Name: 工程分子识别与单壁碳纳米管仿生聚合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习利用仿生聚合物功能化单壁碳纳米管（SWNTs）的分子传感技术，用于活体组织中的多巴胺检测。该方法通过近红外荧光实现深层组织成像，为神经科学研究提供新型合成传感器开发平台。

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本工作得到了科学界面伯勒斯威康基金职业奖（CASI）、西蒙斯基金会资助以及脑与行为研究基金会青年研究员资助的支持。

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（SDS）。与对应的块体材料相比，纳米材料可能具有额外的危险性。应采用所有适当的安全措施，包括工程控制措施（通风橱、隔音罩）和个人防护装备（安全眼镜、护目镜、实验服、长裤、封闭式鞋履）。
1. 缓冲液、表面活性剂和聚合物溶液的制备
<ol>
	<li>100 mM NaCl 溶液的制备
	<ol>
		<li>将 584 mg NaCl 溶解于 80 mL 去离子水中，再加入去离子水定容至 100 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液的制备
	<ol>
		<li>将 3 g SDS 溶解于 80 mL 去离子水中，再加入去离子水定容至 100 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2% 胆酸钠（SC）溶液的制备
	<ol>
		<li>将 2 g 水合胆酸钠溶解于 80 mL 去离子水中，再加入去离子水定容至 100 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像缓冲液（1x Tris：20 mM Tris，100 mM NaCl）的制备
	<ol>
		<li>使用磁力搅拌器和搅拌板将 22.23 g Tris 碱和 58.44 g NaCl 溶解于 500 mL 去离子水中。</li>
		<li>小心滴加浓盐酸，直至 pH 达到 8.1。</li>
		<li>加入去离子水定容至 1 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RITC-PEG-RITC 聚合物的合成
	<ol>
		<li>将双氨基功能化的聚乙二醇（PEG）（5 kDa 或 20 kDa，0.1 mol/L）和异硫氰酸罗丹明（RITC，0.2 mol/L）溶解于 1 mL 二氯甲烷与二甲基甲酰胺（DMF）的 1:1 混合溶剂中。</li>
		<li>加入 0.2 mol/L 的 N,N-二异丙基乙胺（DIEA）。</li>
		<li>反应 3 小时后，加入 10 倍体积的乙醚进行沉淀，随后进行真空抽滤。</li>
		<li>将产物重新溶解于 DMF 中，重复乙醚沉淀和真空抽滤步骤。 
		注：其他异硫氰酸酯修饰的分子（例如，异硫氰酸荧光素，FITC）也可通过类似方法连接至 PEG 或其他氨基修饰的聚合物上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚乙二醇化 DNA（PEG-DNA）的制备
	<ol>
		<li>将 100 µL 的盐酸三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶液（0.5 M，pH 7.0）与 44.9 µL 的 5'-巯基修饰 DNA（1 mg/10 µL，溶于 0.1 M NaCl）混合，并加入 4.855 mL 去离子水中。</li>
		<li>搅拌 1 小时。</li>
		<li>将 500 mg 甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺溶解于 5 mL 磷酸盐缓冲盐水中。</li>
		<li>将 DNA 溶液与 PEG 溶液混合（总体积 10 mL），搅拌 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单壁碳纳米管（SWNTs）悬浮液的制备
<ol>
	<li>去除催化剂和杂质的单壁碳纳米管洗涤步骤。
	<ol>
		<li>将200-300 mg未洗涤的SWNTs加入含有45 mL去离子水的塑料离心管中。</li>
		<li>涡旋溶液2分钟，然后使用水浴超声仪超声5分钟。注意不同仪器的超声条件可能有所不同，因此需检查单壁碳纳米管（SWNT）溶液的光密度是否增加（即，变黑）以确保单壁碳纳米管（SWNTs）被充分分散。</li>
		<li>在16,100 × g下离心20分钟，弃去上清液。</li>
		<li>加入约 45 mL 新鲜的去离子水。</li>
		<li>重复步骤 2.1.2 至 2.1.4，最多 8 次。</li>
		<li>尽可能去除水分，注意不要扰动已沉淀的单壁碳纳米管（SWNTs），并让SWNT沉淀物自然风干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单壁碳纳米管的核酸悬浮液
	<ol>
		<li>将核酸（NA）溶解于 0.1 M NaCl 中，浓度为 100 mg/mL。</li>
		<li>使用防静电枪去除一次性刮勺、微量离心管和单壁碳纳米管（SWNT）储备液的静电。在通风橱中，将20 µL NA溶液加入980 µL 0.1 M NaCl溶液中，随后加入1 mg SWNTs。</li>
		<li>使用直径为3 mm的超声探头，在冰浴中以40%的振幅对溶液超声处理10分钟。</li>
		<li>将DNA-SWNT溶液在16,100 × g下离心两次，每次90分钟。若使用PEG-DNA，需通过100 kDa超滤离心管去除过量且未反应的DNA和PEG。加入足量PBS至超滤管满，于9,300 × g离心1.5分钟，重复洗涤步骤3次。</li>
		<li>收集上清液并妥善保存，注意不要扰动含有碳纳米管束和聚集体的沉淀物。根据机构针对纳米材料的危险废物处理规程，丢弃沉淀物。</li>
		<li>使用紫外-可见分光光度计在632 nm处测定溶液的吸光度，根据Lambert-Beer定律及适当的稀释倍数，结合ε=0.036 L/cm·mg计算悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的近似浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单壁碳纳米管的两亲性聚合物悬浮液
	<ol>
		<li>去除一次性刮勺、微量离心管和单壁碳纳米管储备液的静电。在通风橱中，将5 mg单壁碳纳米管加入5 mL 2% SC溶液中（也可使用SDS溶液）。</li>
		<li>使用直径为6 mm的超声探头，在冰浴中以40%的振幅对溶液超声处理1小时。</li>
		<li>使用超速离心机在150,000 x g条件下离心样品4小时，小心收集上清液。</li>
		<li>溶解1 wt %的两亲性聚合物（例如， RITC-PEG-RITC 在 SC-SWNT 溶液中。</li>
		<li>使用3.5 kDa透析膜将聚合物-SC-SWNT溶液在1 L去离子水或缓冲液中透析5天。在第2小时和第4小时更换水或缓冲液。可使用更大的透析膜，只要其能够去除所选表面活性剂，同时保留单壁碳纳米管（SWNT）和两亲性聚合物即可。</li>
		<li>使用紫外-可见分光光度计在632 nm处测定溶液的吸光度，根据Lambert-Beer定律及相应的稀释倍数，利用ε=0.036 L/cm·mg计算悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的大致浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 表面固定化单壁碳纳米管传感器的制备
<ol>
	<li>BSA-生物素和NeutrAvidin储备液的制备
	<ol>
		<li>将10 mg冻干的BSA-生物素溶解于1 mL去离子水中，配制成10 mg/mL的储备液，并在4 °C下保存。</li>
		<li>将10 mg NeutrAvidin蛋白（NAV，去糖基化亲和素蛋白）溶解于2 mL去离子水中，配制成5 mg/mL的储备液。分装后于-20 °C保存。解冻后的分装样品可在4 °C下保存数天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备BSA-生物素包被的显微镜载玻片
	<ol>
		<li>用去离子水清洗显微镜载玻片和0.17 mm盖玻片（或根据显微镜物镜要求选择合适的盖玻片），随后依次用甲醇、丙酮清洗，最后再用去离子水冲洗一次。</li>
		<li>在洁净的载玻片上间隔约5 mm贴上数条双面胶，形成通道。取一片长条形玻璃盖玻片，压在双面胶顶部以密封通道。注意将其居中放置在载玻片上，使盖玻片边缘与载玻片边缘不完全对齐。</li>
		<li>将100 µL BSA-生物素储备液加入900 µL 1× Tris缓冲液中，终浓度为1 mg/mL。</li>
		<li>用移液器将50 µL BSA-生物素溶液从通道一端注入，同时在另一端用吸水纸吸除液体。孵育5分钟，随后用50 µL 0.1 M NaCl冲洗3–5次。</li>
		<li>取40 µL 5 mg/mL的NAV储备液，加入960 µL 1× Tris缓冲液中稀释，终浓度为0.2 mg/mL。</li>
		<li>用移液器将50 µL NAV溶液从通道一端注入，同时在另一端用吸水纸吸除液体。孵育2–5分钟，随后用50 µL 0.1 M NaCl冲洗3–5次。</li>
		<li>将悬浮的单壁碳纳米管（SWNTs）储备液用成像缓冲液稀释至浓度为1–10 mg/L，取50 µL注入通道中，孵育5分钟。</li>
		<li>用50 µL成像缓冲液轻轻冲洗，去除多余的SWNTs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>APTES硅烷化显微镜载玻片的制备 
	注意：APTES硅烷化载玻片可用于将带负电荷的DNA包裹的SWNTs固定在玻璃基底表面。
	<ol>
		<li>配制10%的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）乙醇溶液。</li>
		<li>使用按照步骤3.2.2制备的通道，向其中注入100 µL 1× Tris缓冲液。</li>
		<li>用APTES溶液冲洗通道，孵育5分钟，然后用1× Tris缓冲液洗涤。</li>
		<li>将悬浮的DNA-SWNTs储备液用成像缓冲液稀释至浓度为1–10 mg/L，取50 µL注入通道中，孵育5分钟。</li>
		<li>用50 µL成像缓冲液轻轻冲洗，去除多余的SWNTs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. SWNT 传感器的荧光光谱学与显微镜检测
<ol>
	<li>近红外荧光显微镜
	<ol>
		<li>使用激光激发和配备有InGaAs传感器阵列的倒置显微镜，对表面固定的SWNTs进行成像。</li>
		<li>将激光束通过安装在可调运动学支架上的反射镜，引导至倒置显微镜的背照照明端口，并使用一对安装在支架上的孔径光阑（高度与端口齐平）进行准直。在后续反射镜之间以及激光进入照明端口之前放置两个光阑，确认光束能同时穿过两者，以确保光束水平且直线传播。如有必要，使用潜望镜组件调节光束高度。移除照明端口上可能衰减光束的短通热滤光片。</li>
		<li>将合适的滤光立方体插入显微镜中，以将激发光反射至物镜并收集发射光。该滤光立方体通常包含一个截止波长高于激发波长的二向色长通滤光片，例如，750 LP）和发射长通滤光片（例如， 850 LP）以进一步减少散射的激发光到达传感器。此外，可选择对特定手性SWNTs发射光具有选择性的发射滤光片。</li>
		<li>通过插入适当的准直立方体并替换物镜，使用两个带有1 mm小孔的偏移磨砂盘进行光束准直的精细调节。将光束对准下方和上方准直盘的中心。</li>
		<li>使用合适的适配器，并在必要时配合0.5倍镜头，将2D InGaAs传感器阵列连接到显微镜的侧向成像端口。</li>
		<li>使用100倍油镜（1.4 NA），滴加无荧光淬灭的浸油，将固定的SWNT样品置于显微镜载物台上。</li>
		<li>将物镜抬升，直至油浸接触到盖玻片底部（#1.5，厚度170 µm）。根据成像条件，必要时调整物镜的校正环。 例如， 温度，玻璃厚度， 等等。</li>
		<li>缓慢升高物镜，同时打开激发光源，并监测InGaAs相机的荧光信号。随着焦平面逐渐接近表面，固定化的传感器进入焦点，荧光强度应逐步增强。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>近红外荧光光谱法 
	注意：可以使用相同的显微镜装置进行荧光光谱分析，但需将收集到的光从显微镜主体导出，并引入光谱仪和InGaAs线阵探测器。
	<ol>
		<li>使用适用于近红外光（nIR）的运动学安装座和反射镜，将光路引导至光谱仪的入射狭缝。通过聚焦透镜将光线聚焦成一点，对准入射狭缝例如，平凸透镜，f = 150 mm）。此对准通过衰减激光功率来实现 &#60;1 mW，并将显微镜物镜更换为1&#34; 通过50/50分光滤光立方镜和反射镜，激发光将从显微镜主体的出口射出，可用于调节反射镜和透镜，使光束聚焦于入口狭缝。</li>
		<li>更换显微镜物镜和长通滤光片后，将培养板置于载物台上，使用光谱仪和InGaAs阵列记录焦平面上样品的光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量（GT）的可逆响应15 DNA-SWNTs检测多巴胺
	<ol>
		<li>将传感器涂层通道安装到显微镜载物台上，使用100倍油镜和InGaAs相机调焦。向流动通道中加入50 µL浓度为100 µM的多巴胺磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，并记录荧光强度的变化。</li>
		<li>使用磷酸盐缓冲盐水冲洗多巴胺溶液，并观察单个单壁碳纳米管传感器荧光的变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于微孔板的SWNTs传感器对分析物响应的筛选 
	注意：可使用由电动载物台控制的透明孔板对不同分析物进行筛选。理想的孔板应对可见光和红外光透明，且具有黑色侧壁，以最大限度减少孔间串扰。
	<ol>
		<li>移取等体积的悬浮SWNT传感器（例如，每孔加入5 mg/L浓度的溶液，用量以能均匀覆盖孔底为宜，通常 &#62;96孔板每孔100 µL &#62;384孔板每孔30 µL。</li>
		<li>移液分析物（例如，将2 µL（终浓度100 µM）筛选文库中的分析物加入孔板中。每种分析物均设置三个复孔，以消除孔间差异、激发光强度波动或温度变化带来的影响。</li>
		<li>提升物镜（例如，20倍消色差物镜，0.45 数值孔径）的同时，使用光谱仪和InGaAs阵列监测发射光谱。物镜的最佳位置应使焦平面大致位于样品孔内样品体积的中部，此时测得的光强应达到最大值。</li>
		<li>对每个样品孔，记录1-10秒的曝光以采集光谱。</li>
		<li>将每个孔的发射光谱与仅含SWNTs而无额外分析物的对照进行比较，以量化荧光响应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

单壁碳纳米管（SWNTs）可通过与SDS或单链DNA（ssDNA）直接超声处理，在水溶液中轻松分散，所得SWNT-聚合物杂化物的胶体分散体系表现为光学密度升高。SDS和ssDNA通过疏水作用或π-π相互作用吸附于SWNT表面，从而分散并增溶SWNT束。此外，其他聚合物如基因组DNA、两亲性聚合物、共轭聚合物和脂质，也可通过透析使用胆酸钠（SC）或SDS悬浮的样品，吸附到SWNT表面。亲水性聚合物如聚乙二醇（PEG）可通过在其末端修饰疏水基团 &#34;锚点&#34; 例如RITC或FITC，以实现嵌段共聚物在表面的吸附。对于在探头式超声处理的高功率条件下易发生剪切或降解的聚合物，或与单壁碳纳米管（SWNT）结合能力较弱的聚合物，透析法是制备稳定SWNT-聚合物悬浮液的最佳方法。聚合物包覆完成后，通过离心去除大的SWNT聚集体、无定形碳、残留金属催化剂及其他不溶性杂质，从而获得均匀分散的样品。离心后分散SWNT的典型终浓度范围为10–100 mg/L。
超声功率和时间可根据所选分散剂的种类进行调整和优化。这一步骤在单壁碳纳米管（SWNTs）包覆过程中至关重要，因为超声不足或功率过弱会...

单壁碳纳米管（SWNTs）是由碳原子构成的原子级厚度的片层卷曲而成的细长圆柱体，具有独特的电子和光学性质。1 这些性质包括能带隙，可通过激子复合产生近红外（nIR）荧光发射，且该发射对其局部环境高度敏感。SWNTs的nIR发射位于近红外窗口范围内，在此波段光在生物组织中的穿透深度最大。2,3 此外，SWNTs表现出若干与有机荧光染料截然不同的独特特性：SWNTs具有较大的斯托克斯位移，不会发生光漂白，也不会发生闪烁。4 近年来，利用这些特性已开发出多种新型分子传感器，并应用于生物学领域。5,6 然而，未经修饰的SWNTs在水中不溶，获得单根SWNTs的悬浮液仍具挑战性。7,8 SWNTs在溶液中易发生束化和聚集，这会掩盖其能带隙荧光，2 使其不适合用于传感应用。
将单个碳纳米管分散在水溶液中需要对其表面进行修饰，以防止因疏水性导致的聚集。9 虽然共价修饰可以使单壁碳纳米管（SWNTs）溶于水，10 并赋予其特定的结合化学性质，但单壁碳纳米管晶格中的缺陷位点会降低甚至消除其荧光发射。相反，可以通过使用表面活性剂、脂质、聚合物和DNA9,11-13 对单壁碳纳米管进行功能化修饰，这些分子通过疏水作用和π-π堆叠作用吸附在纳米管表面。围绕表面功能化单壁碳纳米管所形成的化学环境被称为“冠相”（corona phase）。冠相的扰动会对在纳米管表面传输的激子产生显著影响，从而引起单壁碳纳米管荧光发射的调制。正是这种冠相与单壁碳纳米管荧光之间的敏感关系，可通过在单壁碳纳米管的大表面积上引入特定的结合模式，用于开发新型分子传感器。分析物与单壁碳纳米管冠相结合后引起的扰动可能导致局部介电环境的变化、电荷转移或引入晶格缺陷，这些效应均可调制单壁碳纳米管的荧光发射，从而作为信号转导机制。14 该策略已被用于开发多种新型荧光传感器，用于检测包括DNA15,16、葡萄糖17 以及ATP18、活性氧19 和一氧化氮20,21 等小分子在内的多种不同类型的分子。然而，这些方法的局限性在于其依赖于目标分析物存在已知的结合模式。
最近，一种更为通用的荧光传感器设计方法得到发展，该方法利用两亲性杂聚物、磷脂和多核苷酸对单壁碳纳米管（SWNTs）进行非共价功能化。这些分子吸附在碳纳米管表面，形成高度稳定的单根SWNT分散液。22-25 具有独特冠状相，可特异性结合蛋白质26,27 或包括神经递质多巴胺在内的小分子。28-30 通过设计冠相以分散单壁碳纳米管（SWNTs）并特异性结合目标分析物，该技术被称为冠相分子识别（CoPhMoRe）。28 CoPhMoRe单壁碳纳米管传感器因其体积小、毒性低、稳定性高以及不褪色的近红外荧光特性，成为理想的候选材料 体内 用于延长的时间分辨测量的传感技术6 近期研究已表明，它们在植物组织中可用于活性氮和活性氧物种的光学检测。31 CoPhMoRe SWNT传感器一个特别令人兴奋的应用前景是无需标记即可检测多巴胺等神经递质 体内而其他技术（如电化学传感或免疫组织化学）则存在空间分辨率、时间分辨率和特异性不足的问题。
迄今为止，CoPhMoRe单壁碳纳米管（SWNT）传感器的设计与发现受限于分散剂库的规模及其化学多样性，这限制了针对特定目标物找到理想传感器的可能性。到目前为止，研究人员仅初步探索了可用的共轭聚合物、嵌段共聚物、生物聚合物及仿生聚合物，而这些聚合物均有望作为功能活性分散剂用于SWNT传感器。本文介绍了多种分散SWNT并表征其荧光特性的方法，适用于高通量筛选以及单根SWNT传感器的分析。具体而言，我们阐述了通过直接超声处理将多核苷酸寡聚物包覆在SWNT表面的操作流程，以及通过透析置换表面活性剂的方式，利用两亲性聚合物对SWNT进行功能化的步骤。文中以(GT)15-DNA和罗丹明异硫氰酸酯功能化的聚乙二醇（RITC-PEG-RITC）为例进行说明。我们展示了(GT)15-DNA修饰的SWNT作为CoPhMoRe传感器用于多巴胺检测的应用。最后，我们概述了单分子传感器测量的实验流程，该方法可用于传感器表征或单分子检测。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>胆酸钠水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱（Trizma碱）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>胺-聚乙二醇-胺，NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-PEG-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明B异硫氰酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二异丙基乙胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;rsquo;-硫醇修饰DNA&amp;nbsp;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa离心过滤管</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO超纯单壁碳纳米管</td><td>Integris</td><td>HiPco SuperPurified</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>防静电枪</td><td>Milty</td><td>Milty Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr><tr><td>透析盒</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-生物素</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素蛋白</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>运动学镜片</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>潜望镜</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100倍物镜</td><td>Zeiss</td><td>Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>20倍物镜</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多巴胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>红外二维阵列相机</td><td>Princeton Instruments</td><td>NIRvana</td><td></td></tr><tr><td>红外一维传感器阵列</td><td>Princeton Instruments</td><td>PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>近红外光谱仪</td><td>Princeton Instruments</td><td>SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>平凸透镜</td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>培养板（玻璃底）</td><td>Corning</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

在单壁碳纳米管上利用仿生聚合物构建分子识别系统

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

半导体单壁碳纳米管（SWNTs）是一类在近红外区发光的光学活性纳米材料，其发光波段恰好位于生物样品透明度最高的光学窗口。本文概述了将两亲性聚合物和多核苷酸吸附到SWNTs表面的技术，以构建其冠相结构，并开发针对小分子和蛋白质的新型分子传感器。这些功能化的SWNT传感器具有良好的生物相容性和稳定性。聚合物可通过直接超声处理SWNTs与聚合物的混合物，或先使用表面活性剂分散SWNTs，再通过透析引入聚合物的方式吸附到纳米管表面。利用吸收光谱和近红外荧光光谱，可验证这些传感器的荧光发射特性、稳定性及其对目标分析物的响应。此外，我们还展示了将传感器固定在玻璃载片表面的方法，从而实现单分子荧光显微镜观察，用于表征聚合物吸附及分析物结合的动力学过程。

采用表面活性剂和两亲性聚合物，通过直接超声和透析交换方法将单壁碳纳米管（SWNTs）悬浮于水溶液中。图1展示了使用铁羰基催化法（HiPCO）生长的单壁碳纳米管，分别利用SC、RITC-PEF20-RITC和(GT)15-DNA进行悬浮。单壁碳纳米管在添加SDS（或聚合物）后，其光密度在超声处理后显著升高，而在通过离心纯化去除聚集体和杂质后则明显下降（图1）。在632 nm处测得的吸光度用于定量悬浮态单壁碳纳米管的浓度。28
采用吸收光谱和荧光光谱法表征SWNT悬浮液的光物理性质。图2展示了使用(GT)15-DNA和RITC-PEG20-RITC悬浮的SWNTs的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱是样品中每种不同手性纳米管各自吸收峰的叠加。同样，每种手性均表现出其独特的荧光发射峰。相对发射峰...

我们介绍一种利用两亲性聚合物和DNA对近红外荧光单壁碳纳米管（SWNTs）的晕相进行工程化改造的实验方案，旨在开发针对尚无已知识别元件的分子靶标的传感器。

半导体单壁碳纳米管（SWNTs）是一类在近红外区发光的光学活性纳米材料，其发光波段恰好与……

本实验的总体目标是制备经过仿生聚合物功能化的近红外荧光单壁碳纳米管，用于分子传感。这些纳米传感器可实现活体组织的时间分辨成像。例如，可用于检测大脑中的多巴胺。这些传感器的主要优势在于其固有的近红外荧光特性，能够实现对组织更深层的成像。合成传感器可检测那些缺乏天然分子识别元件的分子，因此这种通用的传感器开发方法在小分子检测中尤为有用。制备SWNTs的核酸悬浮液时，首先将核酸溶解于0.1摩尔氯化钠溶液中，使其浓度达到100毫克/毫升。在通风橱中，使用防静电枪去除一次性刮刀、微量离心管和单壁碳纳米管（SWMT）储备液上的静电。接着，将20微升核酸溶液加入980微升0.1摩尔氯化钠溶液中。然后，在超声处理前，向所得核酸溶液中加入1毫克经洗涤的单壁碳纳米管（SWNTs）。在超声处理过程中，探头尖端的位置至关重要。如果出现泡沫，应重新调整探头位置，并尝试降低振幅。此外，若悬浮效果仍不理想，可尝试脉冲式超声或使用水浴超声。使用带有直径为3毫米探头的超声波破碎仪，在冰浴中以40%的振幅对溶液进行10分钟的超声处理。将DNA-SWNT溶液在16,100 ×g条件下离心两次，每次90分钟。收集上清液并妥善保存，注意不要扰动含有碳纳米管束和聚集体的沉淀物。根据机构针对纳米材料的危险废物处理规程，弃去沉淀物。使用紫外-可见分光光度计在 632 纳米处测量溶液的吸光度，依据朗伯-比尔定律确定悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的大致浓度及相应的稀释倍数。对于两亲性聚合物悬浮液，首先去除一次性刮刀、微量离心管和 SWNT 原液管上的静电。在通风橱中，将五毫克单壁碳纳米管（SWNTs）加入五毫升 2% 胆酸钠溶液中。使用带有直径为六毫米探头的超声波破碎仪，在冰浴中以 40% 的振幅超声处理该溶液一小时。随后，使用超速离心机在 150,000 ×g 条件下离心样品四小时，然后小心收集上清液。接下来，将1%（质量）的两亲性聚合物溶解于scSWNT溶液中。然后，使用3.5千道尔顿的透析膜，将聚合物-scSWNT溶液对1升去离子水或缓冲液透析五天。在第2小时和第4小时更换水或缓冲液。使用紫外-可见分光光度计在 632 纳米处测量溶液的吸光度，以确定悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的大致浓度。为制备牛血清白蛋白-生物素（BSA-biotin）包被的载玻片，先用去离子水清洗显微镜载玻片和 0.17 毫米盖玻片，随后用甲醇、丙酮清洗，最后再用去离子水冲洗一次。在洁净的显微镜载玻片上，将数条双面胶带以约五毫米的间隔放置，从而形成微流通道。通过取一片长的玻璃盖玻片并将其压在双面胶带上，以密封通道。确保将其居中放置在显微镜载玻片上，使盖玻片和载玻片的边缘不完全对齐。接下来，将100 µL BSA-biotin储备液加入900 µL的1× Tris缓冲液中，得到终浓度为1 mg/mL的溶液。用移液器将BSA-生物素溶液加入通道一端，同时用纸巾从另一端吸液，使50微升溶液流经通道。溶液孵育5分钟后，用50微升0.1摩尔氯化钠溶液冲洗3至5次。接下来，将40微升浓度为5毫克/毫升的NAV储备液加入960微升1×Tris缓冲液中稀释，最终浓度为0.2毫克/毫升。用移液器将NAV溶液吸入通道一端，同时用纸巾从另一端吸走溶液，使50微升溶液流经通道。将载玻片孵育2至5分钟后，用50微升0.1摩尔氯化钠溶液冲洗3至5次。然后，将悬浮单壁碳纳米管（SWNTs）的储备液与成像缓冲液稀释至浓度为1至10毫克每升。将50微升该溶液注入通道中，孵育5分钟。用50微升成像缓冲液轻轻冲洗去除多余的SWNTs。为测量GT15 DNA-SWNTs对多巴胺的可逆响应，首先将涂覆有传感器的通道固定在荧光显微镜载物台上。使用100倍油镜和铟镓砷相机将通道调至焦点。然后，向流动通道中加入50微升浓度为100微摩尔的多巴胺磷酸盐缓冲溶液，并记录荧光强度的变化。用磷酸盐缓冲液冲洗掉多巴胺溶液，并观察单个单壁碳纳米管传感器荧光的变化。为了对仿生聚合物单壁碳纳米管（SWNTs）的分析物响应进行孔板筛选，需将悬浮的SWNT传感器等体积移取至各孔中。加入的体积应足以均匀覆盖孔底。随后，从筛选文库中将分析物移取至孔板中。每种分析物均需制备三个复孔，以消除孔间差异以及激发光强度或温度波动的影响。在使用光谱仪和铟镓砷阵列监测发射光谱的同时，调节物镜高度。物镜的最佳位置应使焦平面位于孔中样品体积的大致中央，此时测得的信号强度应达到最大值。对每个样品孔，记录一次1至10秒的曝光以采集光谱。将各孔的发射光谱与仅含单壁碳纳米管（SWNTs）而无其他分析物的对照孔进行比较，以量化荧光响应。GT15 DNA纳米管传感器的吸收光谱显示出多个峰，对应于不同手性的良好分散的碳纳米管。展示了GT15 DNA纳米管传感器的近红外荧光。有趣的是，荧光强度在多巴胺存在时大约增加了一倍。在本图中，近红外荧光显微镜显示了固定在玻璃盖玻片表面的单个GT15 DNA纳米管传感器。未来，有必要对传感器进行体内应用测试，例如扩展分析物库以包含分子竞争物，验证其在生物学相关浓度范围内的响应线性关系，以及检测其响应的可逆性。一旦掌握该方法，即可利用原本没有已知分子识别元件的分子构建多种合成传感器的文库。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

工程分子识别与单壁碳纳米管仿生聚合物

介绍一种采用芯片内光聚合技术制备聚合物微阵列的方法。同时描述了利用原子力显微镜、水接触角测量、X射线光电子能谱、飞行时间二次离子质谱以及细胞黏附实验对表面进行高通量表征的过程。...

用于生物材料高通量发现的聚合物微阵列

我们介绍了基于碳纳米管的高频生物传感器的器件制备与测量方案。高频检测技术可有效缓解离子（德拜）屏蔽效应这一根本问题，使纳米管生物传感器能够在高离子强度溶液中运行，而传统电子生物传感器在此类条件下则无法工作。本技术为在生理相关条件下运行的即时检测（POC）电子生物传感器提供了一个独特的平台。...

用于高离子强度溶液中检测的碳纳米管高频纳米电子生物传感器的制备

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