创建甲状旁腺功能减退小鼠的两种技术：利用GFP标记腺体进行甲状旁腺切除术及白喉毒素介导的甲状旁腺消融

本实验的总体目标是建立两种易于使用、可产生稳定表型且保留甲状腺功能完整的获得性甲状旁腺功能减退小鼠模型。这两种模型的主要优势在于能够精确切除小鼠的甲状旁腺，既可通过荧光引导手术实现，也可利用甲状旁腺激素（PTH）特异性表达白喉毒素受体，从而选择性地靶向并破坏甲状旁腺细胞，而不影响邻近的甲状腺组织。我们希望这些小鼠模型能够解答甲状旁腺功能减退研究领域中的关键科学问题。

例如，PTH 类似物疗法能否在不增加尿钙排泄的情况下帮助维持正常的血清钙水平？这些模型还可用于研究低钙性甲状旁腺功能减退症中的其他临床问题。例如，骨强度是否受到低钙性甲状旁腺功能减退症的影响，以及它是否会随着治疗而发生变化？

诸如此类的问题在患者中难以回答，但可利用这些小鼠模型加以研究。首先，按照已批准的方案，对8至10周龄、在甲状旁腺特异性表达GFP的小鼠进行麻醉。将动物置于仰卧位，并通过脚趾夹捏无回缩反射或其他方法确认麻醉深度适宜。

伸展颈部腹侧区域，并通过剃毛准备手术。使用聚维酮碘消毒垫对剃毛后的皮肤进行消毒，然后根据您已批准的方案，用外科擦洗剂和酒精冲洗准备切口部位。接着，用无菌手术巾覆盖动物，以减少手术部位的污染。

用手术刀做一个2厘米长的纵向切口后，使用弯齿镊分离筋膜，并将唾液腺推向一侧。然后在解剖显微镜下观察手术区域，用尖头镊的尖端剪开并分离气管旁肌，暴露气管。辨认位于气管两侧的左右甲状腺叶。

然后将光源切换至荧光灯，观察两个呈绿色荧光的甲状旁腺。啮齿类动物通常仅有两个甲状旁腺。如果无法在两侧甲状腺旁识别出这两个甲状旁腺，则应怀疑存在异位的甲状旁腺，需沿气管进行仔细搜寻。

接下来，使用手术镊和剪刀仔细摘除绿色的甲状旁腺，并沿气管仔细检查，确保所有绿色组织均已清除。用无菌纱布止血。用间断缝合线缝合气管旁肌肉。

使用 Halstead 缝合线关闭皮肤切口。将术后动物放入单独的笼子中，并置于加热垫上以恢复体温。待小鼠清醒后，将颗粒饲料、水和一些明胶食物放在笼子底部。

术后观察两小时后，将小鼠送回动物饲养设施。甲状旁腺切除术后第3天，使用血气分析仪、钙和pH分析仪等设备，采集10 µL尾部血液分析离子钙水平。若甲状旁腺切除成功，小鼠血液离子钙浓度将等于或低于假手术对照组小鼠均值减去两个标准差的水平。

首先，将白喉毒素粉末用无菌生理盐水稀释至浓度为 0.5 微克/毫升，配制白喉毒素溶液。对溶液进行无菌过滤并分装。向 8 至 10 周龄、在甲状旁腺特异性表达白喉毒素受体的小鼠体内注射白喉毒素，剂量为每公斤体重 5 微克。

在第二次注射白喉毒素后的第三天，取10微升尾部血液分析离子化钙含量，方法同前。以下是表达绿色荧光蛋白（GFP）特异性标记甲状旁腺的小鼠中，甲状旁腺不同位置的代表性图像。这些小鼠具有两个或三个绿色的甲状旁腺。

大多数甲状旁腺位于甲状腺上缘或下缘附近。在少数情况下，部分甲状旁腺位置异位。我们小鼠模型的一个优势在于甲状腺保持完整。

该图显示了甲状旁腺切除术后三个月 GFP-PTX 小鼠的促甲状腺激素（TSH）水平。该图显示了 T4 的检测结果。GFP-PTX 小鼠的 TSH 浓度和 T4 浓度与对照组小鼠相比无显著差异。

该图像显示了GFP-PTX小鼠的血液钙水平和PTH水平。该图像还显示了注射白喉毒素的PTHcre-iDTR小鼠的血液钙水平和PTH水平。在为期三个月的观察期内，GFP-PTX小鼠和注射白喉毒素的PTHcre-iDTR小鼠均表现出稳定的低钙血症和降低的PTH水平。

一旦掌握，整个 GFP 引导的甲状旁腺切除术大约可在 20 分钟内完成。若操作得当，单次白喉毒素注射耗时不超过 1 分钟。术后，这些小鼠将出现甲状旁腺功能减退，可作为临床前疾病模型使用。

可以探讨不同甲状旁腺激素（PTH）类似物在治疗甲状旁腺功能减退症中的疗效等问题。请注意，白喉毒素具有危害性，相关工作人员应接受常规的白喉毒素免疫接种。在进行这些操作时，应始终佩戴口罩、手套等个人防护装备。