ChIP-exo 方法：以接近碱基对精度鉴定蛋白质-DNA 相互作用

该功能基因组学技术的总体目标是鉴定特定蛋白质在活细胞中占据的精确基因组位置。该方法有助于回答基因调控和表观遗传学领域的一些关键问题，例如转录机制如何在染色质环境中组装并发挥作用。该技术的主要优势在于，它能够以接近单碱基分辨率的精度揭示蛋白质与DNA相互作用的精确基因组位置，且背景信号极低。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该实验步骤较为复杂，且全程需要细致操作。进行核裂解物超声处理时，首先将树脂适配器放入含有核提取物的15毫升聚苯乙烯管中。将裂解物置于冰水浴中，以中等功率超声处理，每次开启30秒，关闭30秒，共进行两次，每次15分钟。

为检测超声处理结果，从每个离心管中转移两份10微升样品至1.5毫升离心管中。然后，将第一份10微升样品与10微升TE-RNase A溶液及0.2微升蛋白酶K混合，以逆转交联。将离心管在37摄氏度孵育30分钟。随后加入4微升6X二甲苯DNA染料。

向第二个10微升样品中加入2微升6X二甲苯DNA染料，以保持交联状态。将两个样品在1.5%琼脂糖凝胶中以140伏电压电泳约30至45分钟，直至后者的溴酚蓝染料迁移至凝胶约四分之三处。若超声处理成功，将超声处理后的裂解液转移至含有150微升10% Triton X-100的2毫升离心管中，并涡旋混匀。

将超声处理后的裂解液在4°C条件下以20,000 × g离心10分钟，使不溶性染色质和碎片沉淀。然后将上清液转移至新的2毫升离心管中。样本可无限期保存于-80°C。

每次染色质免疫沉淀（ChIP）反应中，将1.5毫升超声处理后的提取物与抗体-磁珠偶联物加入1.5毫升离心管中混合。将离心管置于迷你旋转仪上，4°C、转速9条件下过夜孵育。数分钟后检查，确保样品无泄漏且充分混匀。

次日，短暂离心收集管盖中的液体，将各管置于磁力架上静置一分钟，随后吸除提取液。向每管中加入 0.75 毫升 RIPA 裂解缓冲液。

然后将离心管从磁力架上取下，倒置数次以混匀。短暂离心后，将离心管放回磁力架，吸除上清液。最后一次洗涤后，向每根离心管中加入 0.75 毫升 10 毫摩尔 Tris HCl。

从磁力架上取下离心管，反复倒置样品数次以混匀。短暂离心后，将离心管放回磁力架，吸走上清液。根据文本方案完成末端修复和接头连接反应后，填写连接反应主混合液的计算表。

然后在冰上将连接反应体系加入一个1.5毫升离心管中，并用移液器吹打混匀。将样品管置于磁力架上后，向每个样品树脂中加入48微升P7连接主混合液和2微升不同的接头索引（adapter index）。将样品在ThermoMixer中于25摄氏度、3 × g 条件下孵育2小时。

根据文本方案洗涤样品并完成 Phy 29 切刻修复和激酶反应后，在冰上用 1.5 毫升离心管配制 λ 核酸外切酶预混液，并填写相应的计算表格。将 50 微升 λ 核酸外切酶预混液加入仍置于磁力架上的每个样品树脂中。然后将样品在 ThermoMixer 中于 37 摄氏度、3 × g 条件下孵育 30 分钟。

按照文本方案中所述吸去最后一次洗涤液后，通过填写RecJf核酸酶主混合物的计算并冰上配制RecJf混合液，进行RecJf核酸酶反应。将50 µL的RecJf混合液加入磁力架上的每份样品树脂中。然后将样品置于ThermoMixer中，在37 °C、3 × g条件下孵育30分钟。

吸尽最后一次洗涤液后，配制ChIP洗脱缓冲液和蛋白酶K主混合液，向每个样品树脂中加入200 µL该溶液。将样品置于ThermoMixer中，65 °C、3 ×g 条件下孵育过夜，并使用加热盖防止冷凝。次日，短暂离心样品，然后将离心管置于磁力架上静置1分钟。

然后将200 µL上清液转移至一个新的含有200 µL TE缓冲液的1.5 mL离心管中。在完成DNA提取、P7初始延伸和ATL反应后，填写P5接头连接反应的主混合液计算表格，并在冰上配制连接主混合液。向每个样品中加入20 µL连接混合液，并用移液器吹打混匀。

然后将样品在25摄氏度的PCR仪中孵育2小时。按照文本方案进行DNA纯化和定量。如图所示，值得投入时间优化超声处理条件，以获得高质量的染色质提取物，从而得到长度在100至500个碱基对之间的DNA片段。

电泳迁移率偏移实验用于验证超声处理后的提取物中含有完整的蛋白质-DNA交联，表现为DNA片段的上移。为评估背景信号，通常会在反应中不加抗体进行模拟ChIP实验。高质量的ChIP-exo文库与ChIP-seq文库制备相比，模拟样本中的背景信号会极低。

图中显示的是对一个 ChIP-exo 文库进行的生物分析仪检测结果。该分析可准确评估文库片段大小分布，并检测在 125 个碱基对处出现的污染性接头二聚体。该图展示了在增殖的 K562 细胞中，RNA 聚合酶 II、TFIIB 和 TBP 在人类 RPS12 基因位点的 ChIP-exo 标签 5' 端 N 碱基经链分离后的平滑分布情况。

本图显示了相对于蛋白质编码基因转录起始位点的平均 ChIP-exo 模式。综合图中 TBP、TFIIB 和聚合酶 II 的主要峰位置反映了人类转录起始复合物的基因组组织结构。一旦掌握，该技术若操作得当，可在四天内完成。

该技术建立后，为基因调控领域的研究人员探索酵母中核内结构不对称性的分子细节提供了途径。在此方法基础上，还可开展其他实验，如RNase封阻表达谱分析，以回答特定因子是否影响邻近基因表达等问题。在进行该实验时，务必仔细填写所有酶促反应步骤的主混合液配制表格。

请务必注意，操作致癌物及其他腐蚀性试剂时可能存在极高危险性，因此在进行本实验步骤时，必须采取佩戴个人防护装备等安全预防措施。观看本视频后，您应能够充分掌握高质量ChIP-exo文库的制备方法。