活体成像研究紫杉烷耐药性乳腺癌中微管动态不稳定性

本实验的总体目标是测量多西他赛耐药性乳腺癌细胞中微管的动态不稳定性。该方法有助于回答细胞生物学领域中关于生理条件下以及不同药物处理后微管动态不稳定性的一些关键问题。该技术的主要优势在于，它提供了一种简单、可靠且符合生理条件的研究活细胞中微管动态的实验方案。

开始实验前，将乳腺癌细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，于含完全培养基的10厘米培养皿中培养至适当的汇合度。实验前一天，用70%乙醇冲洗24毫米多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片，并于紫外灯下照射过夜。次日早晨，将每片盖玻片放入六孔板的各个孔中。

然后用 PBS 清洗细胞培养物，并用 0.5 毫升胰蛋白酶 EDTA 将每块培养皿中的细胞消化脱落。当细胞开始从培养皿底部脱离时，加入 5 毫升新鲜培养基以中和胰蛋白酶，随后对细胞进行计数。然后将约 1 × 10⁵ 个细胞接种到每一张盖玻片上，轻轻摇动培养板，再将细胞放回培养箱中孵育至少 36 小时。

为了检测细胞的微管动态，将GFP标记的α-微管蛋白储备液反复倒置混匀数次，确保形成均一溶液，避免涡旋振荡。随后，将每孔中的培养基更换为含有40 µL标记微管蛋白的2 mL新鲜培养基。轻轻摇动培养板，使标记物与培养基充分混合，然后将培养板放回培养箱中继续孵育24小时。

第二天，将培养基更换为含有多西他赛的新鲜培养基，并将培养板放回培养箱中孵育30分钟。在细胞受到抑制的同时，打开倒置荧光显微镜，并将样品载台预热至37摄氏度。然后选择60X 1.42 NA油镜物镜，将第一片盖玻片安装到样品载台上。

用一毫升新鲜的含多西他赛培养基（37摄氏度）覆盖样品，并找到一群扁平细胞，这些细胞表现出高GFP标记的α-微管蛋白荧光强度，且微管结构清晰可见。聚焦于该细胞群中某个细胞的周边区域，设定图像采集频率的适当曝光时间。在加入第一份多西他赛后的第50分钟整，开始记录微管动态，持续两分钟，每两秒获取一张图像。

当所有图像采集完成后，按照上述方法对下一个细胞进行成像，直至每个多西他赛浓度的三个孔中总共获得五个细胞的图像。当每个抑制剂浓度的所有图像采集完毕后，打开显微镜系统内的去卷积程序，点击“process”。接下来，选择“deconvolve”，并将图像文件拖动到输入窗口中。

单击“do”以去卷积图像，然后在显微镜软件中打开去卷积后的图像文件。单击“file”，选择“save as movie”。将视频格式设置为 AV，动画模式设置为正向播放。

将压缩质量设为100%，帧率设为每秒五帧。然后勾选“随时间动态播放”选项，点击“执行”以生成视频。在此代表性实验中，正常乳腺癌细胞和多西他赛耐药乳腺癌细胞均经多西他赛处理，并按上述方法进行成像，但药物对微管生长与缩短的影响在非多西他赛耐药细胞中更为明显。

事实上，在0.5微摩尔浓度的多西他赛处理条件下，测量微管生长和缩短速率的结果显示，多西他赛显著抑制了亲本细胞的微管蛋白动态，但对多西他赛耐药细胞则无此抑制作用。只要熟练掌握，若操作得当，整个过程可在60小时内完成。在进行该实验时，需注意选择形态扁平且GFP标记的微管蛋白荧光强度较高的细胞，同时应降低激发荧光的强度和曝光时间，以避免GFP荧光发生淬灭。

自开发以来，该技术为细胞生物学和癌症生物学领域的研究人员评估各种微管靶向药物对正常细胞和癌细胞的影响铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在多种条件下测量活细胞中微管的动态不稳定性。