予弃用。</li>
		<li>若在卵黄囊中清晰可见癌细胞，则将存活的胚胎转移至新的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养皿置于 33 °C 条件下孵育，直至准备进行评分，通常为 24 - 48 小时。 
	注意：该温度是在癌细胞最适生长温度（37 °C）与斑马鱼最适生长温度（28.5 °C）之间权衡确定的。</li>
	<li>为评估内渗情况，请参照本方案第 (4) 部分所述指南，但改为计数成功侵入尾部区域血管系统的癌细胞数量。</li>
</ol>

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<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+signaling+between+human+CXCR4+and+zebrafish+ligands+by+the+small+molecule+IT1t+impairs+the+formation+of+triple-negative+breast+cancer+early+metastases+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

该技术利用斑马鱼模型高效检测癌细胞的血管侵袭能力（见图1）。本文将该技术应用于一组乳腺癌细胞系，旨在提供一个基准，供其他研究者在此基础上开展各自的研究（见表1；图2 - 3）。观察发现MDA-MB-231细胞 readily侵入斑马鱼胚胎的尾部区域，表明该细胞系适用于测试可能抑制血管侵袭的药物或因子。相比之下，侵袭性较弱的细胞系（如HCC1806或MDA-MB-468细胞）则可用于研究能够增强血管侵袭能力的因素。若此类实验需要加入药物，则可根据预期治疗效应的持续时间选择两种不同的给药途径：可在将癌细胞注射入胚胎前对其进行药物预处理，或将药物直接加入饲养胚胎的水中，通过扩散作用影响癌细胞。
在我们的比较中，我们分析了癌细胞注射到斑马鱼胚胎心前窦后96小时时在尾部的外渗情况。对于MDA-MB-231细胞竞争实验，在卵黄囊注射后48小时评估癌细胞进入循环系统的内渗过程。所选择的分析时间点通常需要根据不同细胞系进行优化，某些实验中外渗高峰可能在注射后仅24小时即出现。值得注意的是，当向斑马...

转移性疾病是癌症死亡的主要原因，而许多促使癌细胞扩散的机制仍有待发现1。癌细胞要成功发生转移，必须首先侵入原发性肿瘤周围的间质组织，进入（内渗）循环系统，在循环中存活，随后离开（外渗）循环系统，最终在远端器官部位建立可存活的转移灶2。因此，内渗和外渗是转移级联过程中的关键步骤，然而并非所有癌细胞都天然具备破坏并穿过内皮细胞连接的能力3。事实上，癌细胞的血管侵袭过程受到一系列独特选择压力的影响，并可进一步受到多种内源性和外源性因素的调控4。正因如此，研究晚期癌症侵袭行为的技术通常将血管侵袭能力作为预测转移扩散的重要指标。
存在多种模型系统可用于促进对癌细胞血管侵袭的研究 体外. 最常用的 体外 实验采用Transwell系统，以评估癌细胞穿过内皮屏障的迁移能力5 或采用细胞电阻抗传感（Electric Cell-Substrate Impedance Sensing，ECIS）技术，实时监测癌细胞对完整内皮单层的破坏作用6这些检测通常缺乏影响癌细胞与血管内皮壁黏附的流体动力学和基质因素。通过将内皮细胞与支持性基质细胞进行三维共培养构建出可灌注的血管网络，可在一定程度上克服这一问题。目前，这类三维微流控系统代表了该领域的前沿进展 体外 选项7,8然而，这些方法忽略了功能性循环系统强大的微环境，因此只能部分替代 体内 模型
最广泛使用的 体内 小鼠是血管侵袭研究的常用模型，常用于进行实验性转移检测，因为该模型的转移过程在相对较短的时间内发生，且通常能够反映转移能力9这些实验通过将癌细胞直接注入循环系统，从而模拟转移的终末阶段，即癌细胞的血管外渗及在器官中的定植。根据癌细胞注射部位及最终分析器官的不同，实验性转移实验可分为不同类型。在第一种实验类型中，将癌细胞注射至小鼠尾静脉，随后监测癌细胞在肺部的定植情况10,11第二种实验方法包括进行心脏内注射，以引导转移性细胞定植于骨微环境。12-14，还包括大脑15在第三种实验中，将癌细胞注射至脾脏，以促进其在肝脏中的定植16 而第四条递送途径通过颈动脉将癌细胞输送至大脑17,18无论采用何种癌细胞递送方法，器官定植均被视为公认的实验终点，通常通过生物发光、组织学或基于PCR的技术来确定。尽管在小鼠体内进行实验性转移检测具有生理学优势，但这些实验仍需数周至数月才能完成并进行分析。
斑马鱼（Danio rerio）模型最近已成为研究癌症进展的一种新体系，与小鼠相比，该模型可在功能完整的循环系统中以更短的时间尺度评估癌细胞的血管侵袭能力19,2021-24。该方法利用一种透明的斑马鱼品系，其内皮细胞在kdrl启动子驱动下表达绿色珊瑚荧光蛋白报告基因，kdrl是斑马鱼中血管内皮生长因子的受体25。在该检测中，将标记有红色荧光标记物的癌细胞注射到2日龄胚胎的心前窦中。注射后48至96小时之间，可在荧光显微镜下高效地对已从血管系统侵袭至胚胎尾部区域的癌细胞进行计数。本文将该技术应用于一组常用的人类乳腺癌细胞系，以展示它们在血管侵袭能力上的显著差异。此外，我们还证明，将注射位点改为胚胎卵黄囊可研究异质性细胞间的相互作用，因为可使用不同荧光染料对癌细胞群体进行差异化标记，并注射到无荧光血管的斑马鱼胚胎中。在后一种检测中，注射后24至48小时，在尾部区域对侵入卵黄并进入血管系统的癌细胞进行计数。由于该模型高效且操作便捷，斑马鱼正被越来越多地用于在生理环境下快速检测癌细胞的血管侵袭能力。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>康宁公司</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4&quot; 一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>康宁公司</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖，分子生物学级别</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>毛细玻璃管，标准型，1.2 mm × 0.68 mm，4&quot;</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C 垂直拉针仪</td><td>霍夫斯特拉团队</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>电极储存罐，1.0 mm</td><td>世界精密仪器公司</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>盐酸三卡因甲磺酸盐（Tricaine，MS-222）</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>睫毛刷</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 移液管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样移液器吸头</td><td>Fisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿（12.0 mm）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>玻璃凹片载玻片</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 盐，海盐</td><td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>乳胶橡胶吸头，2 ml，每包72个</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素G钾</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，100 mm × 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>&amp;nbsp;FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼&amp;nbsp;</td><td>乔治城斑马鱼共享资源中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞系在DMEM + 10% FBS中培养，BT-474和HCC1806细胞除外，后者在RPMI + 10% FBS中培养。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在斑马鱼（danio rerio）中检测癌细胞的血管侵袭能力

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

癌细胞的血管侵袭与外渗是转移进展的标志性特征。传统 体外 内皮细胞侵袭的癌症模型通常缺乏侵袭细胞原本所暴露的流体动力学环境 体内。然而， 体内 诸如小鼠模型等系统虽然生理相关性更高，但需要较长的实验周期，并在监测和数据分析方面带来独特挑战。本文描述了一种斑马鱼检测方法，旨在通过快速评估癌细胞的血管侵袭和外渗能力来弥补这一技术差距。该方法包括将荧光标记的癌细胞注射到透明的2日龄斑马鱼胚胎的心前窦中，其血管系统由一种对比性荧光报告系统标记。注射后，癌细胞需在循环系统中存活，并随后从血管外渗至胚胎尾部组织。通过在固定时间点对活体胚胎进行荧光成像，可高效识别并计数已外渗的癌细胞。通过将注射位点改为卵黄囊，该技术可进一步改造用于研究癌细胞的内渗过程和/或异质性癌细胞混合群体间的竞争行为。综上，这些方法可用于评估癌细胞的关键特征性行为，并有助于揭示向转移表型恶性进展的相关机制。

本研究利用斑马鱼胚胎模型检测了几种常用乳腺癌细胞系的血管侵袭能力（图1）。在对不同细胞系的外渗情况进行评分时采用了严格的标准，仅当癌细胞明显发生外渗时才计为阳性事件，主要目的是减少因误将细胞碎片计数而导致的假阳性结果。
分析结果显示，在注射至心脏前腔后96小时评估侵袭情况时，各细胞系之间表现出显著差异（表1）。在测试的7种细胞系中，注射MDA-MB-231细胞系的斑马鱼胚胎每胚胎中渗出的癌细胞数量最多，这一发现与其公认的转移特性一致（图2）。我们还发现，BT-474细胞 readily 侵入胚胎尾部区域，而其他细胞系（如MCF-7、SK-BR-3和T-47D细胞）侵袭性极低（图3）。一个引人注意的发现是，大约一半注射MDA-MB-468细胞的斑马鱼胚胎在心脏区域出现水肿，这些样本未被计分。因此，在获得足够数量可用于外渗...

该方法利用斑马鱼胚胎高效检测癌细胞的血管侵袭能力。将荧光标记的癌细胞注射至发育中胚胎的心前窦或卵黄囊内，24至96小时后通过尾部区域的荧光显微镜观察，评估癌细胞的血管内侵及外渗情况。

在斑马鱼（Danio Rerio）中检测癌细胞的血管侵袭能力

癌细胞的血管侵袭与外渗是转移进展的标志性特征。传统的体外癌细胞侵袭模型……

本实验的总体目标是评估癌细胞在斑马鱼胚胎模型中的恶性及侵袭性行为。该方法可帮助研究人员确定癌细胞是否能够从功能性循环系统中发生侵袭，从而模拟转移级联过程中的一个关键步骤。该技术的主要优势在于，斑马鱼胚胎模型相较于常用于小鼠的类似实验，能够提供更快速的评估结果和更短的实验周期。本实验操作由乔治城大学斑马鱼核心设施负责人 Eric Glasgow 博士进行演示。按照文本方案准备好癌细胞、试剂和斑马鱼胚胎后，将显微注射分配系统连接至加压气源，并接通电源。通过踩下脚踏板测试压力。针持应释放出短暂的气流。向注射板中加入 20 毫升 2X 三卡因溶液，并将该板置于摇床上以达到平衡。然后用第二份 2X 三卡因溶液重复平衡步骤。接下来，使用塑料移液管将一组胚胎转移至含有2X三卡因溶液的小培养皿中。使用加样枪头，从后方填充显微注射针管内的癌细胞。将针管放入电极储存罐中，针尖朝下放置，以便细胞沉降到针尖附近。用塑料移液管吸取足量含有2X三卡因的麻醉胚胎，将20至30个麻醉后的胚胎转移至注射板中。让胚胎聚集在移液管尖端，然后轻轻将胚胎排入注射板的槽内，并沿槽的长度方向分散开。将胚胎排列整齐，头部朝上，腹部朝向槽的陡坡侧壁。将针固定到显微操作仪的针夹持器上。然后，将注射板置于体视显微镜下，使60度斜面朝左，并在25倍放大倍数下对准最上方的胚胎进行聚焦。调整显微操作仪的位置，使针在伸出时能够刺入胚胎。然后用肉眼调整针头位置，使其几乎接触到胚胎。现在，在显微镜下观察，将针头紧贴胚胎对齐。要注入细胞，需穿过卵黄囊刺入胚胎。踩下脚踏板，将注射针尖置于心前窦处，但不要插入其中。注射时的力量会将细胞注入心脏窦内。或者，将细胞注射到卵黄囊中，可如文中所述用于研究血管侵袭的不同方面。用右手伸缩注射针。用左手进行微调，以定位下一个胚胎。当整块培养板注射完毕后，将针头放回电极储存罐中。为将胚胎转移至恢复皿中，倾斜注射板使胚胎滑到底部，冲洗出槽道中的所有胚胎，并用塑料移液管收集。让胚胎在移液管底部沉降，然后以最少量的Tricaine将胚胎转移至恢复皿中。在28摄氏度下孵育恢复皿1小时，随后将存活胚胎与死亡胚胎及碎片分离。将培养皿置于 33 摄氏度下孵育，直至准备进行评分。根据文本方案，将一批待评分的胚胎麻醉后，取一只麻醉的幼虫置于凹玻片上的三卡因液滴中。将幼虫侧向摆放，以获得尾部区域的最佳成像效果。将载玻片置于配备10倍物镜的复合荧光显微镜上。通过聚焦尾部区域的上下层面，清晰辨别完整的细胞，并计数成功从脉管系统侵袭出的癌细胞数量，以此对幼鱼进行评分。融化1.5%琼脂糖三卡因溶液，并将其加热至37摄氏度。在麻醉胚胎后，将胚胎转移至含有 Tricaine 溶液的液滴中，并置于成像表面。使用玻璃移液管除去多余的 Tricaine 溶液，使胚胎保留在成像表面。随后在胚胎上覆盖一滴融化的琼脂糖溶液。操作需迅速，在

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