两种技术来创建Hypoparathyroid小鼠:甲状旁腺切除术采用GFP腺和白喉毒素介导甲状旁腺消融
March 14th, 2017
患有获得性甲状旁腺功能减退症的小鼠可用于研究甲状旁腺功能减退症的新型药物治疗。演示了创建此类小鼠的两种程序。 GFP-PTX 小鼠是通过绿色荧光甲状旁腺引导的甲状旁腺手术切除术产生的。 第二种非手术方法基于甲状旁腺对白喉毒素受体的特异性表达。
该程序的总体目标是生成两个获得性甲状旁腺功能减退症的小鼠模型，它们易于使用，产生稳定的表型，并保持甲状腺功能完好无损。这两种模型的主要优点是它们能够通过荧光引导手术或通过白喉毒素受体的 PTH 特异性表达精确去除小鼠中的甲状旁腺，从而允许细胞被选择性靶向和破坏，而不会干扰邻近的甲状腺。我们希望我们的小鼠模型能够回答甲状旁腺功能减退症领域的关键问题。
例如，PTH 类似物疗法能否在不增加尿钙排泄的情况下帮助维持正常的血清钙水平？这些模型也可用于研究甲状旁腺功能减退症的其他临床问题。例如，甲状旁腺功能减退症是否会影响骨骼强度，它会随着治疗而改变吗？
像这样的问题在患者中很难回答，但这些小鼠模型可用于解决这些问题。首先麻醉 8 至 10 周龄的小鼠，根据批准的方案在甲状旁腺中特异性表达 GFP。将动物置于仰卧位，并通过没有脚趾捏、撤退反射或其他方式确保适当的麻醉深度。
延长腹侧颈部区域，剃掉皮毛为手术做准备。用聚维酮碘消毒垫对剃过的皮肤进行消毒，然后按照您批准的方案使用手术擦洗和酒精冲洗来准备切口部位。接下来，用无菌手术单覆盖动物，以减少手术部位的污染。
用手术刀切开 2 厘米的纵向切口后，使用弯曲的锯齿镊子解剖筋膜，并将唾液腺推到一边。然后，在通过解剖显微镜观察手术部位的同时，使用锋利的镊子尖端切割和分离气管旁肌肉并露出气管。确定位于气管旁边的甲状腺的左右叶。
然后将光源切换到荧光灯，并观察两个绿色荧光甲状旁腺。啮齿动物通常只有两个甲状旁腺。如果您无法识别每侧甲状腺旁边的两个甲状旁腺，则应怀疑位于异位的甲状旁腺，并应沿气管仔细搜索它们。
接下来，使用手术钳和剪刀小心地去除绿色的甲状旁腺，并沿着气管仔细检查，以确保所有绿色组织都已被去除。使用无菌纱布止血。用间断缝合闭合气管旁肌肉。
用 Halstead 缝合线闭合皮肤切口。将术后动物放入加热垫上的单独笼子中，以恢复体温。一旦老鼠醒来，将颗粒食物和水以及一些明胶食物放在笼子地板上。
术后观察两小时后，将小鼠放回动物设施。甲状旁腺切除术后 3 天，使用血气系统、钙和 pH 分析仪等分析仪分析 10 μL 尾血中的离子钙。如果甲状旁腺切除术成功，血离子钙将等于或小于假手术对照小鼠的两个标准差。
首先制备白喉毒素溶液，用无菌生理盐水将白喉毒素粉末稀释至每毫升 0.5 微克的浓度。无菌过滤溶液和同种异体。将每公斤体重 5 微克白喉毒素注射到 8 至 10 周龄的小鼠中，在甲状旁腺中特异性表达白喉毒素受体。
第二次注射白喉毒素后 3 天，像以前一样分析 10 μL 尾血中的离子钙。以下是在甲状旁腺中特异性表达 GFP 的小鼠甲状旁腺不同位置的代表性图像。小鼠有 2 个或 3 个绿色甲状旁腺。
大多数甲状旁腺位于甲状腺上缘附近或下缘附近。在极少数情况下，一些甲状旁腺位于异位。我们的小鼠模型的优点之一是甲状腺保持完整。
该图显示了甲状旁腺切除术后 3 个月 GFP-PTX 小鼠的 TSH 水平。此图显示了 T4 测量值。GFP-PTX 小鼠的 TSH 浓度和 T4 浓度与对照小鼠没有差异。
该图显示了 GFP-PTX 小鼠的血钙水平和 PTH 水平。该图显示了注射白喉毒素的 PTHcre-iDTR 小鼠的血钙水平和 PTH 水平。GFP-PTX 小鼠和 DT 注射 PTHcre-iDTR 小鼠在三个月的观察期内均表现出稳定的低钙血症和 PTH 水平降低。
一旦掌握，GFP 引导的甲状旁腺切除术可以在大约 20 分钟内完成整个手术。如果作得当，单次注射白喉毒素不会超过一分钟。在此程序之后，这些小鼠会出现甲状旁腺功能减退症，可用作临床前疾病模型。
可以解决的问题，例如不同 PTH 激素类似物治疗甲状旁腺功能减退症的疗效。不要忘记白喉毒素是危险的，工作人员应该进行常规的白喉毒素免疫接种。执行这些程序时，应始终佩戴口罩和手套等个人防护设备。
概述
本研究展示了两种生成获得性甲状旁腺功能减退症小鼠模型的程序，这对于研究新型药物治疗至关重要。这些模型允许精确移除甲状旁腺，同时保持甲状腺功能，促进对该疾病的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 内分泌学
- 动物模型
背景
- 获得性甲状旁腺功能减退症是一个在人类中难以研究的疾病。
- 小鼠模型为研究提供了受控环境。
- 现有方法可能无法在移除甲状旁腺过程中有效保持甲状腺功能。
- 理解甲状旁腺功能减退症可以带来更好的治疗选择。
研究目的
- 创建模仿获得性甲状旁腺功能减退症的小鼠模型。
- 研究PTH类似物疗法对血清钙水平的影响。
- 探索甲状旁腺功能减退症对骨骼强度的影响。
使用的方法
- 通过荧光引导的外科手术切除甲状旁腺。
- 注射白喉毒素以选择性靶向甲状旁腺细胞。
- 手术后监测血清钙和PTH水平。
- 使用成像技术可视化甲状旁腺位置。
主要结果
- 成功创建了稳定的甲状旁腺功能减退症小鼠模型。
- 在切除甲状旁腺过程中保持甲状腺功能。
- 模型中表现出低钙血症和PTH水平降低。
- 模型可用于评估PTH类似物的有效性。
结论
- 开发的小鼠模型对研究甲状旁腺功能减退症很有价值。
- 它们能够在不影响甲状腺功能的情况下进行潜在治疗的研究。
- 未来的研究可以利用这些模型来回答关键的临床问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable preclinical models of acquired hypoparathyroidism are essential for evaluating PTH analog therapies and understanding calcium homeostasis without confounding thyroid dysfunction. These dual-models enable target validation and mechanistic de-risking by providing stable, reproducible phenotypes that preserve thyroid function, supporting informed go/no-go decisions in early discovery. The ability to model human disease pathophysiology in mice enhances translational continuity and portfolio relevance for endocrine therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of PTH-dependent pathways and therapeutic hypothesis testing in a genetically tractable system.
- Operational Value: Provides a stable hypocalcemic phenotype for consistent pharmacological readouts across study cohorts.
- Predictive Value: Supports assessment of target engagement and downstream signaling fidelity for PTH receptor modulators.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems with quantifiable serum calcium and PTH endpoints for assay standardization.
- Operational Value: Delivers reproducible, fluorescence-guided or toxin-induced ablation ready for high-throughput compound screening.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple therapeutic modalities targeting calcium regulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models reflect human hypoparathyroidism pathophysiology, enabling disease-relevant system testing.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of bone turnover and calcium regulation metrics.
- Predictive Confidence: Allows risk-adjusted advancement decisions based on sustained phenotypic stability over three months.
Pipeline & Workflow Integration
The models integrate into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, providing a disease-relevant system for endocrine drug evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of PTH analog efficacy on serum calcium without thyroid confounding.
- Screening: Enables assay readiness via stable, quantifiable hypocalcemic phenotypes suitable for compound library evaluation.
- Analytics: Provides ionized calcium and PTH level readouts that help teams compare treatment effects and target modulation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through stable phenotype maintenance and bone strength assessment capability.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for multiple projects investigating calcium-sensing receptor agonists, PTH analogs, or bone anabolics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic de-risking of PTH pathway interventions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fluorescence-guided surgery or inducible toxin ablation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in calcium homeostasis programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on translatable phenotypic fidelity and thyroid-sparing design.
Implementation Considerations
- Required expertise in mouse surgery, fluorescence microscopy, and toxin handling.
- Instrumentation needs include dissection microscopes with fluorescence capability and calcium analyzers.
- Cross-team standardization requires consistent anesthesia, postoperative monitoring, and ionized calcium measurement protocols.
- Adaptation considerations include ectopic gland variability and species-specific toxin dosing.
- Practical limitations include biosafety requirements for diphtheria toxin and surgical skill dependency for GFP-guided ablation.
