在单壁碳纳米管上利用仿生聚合物构建分子识别系统

本实验的总体目标是制备经过仿生聚合物功能化的近红外荧光单壁碳纳米管，用于分子传感。这些纳米传感器可实现活体组织的时间分辨成像。例如，可用于检测大脑中的多巴胺。

这些传感器的主要优势在于其固有的近红外荧光特性，能够实现对组织更深层的成像。合成传感器可检测那些缺乏天然分子识别元件的分子，因此这种通用的传感器开发方法在小分子检测中尤为有用。制备SWNTs的核酸悬浮液时，首先将核酸溶解于0.1摩尔氯化钠溶液中，使其浓度达到100毫克/毫升。

在通风橱中，使用防静电枪去除一次性刮刀、微量离心管和单壁碳纳米管（SWMT）储备液上的静电。接着，将20微升核酸溶液加入980微升0.1摩尔氯化钠溶液中。然后，在超声处理前，向所得核酸溶液中加入1毫克经洗涤的单壁碳纳米管（SWNTs）。

在超声处理过程中，探头尖端的位置至关重要。如果出现泡沫，应重新调整探头位置，并尝试降低振幅。此外，若悬浮效果仍不理想，可尝试脉冲式超声或使用水浴超声。

使用带有直径为3毫米探头的超声波破碎仪，在冰浴中以40%的振幅对溶液进行10分钟的超声处理。将DNA-SWNT溶液在16,100 ×g条件下离心两次，每次90分钟。收集上清液并妥善保存，注意不要扰动含有碳纳米管束和聚集体的沉淀物。

根据机构针对纳米材料的危险废物处理规程，弃去沉淀物。使用紫外-可见分光光度计在 632 纳米处测量溶液的吸光度，依据朗伯-比尔定律确定悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的大致浓度及相应的稀释倍数。对于两亲性聚合物悬浮液，首先去除一次性刮刀、微量离心管和 SWNT 原液管上的静电。

在通风橱中，将五毫克单壁碳纳米管（SWNTs）加入五毫升 2% 胆酸钠溶液中。使用带有直径为六毫米探头的超声波破碎仪，在冰浴中以 40% 的振幅超声处理该溶液一小时。随后，使用超速离心机在 150,000 ×g 条件下离心样品四小时，然后小心收集上清液。

接下来，将1%（质量）的两亲性聚合物溶解于scSWNT溶液中。然后，使用3.5千道尔顿的透析膜，将聚合物-scSWNT溶液对1升去离子水或缓冲液透析五天。在第2小时和第4小时更换水或缓冲液。

使用紫外-可见分光光度计在 632 纳米处测量溶液的吸光度，以确定悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的大致浓度。为制备牛血清白蛋白-生物素（BSA-biotin）包被的载玻片，先用去离子水清洗显微镜载玻片和 0.17 毫米盖玻片，随后用甲醇、丙酮清洗，最后再用去离子水冲洗一次。在洁净的显微镜载玻片上，将数条双面胶带以约五毫米的间隔放置，从而形成微流通道。

通过取一片长的玻璃盖玻片并将其压在双面胶带上，以密封通道。确保将其居中放置在显微镜载玻片上，使盖玻片和载玻片的边缘不完全对齐。接下来，将100 µL BSA-biotin储备液加入900 µL的1× Tris缓冲液中，得到终浓度为1 mg/mL的溶液。

用移液器将BSA-生物素溶液加入通道一端，同时用纸巾从另一端吸液，使50微升溶液流经通道。溶液孵育5分钟后，用50微升0.1摩尔氯化钠溶液冲洗3至5次。接下来，将40微升浓度为5毫克/毫升的NAV储备液加入960微升1×Tris缓冲液中稀释，最终浓度为0.2毫克/毫升。

用移液器将NAV溶液吸入通道一端，同时用纸巾从另一端吸走溶液，使50微升溶液流经通道。将载玻片孵育2至5分钟后，用50微升0.1摩尔氯化钠溶液冲洗3至5次。然后，将悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的储备液与成像缓冲液稀释至浓度为1至10毫克每升。

将50微升该溶液注入通道中，孵育5分钟。用50微升成像缓冲液轻轻冲洗去除多余的SWNTs。为测量GT15 DNA-SWNTs对多巴胺的可逆响应，首先将涂覆有传感器的通道固定在荧光显微镜载物台上。

使用100倍油镜和铟镓砷相机将通道调至焦点。然后，向流动通道中加入50微升浓度为100微摩尔的多巴胺磷酸盐缓冲溶液，并记录荧光强度的变化。用磷酸盐缓冲液冲洗掉多巴胺溶液，并观察单个单壁碳纳米管传感器荧光的变化。

为了对仿生聚合物单壁碳纳米管（SWNTs）的分析物响应进行孔板筛选，需将悬浮的SWNT传感器等体积移取至各孔中。加入的体积应足以均匀覆盖孔底。随后，从筛选文库中将分析物移取至孔板中。

每种分析物均需制备三个复孔，以消除孔间差异以及激发光强度或温度波动的影响。在使用光谱仪和铟镓砷阵列监测发射光谱的同时，调节物镜高度。物镜的最佳位置应使焦平面位于孔中样品体积的大致中央，此时测得的信号强度应达到最大值。

对每个样品孔，记录一次1至10秒的曝光以采集光谱。将各孔的发射光谱与仅含单壁碳纳米管（SWNTs）而无其他分析物的对照孔进行比较，以量化荧光响应。GT15 DNA纳米管传感器的吸收光谱显示出多个峰，对应于不同手性的良好分散的碳纳米管。

展示了GT15 DNA纳米管传感器的近红外荧光。有趣的是，荧光强度在多巴胺存在时大约增加了一倍。在本图中，近红外荧光显微镜显示了固定在玻璃盖玻片表面的单个GT15 DNA纳米管传感器。

未来，有必要对传感器进行体内应用测试，例如扩展分析物库以包含分子竞争物，验证其在生物学相关浓度范围内的响应线性关系，以及检测其响应的可逆性。一旦掌握该方法，即可利用原本没有已知分子识别元件的分子构建多种合成传感器的文库。