两种技术来创建Hypoparathyroid小鼠:甲状旁腺切除术采用GFP腺和白喉毒素介导甲状旁腺消融

该程序的总体目标是生成两个获得性甲状旁腺功能减退症的小鼠模型，它们易于使用，产生稳定的表型，并保持甲状腺功能完好无损。这两种模型的主要优点是它们能够通过荧光引导手术或通过白喉毒素受体的 PTH 特异性表达精确去除小鼠中的甲状旁腺，从而允许细胞被选择性靶向和破坏，而不会干扰邻近的甲状腺。我们希望我们的小鼠模型能够回答甲状旁腺功能减退症领域的关键问题。

例如，PTH 类似物疗法能否在不增加尿钙排泄的情况下帮助维持正常的血清钙水平？这些模型也可用于研究甲状旁腺功能减退症的其他临床问题。例如，甲状旁腺功能减退症是否会影响骨骼强度，它会随着治疗而改变吗？

像这样的问题在患者中很难回答，但这些小鼠模型可用于解决这些问题。首先麻醉 8 至 10 周龄的小鼠，根据批准的方案在甲状旁腺中特异性表达 GFP。将动物置于仰卧位，并通过没有脚趾捏、撤退反射或其他方式确保适当的麻醉深度。

延长腹侧颈部区域，剃掉皮毛为手术做准备。用聚维酮碘消毒垫对剃过的皮肤进行消毒，然后按照您批准的方案使用手术擦洗和酒精冲洗来准备切口部位。接下来，用无菌手术单覆盖动物，以减少手术部位的污染。

用手术刀切开 2 厘米的纵向切口后，使用弯曲的锯齿镊子解剖筋膜，并将唾液腺推到一边。然后，在通过解剖显微镜观察手术部位的同时，使用锋利的镊子尖端切割和分离气管旁肌肉并露出气管。确定位于气管旁边的甲状腺的左右叶。

然后将光源切换到荧光灯，并观察两个绿色荧光甲状旁腺。啮齿动物通常只有两个甲状旁腺。如果您无法识别每侧甲状腺旁边的两个甲状旁腺，则应怀疑位于异位的甲状旁腺，并应沿气管仔细搜索它们。

接下来，使用手术钳和剪刀小心地去除绿色的甲状旁腺，并沿着气管仔细检查，以确保所有绿色组织都已被去除。使用无菌纱布止血。用间断缝合闭合气管旁肌肉。

用 Halstead 缝合线闭合皮肤切口。将术后动物放入加热垫上的单独笼子中，以恢复体温。一旦老鼠醒来，将颗粒食物和水以及一些明胶食物放在笼子地板上。

观察两小时后，将小鼠放回动物设施。甲状旁腺切除术后 3 天，使用血气系统、钙和 pH 分析仪等分析仪分析 10 μL 尾血中的离子钙。如果甲状旁腺切除术成功，血离子钙将等于或小于假手术对照小鼠的两个标准差。

首先制备白喉毒素溶液，用无菌生理盐水将白喉毒素粉末稀释至每毫升 0.5 微克的浓度。无菌过滤溶液和同种异体。将每公斤体重 5 微克白喉毒素注射到 8 至 10 周龄的小鼠中，在甲状旁腺中特异性表达白喉毒素受体。

第二次注射白喉毒素后 3 天，像以前一样分析 10 μL 尾血中的离子钙。以下是在甲状旁腺中特异性表达 GFP 的小鼠甲状旁腺不同位置的代表性图像。小鼠有 2 个或 3 个绿色甲状旁腺。

大多数甲状旁腺位于甲状腺上缘附近或下缘附近。在极少数情况下，一些甲状旁腺位于异位。我们的小鼠模型的优点之一是甲状腺保持完整。

该图显示了甲状旁腺切除术后 3 个月 GFP-PTX 小鼠的 TSH 水平。此图显示了 T4 测量值。GFP-PTX 小鼠的 TSH 浓度和 T4 浓度与对照小鼠没有差异。

该图显示了 GFP-PTX 小鼠的血钙水平和 PTH 水平。该图显示了注射白喉毒素的 PTHcre-iDTR 小鼠的血钙水平和 PTH 水平。GFP-PTX 小鼠和 DT 注射 PTHcre-iDTR 小鼠在三个月的观察期内均表现出稳定的低钙血症和 PTH 水平降低。

一旦掌握，GFP 引导的甲状旁腺切除术可以在大约 20 分钟内完成整个手术。如果作得当，单次注射白喉毒素不会超过一分钟。在此程序之后，这些小鼠会出现甲状旁腺功能减退症，可用作临床前疾病模型。

可以解决的问题，例如不同 PTH 激素类似物治疗甲状旁腺功能减退症的疗效。不要忘记白喉毒素是危险的，工作人员应该进行常规的白喉毒素免疫接种。执行这些程序时，应始终佩戴口罩和手套等个人防护设备。