Name: 在从幼稚的CD4 + T细胞的人CD4 + FOXP3 +诱导调节性T细胞（iTregs的）使用含有TGF-β-协议的体外分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习从人幼稚CD4+T细胞体外诱导FOXP3阳性调节性T细胞的方法，并分析其表型特征。该技术可重复生成iTregs，有助于研究T细胞分化的分子机制，适用于免疫学和细胞生物学领域。

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感谢 Nina Nagel 在视频拍摄和实验准备过程中提供的技术支持。感谢 Eva-Maria Weiss 在细胞内 FOXP3 染色实验方案方面提供的帮助，感谢 Elisabeth Suri-Payer 和 Nina Oberle 建立了天然调节性 T 细胞（nTreg）分离方案。感谢 Matilda Eriksson 和 Peri Noori 在实验室管理方面的工作。
基金支持：A.S. 获得了第七框架计划（7th European Community Framework Programme）内的玛丽·居里欧洲内部奖学金、Åke Olsson 博士基金会以及KI研究基金会的支持；A.S. 和 J.T. 获得了炎症与心血管疾病卓越研究中心（CERIC）项目的资助；J.T. 获得了瑞典科研理事会医学与健康部（Vetenskapsrådet Medicine and Health，项目编号 2011-3264）、托尔斯滕·瑟德贝里基金会、FP7 STATegra 项目、AFA 保险以及斯德哥尔摩县议会的支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

所述方案可实现从人初始CD4+ T细胞高效诱导生成人CD4+FOXP3+ 诱导性调节性T细胞（iTregs）+ T细胞。该方法包含我们近期描述的一种新方案，即使用TGF-β、ATRA和雷帕霉素联合处理，以诱导产生功能更优的iTreg细胞 体外 抑制功能22与其他已发表的方案相比，另一优势在于可并行使用不同方案诱导出不同的诱导性调节性T细胞（iTreg）亚群，从而能够直接比较特定iTreg诱导因子的作用效果，同时设置仅在IL-2存在下激活的对照细胞。所述方案可实现FOXP3的可重复诱导，且供体间变异较小。初始CD4+ 本方案中T细胞通过磁激活细胞分选法分离，但也可采用荧光激活细胞分选法。初始CD4的预期产量+ 采用本方案时，T细胞的比例通常在5-10%之间，但该值高度依赖于供体（年龄），且当红细胞比例较高时，T细胞比例似乎会更低。若需估算，可在单核细胞耗竭步骤期间对PBMCs进行染色（见步骤1.4）。通常情况下，初始型CD4+ T细胞约占一半 &#34;初始CD4百分比+ 淋巴细胞门中的T细...

CD4+CD25+FOXP3+ 调节性T细胞（Tregs）能够抑制其他免疫细胞，是外周免疫耐受的关键介导者，可防止自身免疫和过度炎症反应1。Tregs的重要性体现在人类疾病——免疫失调多内分泌病肠病X连锁综合征（IPEX）中，该病由于调控Treg发育的“主控”转录因子叉头框P3（forkhead box P3, FOXP3）发生突变，导致Tregs缺失，从而引发严重的全身性自身免疫病，并在幼年即致死。然而，Tregs在免疫系统中具有双重作用，在某些情况下也可能削弱抗肿瘤免疫2。因此，对Treg数量和功能的治疗性调控正成为多项临床研究的焦点。在癌症治疗中，清除Tregs可能是有益的，已有部分临床策略取得成功，推动了进一步研究3。在自身免疫性和炎症性疾病中，除了Tregs在多种小鼠疾病模型中展现出的治疗效果外，近期开展的首批人体试验也显示出非常有希望的结果：包括采用过继性Treg输注预防移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GvHD）4-7，以及评估其在治疗1型糖尿病中的安全性8。
天然存在的调节性T细胞（nTregs）包括胸腺来源的tTregs和外周诱导产生的pTregs，在维持机体健康中具有非冗余的重要功能9-11然而，天然调节性T细胞（nTreg）的数量有限，因此促使人们采用诱导生成调节性T细胞（iTregs）的补充策略。 体外 来自初始T细胞前体12iTregs 的稳定性仍然不足，可能是由于 FOXP3 基因位点中所谓的调节性 T 细胞特异性去甲基化区（TSDR）缺乏去甲基化所致13，仍然是一个令人担忧的问题，且多项研究表明 体内 诱导型Treg细胞更稳定14.
迄今为止，FOXP3 仍是调节性 T 细胞（Tregs）最理想的蛋白标志物，但其并非绝对特异，因为人传统的 CD4+CD25- T 细胞在活化后可短暂表达中等水平的 FOXP315,16尽管在阐明FOXP3表达调控机制方面已取得显著进展，但关于FOXP3的诱导、稳定性及其功能，特别是在人类细胞中的相关机制，仍有许多未知有待探索。尽管与nTregs存在差异， 体外 诱导的 FOXP3+ CD4+ T细胞可作为研究FOXP3诱导分子机制的模型系统，并为未来开发生成更接近天然调节性T细胞的诱导性调节性T细胞（iTregs）的实验方案提供起点 体内 诱导生成的调节性T细胞，未来可能适用于过继性转移治疗策略。
目前尚无诱导人源iTreg的“金标准”方案，现有方案均基于模拟Treg诱导条件而开发 体内：白细胞介素2（IL-2）和转化生长因子β（TGF-β）信号通路对FOXP3的诱导至关重要 体内17，以及全反式维甲酸（ATRA）——由其产生 体内 由肠道相关树突状细胞介导的方法常被用于增强FOXP3的诱导 体外18-21我们已开发出使用丁酸盐的其他人类Treg诱导方案22一种由肠道微生物群产生的短链脂肪酸，最近被发现可增强小鼠调节性T细胞（Treg）的诱导23,24我们最近还建立了一种新的诱导性调节性T细胞（iTreg）制备方案，可获得功能更强的抑制性iTreg 体外 通过联合使用 TGF-β、ATRA 和雷帕霉素22后者是一种经临床批准的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂，已知可在人调节性T细胞扩增过程中促进FOXP3的维持25,26.
该方法描述了可重复的 体外 通过不同条件诱导生成人CD4+FOXP3+诱导性调节性T细胞（iTregs），并利用流式细胞术和定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）对其进行后续表型分析，以揭示不同实验方案下FOXP3及其他调节性T细胞特征分子（如CD25、CTLA-4、EOS）的表达模式，以及IFN-γ和SATB1的抑制情况 表达22所产生的细胞群体可用于功能性检测，以评估其抑制活性，或用于分子研究，包括针对FOXP3通用调控因子的研究，或特定化合物（如丁酸盐或雷帕霉素）作用效应的分析。深入理解驱动Treg分化的分子机制，对于未来在自身免疫疾病或癌症治疗中，精准靶向参与Treg生成与功能的关键分子具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>全反式维甲酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗人 Foxp3-APC 克隆 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD25 磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD28 抗体，LEAF 纯化&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3 抗体，LEAF 纯化&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45RA，FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45RO PE 克隆 UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD4-PerCP 克隆 SK3；mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD8-eFluor 450（克隆 OKT8），mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CTLA-4（CD152），克隆 BNI3，mIgG2ak， Brilliant violet 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>抗人 IFN-γ FITC 克隆 4S.B3；mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>含布雷菲德菌素 A 的溶液：GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 合成试剂盒：SuperScript VILO（逆转录酶）cDNA 合成试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度离心介质：Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS，热灭活</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活力染料，eFluor 780&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 或 65-0865-18&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 染色缓冲液套装</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>注意：含甲醛。也可与抗体组合购买试剂盒；77-5774-40 抗人 Foxp3 染色套装 APC 克隆：236A/E7 套装</td></tr><tr><td>GlutaMAX（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>人初始 CD4 T 细胞分离试剂盒 II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>来自链球菌（Streptomyces conglobatus）的离子霉素 &gt;98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 K 同型对照 APC 克隆：P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 K 同型对照 FITC 50 &amp;#956;g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a 同型对照，Brilliant violet 421，克隆 MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管，塑料，独立包装</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA 佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-2，CF</td><td>R&amp;D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TGF-β1，CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA 提取试剂盒：RNAqueous-Micro 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1931&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T 细胞培养基：X-Vivo 15 培养基，含庆大霉素和酚红</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测，FOXP3（最佳覆盖）&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182；检测 ID：Hs01085834_m1</td><td>注意：含甲醛</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测，RPL13A（最佳覆盖）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370；检测 ID：Hs04194366_g1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>注意：含甲醛</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

体外利用含tgf-β方案由初始cd4+ t细胞诱导人cd4+foxp3+调节性t细胞（itregs）的分化

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

调节性T细胞（Tregs）是外周免疫耐受的重要组成部分，能够抑制针对自身结构的免疫反应，从而预防自身免疫性疾病。目前正在进行通过过继性转移Tregs治疗疾病，或在癌症中耗竭Tregs的临床研究，初步结果令人鼓舞。
由于天然调节性T细胞（nTregs）的数量非常有限，利用天然调节性T细胞研究某些调节性T细胞特征存在困难 体外 诱导性调节性T细胞（iTregs）具有重要优势。迄今为止，尽管并非绝对特异，但最常用于界定调节性T细胞（Tregs）的蛋白标志物是转录因子FOXP3。尽管Tregs具有重要作用，包括外周诱导性Tregs的非冗余功能，但目前生成iTregs的实验方案仍存在争议，尤其是在人类细胞中。因此，本方案描述了 体外 利用多种调节性T细胞诱导因子（仅TGF-β加IL-2，或其与视黄酸、雷帕霉素或丁酸盐的组合）平行诱导人初始T细胞分化为CD4+FOXP3+诱导性调节性T细胞。同时描述了通过流式细胞术和定量反转录PCR对这些细胞进行表型分析的方法。 
这些方案可实现FOXP3及其他调节性T细胞特征基因的可重复表达，有助于研究FOXP3的一般调控机制以及特定方案的影响，从而明确某些因素的作用。诱导型调节性T细胞（iTregs）可用于研究调节性T细胞诱导过程中的多种表型特征及分子机制。由于能够获得相对大量的细胞，因此有利于开展深入的分子水平研究。
iTreg细胞在应用上的一个局限性在于，与nTreg细胞相比，其FOXP3的表达相对不稳定。通过本方案生成的iTreg细胞也可用于功能检测，例如研究其抑制功能，其中由TGF-β联合视黄酸和雷帕霉素诱导产生的iTreg细胞表现出更强的抑制活性。然而，iTreg细胞的抑制能力可能与nTreg细胞存在差异，因此使用适当的对照至关重要。

图1展示了实验装置的示意图。图2展示了通过磁珠分离获得的初始型CD4+ T细胞和自然调节性T细胞（nTregs）的代表性纯度检测染色结果。
F图3A 显示流式细胞术设门策略及 图3B 显示在指定的iTreg或对照条件下培养第6天时FOXP3和CD25的代表性流式细胞术染色结果。在 体外 刺激后，大多数细胞会上调CD25，而在雷帕霉素存在时，CD25表达降低。只有在添加iTreg诱导因子的情况下，才会出现明显的FOXP3+细胞群体，且该群体在CD25+细胞中富集。+ 在iTreg条件下培养的细胞 图3C 在显微镜下显示iTreg培养物的表型特征，增殖的细胞呈现为深色的细胞簇。每种iTreg培养条件均表现出特异且可重复的细胞增殖...

本方案描述了从初始CD4+ T细胞可重复地诱导生成人源诱导性调节性T细胞（iTregs）并进行表型分析的方法+ T细胞 体外不同的FOXP3诱导方案可用于研究各自方案所获得的特定iTreg表型。

体外利用含TGF-β方案由初始CD4+ T细胞诱导人CD4+FOXP3+调节性T细胞（iTregs）的分化

调节性T细胞（Tregs）是外周免疫耐受的重要组成部分，通过抑制针对自身结构的免疫反应，从而防止……

本实验的总体目标是体外诱导初始CD4 T细胞分化为人类FOXP3阳性调节性T细胞，并分析其表型。该方法有助于解答T细胞免疫学领域中的关键问题，例如调节性T细胞在分子水平上的分化机制是什么？该技术的主要优势在于能够可重复地生成并进行人类FOXP3阳性调节性T细胞的表型分析。尽管该方法可为调节性T细胞的分化研究提供见解，但也可加以改进以研究其他CD4 T细胞亚群及其他感兴趣的免疫细胞。该方法的可视化演示至关重要，因为外周血单个核细胞（PBMC）及磁珠分离步骤通过展示比文字描述更易于理解。分离外周血T细胞时，首先在每份血沉棕黄层对应的五个50毫升离心管中各加入15毫升室温密度梯度介质，并用室温PBS将每份血沉棕黄层的终体积调至180毫升。接下来，将一管密度梯度液倾斜，缓慢地将约35毫升稀释血液沿管壁加入，覆盖在密度梯度液上层，注意避免溶液混合。通过离心分离细胞。然后，将每根离心管中位于密度梯度液与血浆层之间的白色PBMC层转移至新的50毫升锥形管中。用 200 毫升新鲜 PBS 洗涤 PBMC，并将沉淀重悬于完全培养基中，通过塑料贴壁法去除外周血单核细胞。收集悬浮细胞后，用最多 50 毫升新鲜 PBS 洗涤 PBMC 三次，将最终沉淀重悬于 40 微升 4°C 分离缓冲液中，并按每 1×10⁷ 个细胞加入 10 微升 naive CD4 阳性 T 细胞生物素抗体混合液，充分混匀。在 4°C 下孵育 10 分钟，然后用 40 毫升 4°C PBS 洗涤细胞，并将沉淀重悬于 80 微升分离缓冲液和 20 微升抗生物素微珠中（每 1×10⁷ 个细胞），在 4°C 下继续孵育 15 分钟。在细胞孵育的同时，将LS柱置于磁铁上，并用3毫升分离缓冲液进行平衡，然后用50毫升PBS洗涤细胞，再将沉淀重悬于3毫升新鲜分离缓冲液中。随后将细胞加入柱中，收集含有初始CD4阳性T细胞的穿流液至15毫升离心管中。当柱子停止滴液后，用2毫升分离缓冲液冲洗离心管，并将洗涤液转移至柱中。最后一次洗涤后，通过离心收集磁珠分选的T细胞，随后用15毫升培养基洗涤两次，获得纯度大于94%的初始CD4阳性T细胞群体。为诱导调节性T细胞，向已包被抗CD3抗体的96孔板的相应孔中加入50微升适当刺激物。然后向空孔（包括边缘孔）加入200微升PBS，并将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下预热。将静息性初始T细胞的浓度调整为每毫升2.2至2.6 × 10⁶个细胞的密度，使用37°C的培养基，每孔加入50 µL细胞悬液。所有细胞接种完成后，用铝箔纸包裹培养板以避光，并将培养板放回细胞培养箱中。2至3天后，通过光学显微镜应可观察到增殖细胞形成的小细胞簇，并在后续时间点逐渐发展为更大的细胞簇。培养四到六天后，培养基颜色由微橙色变为黄褐色，聚集成团的细胞团块肉眼可见。为检测细胞表面标志物表达，用移液器将每个孔中的细胞重悬，并转移至新的96孔U型底板中，每个孔周围需留出一个空孔，以防止静置过程中发生溢出污染。待所有细胞转移完毕后，离心培养板并弃去上清液。将培养板倒置在吸水纸上，轻拍一次，然后立即翻转至正面朝上。涡旋振荡以重悬残留液体中的细胞。随后向每孔加入25 µL表面站立预混液，并在4 °C避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，用200微升PBS洗涤孔板两次，每次均去除上清液，并在每次洗涤后重新悬浮细胞，操作方法如前所述。随后进行细胞活力检测以及FOXP3和其他目标标志物的胞内染色。在这些图中，展示了针对CD25阳性CD4阳性FOXP3阳性调节性T细胞的流式细胞术设门策略。体外刺激后，大多数细胞会上调 CD25，而在雷帕霉素存在的情况下，CD25 的表达减少。只有在添加可诱导性 Treg 因子后，才会出现明显的 FOXP3 阳性细胞群体，其细胞内蛋白表达水平与天然存在的 Treg 细胞相当。事实上，每种诱导的 Treg 条件均表现出特定且可重复的细胞增殖模式。在TGF-β诱导细胞增殖略有增加，全反式维甲酸显著增强T细胞增殖的同时，向培养体系中添加雷帕霉素则明显减小细胞簇的大小。诱导型Treg细胞的qRT-PCR分析表明，与对照组刺激的细胞相比，所有诱导型Treg细胞培养体系中的FOXP3 mRNA表达水平均更高，其中经雷帕霉素处理的诱导型Treg细胞表现出诱导型Treg培养物中最低的FOXP3 mRNA水平。此外，天然存在的Treg细胞中FOXP3 mRNA的表达水平高于所有可诱导的调节性T细胞群体。该技术为T细胞免疫学领域的研究人员探索健康供体或自身免疫性疾病及癌症患者中调节性T细胞（Treg）生成与功能的分子机制提供了途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离人源初始CD4阳性T细胞，以及如何将所得NUs分化并表型鉴定为调节性T细胞。请注意，操作人血或对苯二甲醛可能具有极高危险性。因此，在进行这些操作时，应考虑采取诸如预处理、完成所有疫苗接种、穿戴防护服以及正确处理废弃物等预防措施。

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科研

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