Name: 在从幼稚的CD4 + T细胞的人CD4 + FOXP3 +诱导调节性T细胞（iTregs的）使用含有TGF-β-协议的体外分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习从人幼稚CD4+T细胞体外诱导FOXP3阳性调节性T细胞的方法，并分析其表型特征。该技术可重复生成iTregs，有助于研究T细胞分化的分子机制，适用于免疫学和细胞生物学领域。

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感谢 Nina Nagel 在视频拍摄和实验准备过程中提供的技术支持。感谢 Eva-Maria Weiss 在细胞内 FOXP3 染色实验方案方面提供的帮助，感谢 Elisabeth Suri-Payer 和 Nina Oberle 建立了天然调节性 T 细胞（nTreg）分离方案。感谢 Matilda Eriksson 和 Peri Noori 在实验室管理方面的工作。
基金支持：A.S. 获得了第七框架计划（7th European Community Framework Programme）内的玛丽·居里欧洲内部奖学金、Åke Olsson 博士基金会以及KI研究基金会的支持；A.S. 和 J.T. 获得了炎症与心血管疾病卓越研究中心（CERIC）项目的资助；J.T. 获得了瑞典科研理事会医学与健康部（Vetenskapsrådet Medicine and Health，项目编号 2011-3264）、托尔斯滕·瑟德贝里基金会、FP7 STATegra 项目、AFA 保险以及斯德哥尔摩县议会的支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

所述方案可实现从人初始CD4+ T细胞高效诱导生成人CD4+FOXP3+ 诱导性调节性T细胞（iTregs）+ T细胞。该方法包含我们近期描述的一种新方案，即使用TGF-β、ATRA和雷帕霉素联合处理，以诱导产生功能更优的iTreg细胞 体外 抑制功能22与其他已发表的方案相比，另一优势在于可并行使用不同方案诱导出不同的诱导性调节性T细胞（iTreg）亚群，从而能够直接比较特定iTreg诱导因子的作用效果，同时设置仅在IL-2存在下激活的对照细胞。所述方案可实现FOXP3的可重复诱导，且供体间变异较小。初始CD4+ 本方案中T细胞通过磁激活细胞分选法分离，但也可采用荧光激活细胞分选法。初始CD4的预期产量+ 采用本方案时，T细胞的比例通常在5-10%之间，但该值高度依赖于供体（年龄），且当红细胞比例较高时，T细胞比例似乎会更低。若需估算，可在单核细胞耗竭步骤期间对PBMCs进行染色（见步骤1.4）。通常情况下，初始型CD4+ T细胞约占一半 &#34;初始CD4百分比+ 淋巴细胞门中的T细...

CD4+CD25+FOXP3+ 调节性T细胞（Tregs）能够抑制其他免疫细胞，是外周免疫耐受的关键介导者，可防止自身免疫和过度炎症反应1。Tregs的重要性体现在人类疾病——免疫失调多内分泌病肠病X连锁综合征（IPEX）中，该病由于调控Treg发育的“主控”转录因子叉头框P3（forkhead box P3, FOXP3）发生突变，导致Tregs缺失，从而引发严重的全身性自身免疫病，并在幼年即致死。然而，Tregs在免疫系统中具有双重作用，在某些情况下也可能削弱抗肿瘤免疫2。因此，对Treg数量和功能的治疗性调控正成为多项临床研究的焦点。在癌症治疗中，清除Tregs可能是有益的，已有部分临床策略取得成功，推动了进一步研究3。在自身免疫性和炎症性疾病中，除了Tregs在多种小鼠疾病模型中展现出的治疗效果外，近期开展的首批人体试验也显示出非常有希望的结果：包括采用过继性Treg输注预防移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GvHD）4-7，以及评估其在治疗1型糖尿病中的安全性8。
天然存在的调节性T细胞（nTregs）包括胸腺来源的tTregs和外周诱导产生的pTregs，在维持机体健康中具有非冗余的重要功能9-11然而，天然调节性T细胞（nTreg）的数量有限，因此促使人们采用诱导生成调节性T细胞（iTregs）的补充策略。 体外 来自初始T细胞前体12iTregs 的稳定性仍然不足，可能是由于 FOXP3 基因位点中所谓的调节性 T 细胞特异性去甲基化区（TSDR）缺乏去甲基化所致13，仍然是一个令人担忧的问题，且多项研究表明 体内 诱导型Treg细胞更稳定14.
迄今为止，FOXP3 仍是调节性 T 细胞（Tregs）最理想的蛋白标志物，但其并非绝对特异，因为人传统的 CD4+CD25- T 细胞在活化后可短暂表达中等水平的 FOXP315,16尽管在阐明FOXP3表达调控机制方面已取得显著进展，但关于FOXP3的诱导、稳定性及其功能，特别是在人类细胞中的相关机制，仍有许多未知有待探索。尽管与nTregs存在差异， 体外 诱导的 FOXP3+ CD4+ T细胞可作为研究FOXP3诱导分子机制的模型系统，并为未来开发生成更接近天然调节性T细胞的诱导性调节性T细胞（iTregs）的实验方案提供起点 体内 诱导生成的调节性T细胞，未来可能适用于过继性转移治疗策略。
目前尚无诱导人源iTreg的“金标准”方案，现有方案均基于模拟Treg诱导条件而开发 体内：白细胞介素2（IL-2）和转化生长因子β（TGF-β）信号通路对FOXP3的诱导至关重要 体内17，以及全反式维甲酸（ATRA）——由其产生 体内 由肠道相关树突状细胞介导的方法常被用于增强FOXP3的诱导 体外18-21我们已开发出使用丁酸盐的其他人类Treg诱导方案22一种由肠道微生物群产生的短链脂肪酸，最近被发现可增强小鼠调节性T细胞（Treg）的诱导23,24我们最近还建立了一种新的诱导性调节性T细胞（iTreg）制备方案，可获得功能更强的抑制性iTreg 体外 通过联合使用 TGF-β、ATRA 和雷帕霉素22后者是一种经临床批准的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂，已知可在人调节性T细胞扩增过程中促进FOXP3的维持25,26.
该方法描述了可重复的 体外 通过不同条件诱导生成人CD4+FOXP3+诱导性调节性T细胞（iTregs），并利用流式细胞术和定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）对其进行后续表型分析，以揭示不同实验方案下FOXP3及其他调节性T细胞特征分子（如CD25、CTLA-4、EOS）的表达模式，以及IFN-γ和SATB1的抑制情况 表达22所产生的细胞群体可用于功能性检测，以评估其抑制活性，或用于分子研究，包括针对FOXP3通用调控因子的研究，或特定化合物（如丁酸盐或雷帕霉素）作用效应的分析。深入理解驱动Treg分化的分子机制，对于未来在自身免疫疾病或癌症治疗中，精准靶向参与Treg生成与功能的关键分子具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>全反式维甲酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗人 Foxp3-APC 克隆 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD25 磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD28 抗体，LEAF 纯化&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3 抗体，LEAF 纯化&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45RA，FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45RO PE 克隆 UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD4-PerCP 克隆 SK3；mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD8-eFluor 450（克隆 OKT8），mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CTLA-4（CD152），克隆 BNI3，mIgG2ak， Brilliant violet 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>抗人 IFN-γ FITC 克隆 4S.B3；mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>含布雷菲德菌素 A 的溶液：GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 合成试剂盒：SuperScript VILO（逆转录酶）cDNA 合成试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度离心介质：Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99.7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS，热灭活</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活力染料，eFluor 780&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 或 65-0865-18&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 染色缓冲液套装</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>注意：含甲醛。也可与抗体组合购买试剂盒；77-5774-40 抗人 Foxp3 染色套装 APC 克隆：236A/E7 套装</td></tr><tr><td>GlutaMAX（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>人初始 CD4 T 细胞分离试剂盒 II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>来自链球菌（Streptomyces conglobatus）的离子霉素 &gt;98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 K 同型对照 APC 克隆：P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 K 同型对照 FITC 50 &amp;#956;g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a 同型对照，Brilliant violet 421，克隆 MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管，塑料，独立包装</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA 佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-2，CF</td><td>R&amp;D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TGF-β1，CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA 提取试剂盒：RNAqueous-Micro 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1931&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T 细胞培养基：X-Vivo 15 培养基，含庆大霉素和酚红</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测，FOXP3（最佳覆盖）&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182；检测 ID：Hs01085834_m1</td><td>注意：含甲醛</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测，RPL13A（最佳覆盖）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370；检测 ID：Hs04194366_g1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>注意：含甲醛</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

体外利用含tgf-β方案由初始cd4+ t细胞诱导人cd4+foxp3+调节性t细胞（itregs）的分化

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

调节性T细胞（Tregs）是外周免疫耐受的重要组成部分，能够抑制针对自身结构的免疫反应，从而预防自身免疫性疾病。目前正在进行通过过继性转移Tregs治疗疾病，或在癌症中耗竭Tregs的临床研究，初步结果令人鼓舞。
由于天然调节性T细胞（nTregs）的数量非常有限，利用天然调节性T细胞研究某些调节性T细胞特征存在困难 体外 诱导性调节性T细胞（iTregs）具有重要优势。迄今为止，尽管并非绝对特异，但最常用于界定调节性T细胞（Tregs）的蛋白标志物是转录因子FOXP3。尽管Tregs具有重要作用，包括外周诱导性Tregs的非冗余功能，但目前生成iTregs的实验方案仍存在争议，尤其是在人类细胞中。因此，本方案描述了 体外 利用多种调节性T细胞诱导因子（仅TGF-β加IL-2，或其与视黄酸、雷帕霉素或丁酸盐的组合）平行诱导人初始T细胞分化为CD4+FOXP3+诱导性调节性T细胞。同时描述了通过流式细胞术和定量反转录PCR对这些细胞进行表型分析的方法。 
这些方案可实现FOXP3及其他调节性T细胞特征基因的可重复表达，有助于研究FOXP3的一般调控机制以及特定方案的影响，从而明确某些因素的作用。诱导型调节性T细胞（iTregs）可用于研究调节性T细胞诱导过程中的多种表型特征及分子机制。由于能够获得相对大量的细胞，因此有利于开展深入的分子水平研究。
iTreg细胞在应用上的一个局限性在于，与nTreg细胞相比，其FOXP3的表达相对不稳定。通过本方案生成的iTreg细胞也可用于功能检测，例如研究其抑制功能，其中由TGF-β联合视黄酸和雷帕霉素诱导产生的iTreg细胞表现出更强的抑制活性。然而，iTreg细胞的抑制能力可能与nTreg细胞存在差异，因此使用适当的对照至关重要。

图1展示了实验装置的示意图。图2展示了磁性分离的初始CD4+ T细胞和nTregs的代表性纯度检测染色结果。
F图3A 展示了流式细胞术的设门策略以及 图3B 显示在指定的iTreg或对照条件下培养第6天时，FOXP3和CD25的代表性流式细胞术染色结果。经 体外 刺激后，大多数细胞会上调CD25，而在雷帕霉素存在下，CD25表达降低。只有在添加iTreg诱导因子的情况下，才会出现明显的FOXP3+细胞群体，且该群体在CD25+细胞中富集。+ 在iTreg条件下培养的细胞 图3C 在显微镜下显示iTreg培养物的表型特征，增殖的细胞表现为深色的细胞簇。每种iTreg培养条件均呈现出特异且可重复的细胞增殖模式：在此培养条件下，...

本方案描述了从初始CD4+ T细胞可重复地诱导生成人源诱导性调节性T细胞（iTregs）并进行表型分析的方法+ T细胞 体外不同的FOXP3诱导方案可用于研究各自方案所获得的特定iTreg表型。

体外利用含TGF-β方案由初始CD4+ T细胞诱导人CD4+FOXP3+调节性T细胞（iTregs）的分化

调节性T细胞（Tregs）是外周免疫耐受的重要组成部分，通过抑制针对自身结构的免疫反应，从而防止……

本实验的总体目标是体外诱导初始CD4 T细胞分化为人类FOXP3阳性调节性T细胞，并分析其表型。该方法有助于解答T细胞免疫学领域中的关键问题，例如调节性T细胞在分子水平上的分化机制是什么？该技术的主要优势在于能够可重复地生成并进行人类FOXP3阳性调节性T细胞的表型分析。尽管该方法可为调节性T细胞的分化研究提供见解，但也可加以改进以研究其他CD4 T细胞亚群及其他感兴趣的免疫细胞。该方法的可视化演示至关重要，因为外周血单个核细胞（PBMC）及磁珠分离步骤通过展示比文字描述更易于理解。分离外周血T细胞时，首先在每份血沉棕黄层对应的五个50毫升离心管中各加入15毫升室温密度梯度介质，并用室温PBS将每份血沉棕黄层的终体积调至180毫升。接下来，将一管密度梯度液倾斜，缓慢地将约35毫升稀释血液沿管壁加入，覆盖在密度梯度液上层，注意避免溶液混合。通过离心分离细胞。然后，将每根离心管中位于密度梯度液与血浆层之间的白色PBMC层转移至新的50毫升锥形管中。用 200 毫升新鲜 PBS 洗涤 PBMC，并将沉淀重悬于完全培养基中，通过塑料贴壁法去除外周血单核细胞。收集悬浮细胞后，用最多 50 毫升新鲜 PBS 洗涤 PBMC 三次，将最终沉淀重悬于 40 微升 4°C 分离缓冲液中，并按每 1×10⁷ 个细胞加入 10 微升 naive CD4 阳性 T 细胞生物素抗体混合液，充分混匀。在 4°C 下孵育 10 分钟，然后用 40 毫升 4°C PBS 洗涤细胞，并将沉淀重悬于 80 微升分离缓冲液和 20 微升抗生物素微珠中（每 1×10⁷ 个细胞），在 4°C 下继续孵育 15 分钟。在细胞孵育的同时，将LS柱置于磁铁上，并用3毫升分离缓冲液进行平衡，然后用50毫升PBS洗涤细胞，再将沉淀重悬于3毫升新鲜分离缓冲液中。随后将细胞加入柱中，收集含有初始CD4阳性T细胞的穿流液至15毫升离心管中。当柱子停止滴液后，用2毫升分离缓冲液冲洗离心管，并将洗涤液转移至柱中。最后一次洗涤后，通过离心收集磁珠分选的T细胞，随后用15毫升培养基洗涤两次，获得纯度大于94%的初始CD4阳性T细胞群体。为诱导调节性T细胞，向已包被抗CD3抗体的96孔板的相应孔中加入50微升适当刺激物。然后向空孔（包括边缘孔）加入200微升PBS，并将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下预热。将静息性初始T细胞的浓度调整为每毫升2.2至2.6 × 10⁶个细胞的密度，使用37°C的培养基，每孔加入50 µL细胞悬液。所有细胞接种完成后，用铝箔纸包裹培养板以避光，并将培养板放回细胞培养箱中。2至3天后，通过光学显微镜应可观察到增殖细胞形成的小细胞簇，并在后续时间点逐渐发展为更大的细胞簇。培养四到六天后，培养基颜色由微橙色变为黄褐色，聚集成团的细胞团块肉眼可见。为检测细胞表面标志物表达，用移液器将每个孔中的

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在从幼稚的CD4 + T细胞的人CD4 + FOXP3 +诱导调节性T细胞（iTregs的）使用含有TGF-β-协议的体外分化

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外...

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学习从人幼稚CD4+T细胞体外诱导FOXP3阳性调节性T细胞的方法，并分析其表型特征。该技术可重复生成iTregs，有助于研究T细胞分化的分子机制，适用于免疫学和细胞生物学领域。

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