在斑马鱼（Danio Rerio）中检测癌细胞的血管侵袭能力

本实验的总体目标是评估癌细胞在斑马鱼胚胎模型中的恶性及侵袭性行为。该方法可帮助研究人员确定癌细胞是否能够从功能性循环系统中发生侵袭，从而模拟转移级联过程中的一个关键步骤。该技术的主要优势在于，斑马鱼胚胎模型相较于常用于小鼠的类似实验，能够提供更快速的评估结果和更短的实验周期。

本实验操作由乔治城大学斑马鱼核心设施负责人 Eric Glasgow 博士进行演示。按照文本方案准备好癌细胞、试剂和斑马鱼胚胎后，将显微注射分配系统连接至加压气源，并接通电源。通过踩下脚踏板测试压力。

针持应释放出短暂的气流。向注射板中加入 20 毫升 2X 三卡因溶液，并将该板置于摇床上以达到平衡。然后用第二份 2X 三卡因溶液重复平衡步骤。

接下来，使用塑料移液管将一组胚胎转移至含有2X三卡因溶液的小培养皿中。使用加样枪头，从后方填充显微注射针管内的癌细胞。将针管放入电极储存罐中，针尖朝下放置，以便细胞沉降到针尖附近。

用塑料移液管吸取足量含有2X三卡因的麻醉胚胎，将20至30个麻醉后的胚胎转移至注射板中。让胚胎聚集在移液管尖端，然后轻轻将胚胎排入注射板的槽内，并沿槽的长度方向分散开。将胚胎排列整齐，头部朝上，腹部朝向槽的陡坡侧壁。

将针固定到显微操作仪的针夹持器上。然后，将注射板置于体视显微镜下，使60度斜面朝左，并在25倍放大倍数下对准最上方的胚胎进行聚焦。调整显微操作仪的位置，使针在伸出时能够刺入胚胎。

然后用肉眼调整针头位置，使其几乎接触到胚胎。现在，在显微镜下观察，将针头紧贴胚胎对齐。要注入细胞，需穿过卵黄囊刺入胚胎。

踩下脚踏板，将注射针尖置于心前窦处，但不要插入其中。注射时的力量会将细胞注入心脏窦内。或者，将细胞注射到卵黄囊中，可如文中所述用于研究血管侵袭的不同方面。

用右手伸缩注射针。用左手进行微调，以定位下一个胚胎。当整块培养板注射完毕后，将针头放回电极储存罐中。

为将胚胎转移至恢复皿中，倾斜注射板使胚胎滑到底部，冲洗出槽道中的所有胚胎，并用塑料移液管收集。让胚胎在移液管底部沉降，然后以最少量的Tricaine将胚胎转移至恢复皿中。在28摄氏度下孵育恢复皿1小时，随后将存活胚胎与死亡胚胎及碎片分离。

将培养皿置于 33 摄氏度下孵育，直至准备进行评分。根据文本方案，将一批待评分的胚胎麻醉后，取一只麻醉的幼虫置于凹玻片上的三卡因液滴中。将幼虫侧向摆放，以获得尾部区域的最佳成像效果。

将载玻片置于配备10倍物镜的复合荧光显微镜上。通过聚焦尾部区域的上下层面，清晰辨别完整的细胞，并计数成功从脉管系统侵袭出的癌细胞数量，以此对幼鱼进行评分。融化1.5%琼脂糖三卡因溶液，并将其加热至37摄氏度。

在麻醉胚胎后，将胚胎转移至含有 Tricaine 溶液的液滴中，并置于成像表面。使用玻璃移液管除去多余的 Tricaine 溶液，使胚胎保留在成像表面。随后在胚胎上覆盖一滴融化的琼脂糖溶液。

操作需迅速，在琼脂糖凝固之前，使用睫毛刷等精细工具将胚胎侧向定位以便成像，并特别注意确保胚胎在成像平面上完全展平。待琼脂糖液滴完全凝固后，将其浸入Tricaine溶液中。最后，对活体斑马鱼胚胎进行显微成像。

在测试的七种乳腺癌细胞系对斑马鱼胚胎的血管侵袭能力时，MDA-MB-231细胞系在注射后96小时评估时，每个胚胎中渗出的癌细胞数量最多。同时观察到，BT-474细胞容易侵入胚胎的尾部区域，而其他细胞系如MCF-7、SK-BR-3和T-47D细胞则侵袭性较弱。在一项利用不同注射位点的改良实验中，开展了一项竞争实验，将两种具有不同血管侵袭能力的MDA-MB-231细胞群体同时注射到发育中胚胎的卵黄囊内。

评分结果显示，在注射前于融合培养条件下扩增的 MDA-MB-231 细胞，进入血液循环的内渗能力降低，因此在胚胎尾部区域的分布减少。一旦掌握该技术，若操作得当，斑马鱼胚胎注射可在四小时内完成。在进行该实验操作时，重要的是要牢记，在评估癌细胞外渗时应采用严格且一致的评判标准。

完成此操作后，可在小鼠模型中进一步验证结果。观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行注射以及评估外渗现象，从而可在斑马鱼胚胎中检测癌细胞的血管侵袭能力。