Name: 磁悬浮加上便携式成像与分析诊断疾病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习磁悬浮技术用于细胞密度分析，通过便携式成像设备诊断镰状细胞病并分离血细胞类型。该方法设备简便、操作简易，适用于临床及资源有限地区的快速医学检测。

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作者谨此感谢波士顿儿童医院/达纳—法伯癌症研究所的 Matthew Heeney 博士和耶鲁—纽黑文医院的 Farzana Pashankar 博士提供镰状细胞病患者样本。作者还要感谢 Chu H. Yu 和 Ashwini Joshi 在样本检测和数据整理方面提供的帮助。
S.T. 感谢美国心脏协会科学家发展奖（15SDG25080056）和康涅狄格大学研究卓越计划对该研究的经费支持。S.K. 感谢本研究工作获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1247393）的支持。

伦理声明：所有涉及人血样本的操作均按照机构规定进行。所有方案均经过机构审查委员会审核并批准。所有参与者均签署了知情同意书。
1. 镰状细胞病诊断的样本制备5,8
<ol>
	<li>在 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中配制 50 mM 的钆布醇溶液。</li>
	<li>将 10 mM 的焦亚硫酸钠溶解于钆溶液中。 
	注意：焦亚硫酸钠吸入后有毒，对皮肤和组织有强刺激性。与水混合后呈腐蚀性酸性。高温加热时可能分解，释放出有毒的硫和钠氧化物烟雾。</li>
	<li>通过指尖采血或静脉穿刺获取血样。
	<ol>
		<li>使用带有洁净一次性采血针的采血笔进行采血。在穿刺部位附近施加压力，并用棉签擦拭形成的血滴 3 至 4 次，然后使用移液器收集血液；注意不要通过挤压组织“挤奶”式采血，以免组织液混入样本造成污染。</li>
		<li>或者，采用标准静脉穿刺程序采血14。 
		注意：若样本需保存数小时以上，应将血液收集至含有抗凝剂（如 EDTA）的真空采血管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将少于 1 µL 的血液加入 100 µL 钆-焦亚硫酸钠溶液中。</li>
</ol>
2. 白细胞计数的样本制备7
<ol>
	<li>通过指尖采血或静脉穿刺获取血样，方法见第1节。</li>
	<li>可选：使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。将5 µL血液移入500 µL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育3–5分钟。 
	注意：此步骤可用于确认分离出的白细胞群体的悬浮位置范围。然而，此步骤并非必需，因为本文展示的结果表明，红细胞的悬浮位置明显低于白细胞。</li>
	<li>将全血用含25 mM Gd的HBSS稀释1:1,000 
	注意：若已进行细胞裂解，则将裂解后的样本按9:1的比例与250 mM Gd溶液混合（裂解样本:250 mM Gd），以获得含25 mM Gd的样本。</li>
</ol>
3. 使用磁悬浮平台分析样品4,5,6,7,8
<ol>
	<li>启动磁悬浮装置：
	<ol>
		<li>对于独立式装置，将设备插入电源，待其通电启动后，放置在平坦、水平的表面上。</li>
		<li>对于兼容智能手机的版本，启动智能手机应用程序，向左滑动进入图像采集模式，并将装置放置在平坦、水平的表面上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行静态磁悬浮操作：
	<ol>
		<li>通过将方形玻璃微毛细管的一端浸入已制备的样品溶液中，利用毛细作用使样品自动填充至毛细管内。</li>
		<li>将毛细管一端缓慢插入封口剂中，以密封管端。</li>
		<li>将毛细管插入磁悬浮装置的磁铁之间，使仅有约1 cm的管段外露（样品制备示意图请参见图3）。 
		注意：此步骤在兼容智能手机的装置和独立式装置中均相同。</li>
		<li>静置10分钟，期间避免扰动装置或毛细管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行流动辅助磁悬浮操作：
	<ol>
		<li>将样品加载至样品管中。</li>
		<li>将进样管路连接样品容器与微毛细管，再将出样管路连接微毛细管与废液容器。</li>
		<li>设置LED光照强度及流速参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认视野中可见细胞后，按下采集按钮以获取图像（独立式装置上为按钮3，智能手机应用程序中为屏幕底部的相机按钮）。 
	注意：若使用U盘存储图像，请预先创建名为“images”的文件夹并将U盘插入设备，再开启电源。若未检测到存储设备，装置将自动将图像保存至内部存储器，后续可再行导出。 
	注意：为降低异常结果风险，可在每次成像之间将毛细管前后移动约½ cm，采集并分析多张图像。 
	注意：若用户界面提示视野内细胞数量过高或过低，可将毛细管向内或向外微调，或重新制备样品。</li>
	<li>取出样品，并根据所在机构或当地的法规要求进行废弃处理。毛细管应作为锐器处置。</li>
</ol>
<img alt="通过指尖采血、试管、移液管和诊断设备示意图进行采样。" src="/files/ftp_upload/55012/55012fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：样本制备与用户界面。（a）样本制备过程包括刺破受试者指尖，形成血滴，将血滴转移至样本检测溶液中，混匀样本，并通过毛细作用将样本吸入毛细管，然后将样本插入磁悬浮装置中。（b）这些样本制备步骤也会显示在设备屏幕上，以指导用户完成样本制备。（c）该设备包含四个按钮：用于放大样本图像以便通过调节旋钮正确调焦的按钮；用于获取单次测量结果的按钮（设置5秒延迟，以便用户插入样本）；用于进行延时测量的按钮（每5秒采集一张图像，共采集6张）；以及使用完毕后关闭设备的按钮。经Yenilmez et al. 8许可转载。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55012/55012fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 图像分析4,5,6,7,8
<ol>
	<li>运行设备附带的图像分析软件，选择相应的样本类型（细胞分布或细胞类型分离）。 
	注意：对于独立式设备，分析将自动完成，并在图形用户界面上显示结果。对于兼容智能手机的设备，需进入手机相册，选择要分析的视频文件以进行分析。</li>
	<li>观察并记录屏幕上显示的分析结果。 
	注意：对于细胞分布分析（如镰状细胞病诊断），输出结果为细胞群体的限制宽度。 
	注意：对于细胞类型分离（如白细胞识别），输出结果为已标识出白细胞群体的图像。为计算每微升中的细胞数量，需将每幅图像中白细胞的平均数量乘以2,000。例如，若观察到5个白细胞，则表示白细胞浓度为10,000 WBCs/µL。正常范围通常为3,500 - 11,000 WBCs/µL。</li>
	<li>将样本管在设备中前后移动约½ cm，重新捕获另一幅图像并按上述方法进行分析，重复该过程。 
	注意：建议每个样本重复分析5至6次，以避免误差。</li>
</ol>

<ol><li>Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li>
<li>Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Levitational+Assembly+for+Living+Material+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).</li>
<li>Tasoglu, S., Yu, C. H., Gungordu, H. I., Guven, S., Vural, T., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+and+magnetic+self-assembly+of+magnetoceptive+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Guided and magnetic self-assembly of magnetoceptive gels.</a> Nature Communications. 5, 4702(2014).</li>
<li>Amin, R., Knowlton, S., Yenilmez, B., Hart, A., Joshi, A., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/ra/c6ra19483d#!divAbstract">Smart-phone Attachable, Flow-Assisted Magnetic Focusing Device.</a> RSC Advances. 6, 93922-93931 (2016).</li>
<li>Knowlton, S. M., Sencan, I., Aytar, Y., Khoory, J., Heeney, M. M., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+Cell+Detection+Using+a+Smartphone%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sickle Cell Detection Using a Smartphone.</a> Sci Rep. 5, 15022(2015).</li>
<li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), e0134400(2015).</li>
<li>Yenilmez, B., Knowlton, S., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/admt.201600144/full">Self-Contained Handheld Magnetic Platform for Point of Care Cytometry in Biological Samples .</a> Advanced Materials Technologies. 1, 1600144(2016).</li>
<li>Yenilmez, B., Knowlton, S., Yu, C. H., Heeney, M., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/admt.201600100/abstract">Label-Free Sickle Cell Disease Diagnosis Using a Low-Cost, Handheld Platform.</a> Adv Mat Tech. 1 (5), 1600100(2016).</li>
<li>Bender, M. A., Douthitt Seibel, G., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBender%2C+MA+%22GeneReviews%22">GeneReviews</a>. Pagon, R. A. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).</li>
<li>Kaul, D. K., Fabry, M. E., Windisch, P., Baez, S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocytes+in+sickle+cell+anemia+are+heterogeneous+in+their+rheological+and+hemodynamic+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Erythrocytes in sickle cell anemia are heterogeneous in their rheological and hemodynamic characteristics.</a> J Clin Invest. 72 (1), 22-31 (1983).</li>
<li>Joiner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gardos+pathway+to+sickle+cell+therapies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gardos pathway to sickle cell therapies?</a> Blood. 111 (8), 3918-3919 (2008).</li>
<li>Finch, J. T., Perutz, M. F., Bertles, J. F., Döbler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Sickled+Erythrocytes+and+of+Sickle-Cell+Hemoglobin+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of Sickled Erythrocytes and of Sickle-Cell Hemoglobin Fibers.</a> Proc Natl Acad Sci. 70 (3), 718-722 (1973).</li>
<li>Lew, V. L., Etzion, Z., Bookchin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydration+response+of+sickle+cells+to+sickling-induced+Ca%28%2B%2B%29+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dehydration response of sickle cells to sickling-induced Ca(++) permeabilization.</a> Blood. 99 (7), 2578-2585 (2002).</li>
<li>Ernst, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErnst%2C+DJ+%22NCCLS+Procedures+for+the+Collection+of+Diagnostic+Blood+Specimens+by+Venipuncture%3A+Approved+Standard-Sixth+Addition%22">NCCLS Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture: Approved Standard-Sixth Addition</a>. 27 (26), (2007).</li>
</ol>

作者Stephanie Knowlton和Savas Tasoglu是mBiotics公司的创始人，并在该公司持有股权利益。mBiotics是一家初创企业，致力于将本文所述的磁力悬浮平台技术商业化，用于即时诊断解决方案。针对本文描述的技术，已提交一项临时专利申请，标题为“Magnetic Levitation with On-Board Optical Imaging and Image Analysis for Density-Based Separation, Identification, And Measurement”，专利申请号为UCONN Case No. 16-027。

实验方案中的关键步骤 
此过程中的关键因素包括磁铁的正确对齐。如果装置内的磁铁发生移位或分离程度超过正常范围，则可能影响实验结果。为控制该故障或过程中其他潜在问题，可定期使用密度受控的颗粒（如聚苯乙烯微球）来监测随时间发生的变化。此外，悬浮时间至关重要，需给予足够时间使细胞达到平衡状态。对于红细胞，10 分钟足以使所有细胞达到平衡。但需注意，较小的颗粒或细胞可能需要更长时间才能达到平衡。可通过每 5 秒拍摄一次延时图像，并绘制限制宽度随时间变化的曲线来评估这一过程；当限制宽度的变化可忽略不计时，即可判定为达到平衡状态。
该方案中的其他关键步骤包括精确浓度的钆溶液的配制，因为这会显著影响样品的悬浮高度。钆溶液可预先配制并使用储备液，但必须妥善密封，以避免溶液蒸发导致浓度意外升高。此外，必须注意维持所用细胞的健康状态。对于通过指尖采血获取的人血，应在采血后一小时内使用，并通过储存于密封容器中防止干燥。对于通过静脉穿刺获取的人血，样品应加入抗凝剂（本实验使用了常见的抗凝剂乙二胺四乙酸（EDTA））并在4 °C下保存不超过一周。对于贴壁细胞系，在胰酶消化前应彻底清洗去除死细胞，并...

本文介绍了一种技术平台和方法，该方法结合磁力悬浮与自动成像及分析技术，通过分析患者细胞的密度分布来评估疾病状况。这种基于密度的流式细胞分析方法具有广泛适用性，最终可应用于多种疾病的诊断。然而，为了适用于即时检测（POCT）并在发展中国家推广应用，该技术必须满足低成本、便携性和易用性的要求。设备和耗材应易于获取且价格低廉；样品制备过程需简单，分析过程应实现自动化，尽量减少用户操作和结果解读的复杂性，并能快速获得结果。此外，设备必须结构紧凑、便于携带，以便在临床环境和发展中国家均可有效使用。因此，我们开发了一种设备和方法，将磁力悬浮技术与自动成像及图像分析相结合，实现符合即时检测要求的技术平台，用于获取患者细胞群体密度分布的结果。
即时检测技术相较于当前的临床实验室检测流程具有显著优势。目前可用的技术要么过于昂贵，无法由临床医生个人拥有，要么操作过于复杂，难以由医护人员直接实施。许多检测流程需要由经过培训的技术人员执行繁琐耗时的操作步骤。因此，患者样本（如血液或尿液）通常在医生诊所采集后，需转运至远程的集中式检测实验室进行临床检测，医生往往需要数天时间才能获得检测结果。这种情况在某些病例中可能导致治疗延误或并发症，使检测过程变得极为昂贵且低效（给保险支付方带来经济负担），并进一步导致许多诊断技术在资源匮乏地区和发展中国家中无法获得。
本文介绍了一种磁力悬浮技术，该技术结合了自动成像与分析功能，既可用于集成成像与处理模块的装置（图1），也可用于兼容智能手机的装置（图2）。这些基于磁力悬浮的设备代表了一种广泛适用的平台技术，有望应用于多种不同的医学诊断场景。磁力悬浮方法的工作原理基于两种力之间的平衡：磁力与浮力1,2,3。当颗粒悬浮于顺磁性介质中，并置于两个同极相对的磁体所产生的磁场内时，颗粒会受到指向两磁体中心线方向的磁力作用。浮力则由颗粒相对于悬浮介质的密度差异引起：若颗粒密度小于介质，浮力方向向上；若颗粒密度大于介质，浮力方向向下。在这两种力的作用下，颗粒将在磁场中达到一个平衡悬浮位置，使两力相互抵消；该位置与颗粒密度直接相关，密度较大的颗粒悬浮位置较低，而密度较小的颗粒悬浮位置较高。通过成像模块——可以是内置的智能手机摄像头4,5,6，也可以是配备放大镜头的独立光学组件7,8——可观察颗粒的位置。随后，通过智能手机应用程序4,5,6或嵌入式处理单元7,8进行图像处理，以量化颗粒的空间分布，从而获得样本群体的密度分布信息。为了分析更大的样本量（例如每毫升仅含少量目标颗粒的情况），可将流动系统直接集成到装置中，使颗粒在流经成像区域时被悬浮并实时分析（图2）。
<img alt="磁场分析；相机设置、示意图，聚焦于磁场分布、透镜、LED、样品" src="/files/ftp_upload/55012/55012fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：自包含式磁悬浮平台。 (a紧凑型磁悬浮装置，包含磁聚焦模块、成像组件（发光二极管（LED）、光学透镜和相机检测器）以及带显示屏幕的处理单元。b) 样品插入区域横截面上的磁场强度。磁场强度在磁体表面处最大，并在两磁体中心线处趋近于零。c）处于磁场中的颗粒（如细胞）会受到多种力的作用：磁力（Fm) 指向磁体之间的中心线，其大小随颗粒位置而变化；以及一个重力（Fg）其大小取决于颗粒相对于悬浮介质的密度，以及阻力（Fd）抵抗颗粒运动。经 Yenilmez 允许转载， 等8 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55012/55012fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="磁悬浮毛细管装置；用于样品分离分析的示意图与设备图像" src="/files/ftp_upload/55012/55012fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：兼容智能手机的流体辅助磁力悬浮平台 (a-c前方a），侧面（b），以及背部（c磁悬浮装置的视图（d设备的组成部分包括：1）磁悬浮模块，包含永磁体、放大透镜、LED 及光线扩散器，2）智能手机外壳，3）电子元件，包含微控制器、泵驱动器和蓝牙接收器，4）微泵固定座，5）可调节孔径，6）废液管固定座，7）电池固定座，8）样品固定座，9）兼具支架与盖板功能的双用途结构。e) 流路示意图，显示样品在磁场中被泵送的过程。f磁力悬浮模块的横截面示意图，显示颗粒在泵送通过磁场时，会因密度不同而在不同高度处达到平衡；密度较低的颗粒（如颗粒1）的悬浮高度高于密度较高的颗粒（如颗粒2）。经Amin许可转载。 等1 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55012/55012fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
该系统中用于密度分布分析的任何样本，其最低要求包括能够获得浓度大于约 5 µm 且少于约 250 µm 在尺寸上（用于成像和图像处理）以及其与顺磁性溶液（如本研究中使用的钆布醇）混合的兼容性。在疾病诊断方面，适用的应用包括以下情况：(i) 目标细胞在患病状态下与健康对照相比具有固有的密度改变；(ii) 通过添加试剂或采用其他处理方式在较短孵育时间内可诱导细胞发生密度变化；或 (iii) 在单个样本中识别不同类型的细胞，且这些细胞固有地（或 通过 某些处理具有独特的特征密度。
镰状细胞病是一种遗传性疾病，会导致患者红细胞（RBCs）产生一种突变形式的血红蛋白HbS，从而引发间歇性血管阻塞事件和慢性溶血性贫血9。该病通常通过血红蛋白等电聚焦、高效液相色谱（HPLC）分离或血红蛋白电泳进行诊断，这些方法准确性高，但由于无法在即时检测（point-of-care）环境中实施，必须在临床检验实验室中完成。已有研究提出基于溶解度和纸质的镰状细胞病检测方法，但通常需要主观的人工判读，并需进一步的确证检测。本文中，我们采用基于密度的方法来识别镰状红细胞，这类红细胞的密度高于非镰状细胞病个体的红细胞。其机制涉及突变型血红蛋白HbS的聚合，该聚合过程在缺氧条件下导致镰状细胞病红细胞脱水10,11,12,13。
这种基于密度的方法也可用于根据密度差异分离不同类型的细胞：白细胞（WBCs）和红细胞（RBCs）7白细胞通常负责抵御机体感染。白细胞计数可用于量化血液中这些细胞的数量，是一种有用的诊断工具。当白细胞计数高于正常值（通常认为超过每微升11,000个细胞）时 µL) 可能提示感染、免疫系统疾病或白血病。白细胞计数低于正常范围（约每微升3,500个细胞 µL可能由自身免疫性疾病或损伤骨髓的疾病引起。与现有其他技术不同，本文所述方法在识别白细胞时无需依赖红细胞裂解或染色步骤。该基于细胞的检测方法利用了两类细胞固有的独特密度差异进行分离，据此前通过密度梯度离心法测定的结果，白细胞群体的密度低于红细胞群体的密度。1,5,8.
与在偏远地区进行的其他检测方法相比，该检测具有快速的特点，样品制备简单（图3），可在10至15分钟内完成设备内的细胞分离，并通过自动化成像与分析在不到1分钟内完成。因此，该设备能够快速返回结果，有助于更好地指导医疗决策，使治疗能够立即实施，从而缓解身体和心理上的痛苦，并降低因医疗延误而引发并发症的风险。由于样品制备简单，且成像与分析过程自动化，仅需最少的用户操作或解读，该技术可在临床环境中现场实施。此外，该设备采用永磁体进行样品分析，并利用智能手机或简单的电子元件进行成像和图像处理，因此与一些复杂的检测程序相比，设备本身及单次检测的成本均显著降低。

<table><tbody><tr><td>加达维（Gadavist，Bayer）</td><td>杰斐逊医学与影像公司（Jefferson Medical and Imaging）</td><td>2068062</td><td>加达维（Gadavist）含有1M钆布醇（gadobutrol），为钆的螯合物。我们购买了每盒15支的2 ml小瓶装产品。</td></tr><tr><td>方形玻璃毛细管</td><td>Vitrocom</td><td>8270</td><td>长度50 mm已足够</td></tr><tr><td>焦亚硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9000</td><td>化学式：Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>徕卡显微系统冷冻密封管密封剂（Leica Microsystems Critoseal tube sealant）</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269&amp;nbsp;SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（Trypsin-EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>也可使用针对所用细胞类型推荐的其他试剂</td></tr><tr><td>MICROLET 2 可调采血针装置</td><td>沃尔格林（Walgreens）</td><td>246567</td><td>只要按照生物安全规程使用，任何采血针装置均可接受</td></tr><tr><td>Microlet 采血针头</td><td>沃尔格林（Walgreens）</td><td>667474</td><td>必须为一次性使用，不得重复使用</td></tr><tr><td>豪斯亮线相位血细胞计数板（Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer）</td><td>费舍尔科技公司（Fisher Scientific）</td><td>02-671-6</td><td>也可使用任何其他偏好的细胞计数方法</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液（ACK Lysing Buffer）</td><td>赛默飞世尔科技（ThermoFisher）</td><td>A1049201&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

磁悬浮结合便携式成像与分析用于疾病诊断

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

目前，许多临床诊断方法复杂、昂贵、效率低下，且全球大量人群难以获得。由于需要专用设备和经过培训的专业人员，许多诊断检测必须在偏远的中心化临床实验室中进行。磁悬浮是一种简单而强大的技术，可应用于悬浮细胞，当细胞悬浮于顺磁性溶液中并置于磁场中时，其位置由磁力与浮力之间的平衡决定。本文介绍了一种用于即时检测（point-of-care diagnostics）的多功能平台技术，该技术结合磁悬浮、显微成像和自动分析，用于测定患者细胞的密度分布，作为一项有价值的诊断指标。我们展示了基于该原理的两种平台：（i）一种与智能手机兼容的版本，利用智能手机内置摄像头对磁场中的细胞进行成像，并通过智能手机应用程序处理图像，测量细胞的密度分布；（ii）一种自包含式版本，采用摄像头模组采集图像，并通过嵌入式处理单元及配套的薄膜晶体管（TFT）屏幕完成测量并显示结果。已验证的应用包括：（i）测量具有疾病表型的细胞群体与健康表型相比的分布变化，该方法已应用于镰状细胞病的诊断；（ii）基于细胞特征性密度差异实现不同类型细胞的分离，该方法已用于将白细胞与红细胞分离，以进行白细胞细胞计数。此类应用以及该便携式、用户友好型平台技术所支持的未来扩展性密度测量，将显著提升即时检测环境下的疾病诊断能力。

对于用于镰状细胞病诊断的细胞密度分布分析，其目的是确定细胞群体分布宽度。无镰状细胞病患者的血细胞将局限于可预测的分布宽度内，而镰状细胞病患者的细胞则分布在更宽的范围内，且细胞分布呈负偏态（见图4）。针对特定应用，可在对照样本与健康样本的分布宽度之间设定阈值，作为区分“健康”与“疾病阳性”的 cutoff 值5,8。
<img alt="正常红细胞与镰状红细胞；显微镜图像；细胞形变分析；200μm比例尺。" src="/files/ftp_upload/55012/55012fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 利用磁力悬浮分析血液样本中密度分布以评估镰状细胞病...

我们介绍了一种磁力悬浮技术，该技术结合了自动化成像与分析功能，既可用于兼容智能手机的设备，也可用于嵌入成像与处理模块的设备。该方法可用于测量细胞的密度分布，并展示了两项生物医学应用：镰状细胞病的诊断，以及白细胞与红细胞的分离。

目前，许多临床诊断程序复杂、昂贵、效率低下，且全球大量人群无法获得。这些程序需要……

该方法的总体目标是通过测量细胞群体分布的变化或基于细胞特征密度分离不同类型的细胞，从而实现基于密度的细胞分析，用于多种医学诊断应用。该技术有助于解决生物医学工程中的一个关键挑战，即在临床环境或发展中国家开展重要的细胞学医学诊断。该技术的主要优势在于不需要大量设备和复杂准备，几乎任何人都可操作。该技术的应用前景涉及镰状细胞病的诊断，因为该装置能够量化镰状细胞在低氧条件下导致的密度增加和悬浮速率降低。尽管本方法在此展示的医学诊断测试中具有实用性，但通过更换样本并修改软件，也可将其应用于其他基于密度的细胞计数检测。首先，配制 10 毫升浓度为 50 毫摩尔的钆布醇与汉克斯平衡盐溶液的混合溶液。然后加入焦亚硫酸钠，使钆溶液中的终浓度达到10毫摩尔/升。取100微升钆-焦亚硫酸钠储备液置于微量离心管中。通过标准静脉穿刺技术或指尖采血法获取血液样本。采集指尖血样本时，在穿刺部位附近施加压力，但不要挤压组织。用擦拭物至少清洁穿刺部位三次，然后使用微量移液器收集血液样本。取最多一微升（1 µL）血液样本与试管中的亚硫酸氢钠钆溶液混合，以获得用于镰状细胞病诊断的样本。首先，配制 25 毫摩尔和 250 毫摩尔的钆布醇溶液以及 Hanks 平衡盐溶液。然后，采用先前描述的指尖采血或静脉穿刺技术获取血液样本。取约一微升血液样本，用 25 毫摩尔的钆布醇溶液稀释 1000 倍，以获得用于白细胞流式细胞术的样本。为单独测定白细胞的悬浮范围，另取一份样品，将5微升血液样本加入500微升红细胞裂解缓冲液中。在室温下孵育混合物3至5分钟。然后，将1份250毫摩尔的钆溶液与9份裂解液混合，配制得到含25毫摩尔钆浓度的裂解液样品溶液。开始样品分析时，打开设备并将其放置在水平表面上。将样品吸入方形玻璃毛细管中。当毛细管半满后，用毛细管封口剂密封管端。将毛细管插入设备的磁力悬浮模块中，使管子仅露出一厘米。让样本在设备中静置10分钟，以达到平衡。然后，检查目标细胞是否在屏幕上可见。按下单次测量按钮以保存图像。自动记录屏幕上显示的分析结果。如果设备提示屏幕上细胞过多或过少，请轻微将毛细管向内或向外移动，并将样本再平衡10分钟。保存第一张图像后，将毛细管向内或向外移动约0.5厘米。待样品平衡后，再获取另一张图像用于分析。应从样品的不同位置至少获取五张图像的数据，以避免误差。将图像保存至设备或U盘中。完成后，从设备中取出样本并妥善处理。首先，将智能手机安装到磁力悬浮装置中。确保智能手机摄像头与磁悬浮模块对齐。将智能手机垂直固定在水平桌面上的支架上。将毛细管插入悬浮模块中，并将微泵管路连接到毛细管两端。将样品瓶放入样品架中。然后，启动智能手机应用程序。打开微泵，并在第一个屏幕上设置流速和LED亮度参数。当样本流动平稳后，向左滑动进入图像采集模式。至少采集五个不同的视频。然后，在应用程序的分析部分，选择流动辅助分析，并打开每个待分析的文件。在磁悬浮作用下，无镰状细胞病患者的血细胞被限制在可预测的宽度范围内。而镰状细胞病患者的细胞则分布在更宽且呈向下趋势的区域。这在限制宽度的分析结果中得以体现。健康对照细胞呈现为一条狭窄的条带，而镰状细胞则表现为更宽的条带，整体宽度的变异程度明显更大。通过该方法也可区分具有不同密度范围的单个细胞类型，且在低浓度钆时可实现最佳分离效果。此处，白细胞的悬浮高度是通过分析经裂解去除红细胞后的样品确定的。该已知的悬浮高度用于白细胞计数。要计算经1:1000稀释的每微升样品中的白细胞数量，需将图像中观察到的细胞数乘以2000。一旦掌握，若操作得当，该技术仅需10分钟即可完成。通过此方法，其他研究人员可利用该策略开发针对多种疾病的医学诊断检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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