Name: 小核糖核酸病毒取向的微小RNA基于调控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 了解利用微小RNA互补序列调控小核糖核酸病毒取向的方法。该技术通过最小化病毒基因组改造，实现病毒复制特异性和安全性的精准控制，适用于多种病毒类别。

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此处所述的代表性工作由 Al 和 Mary Agnes McQuinn、Richard M. Schulze 基金会以及梅奥诊所的 NIH 救济拨款资助。

1. 将微小RNA应答元件克隆至病毒基因组中
<ol>
	<li>设计microRNA响应元件插入片段。
	<ol>
		<li>确定目标microRNA及其对应的靶序列。多个数据库可提供成熟的microRNA序列。推荐使用：http://www.mirbase.org/9,27,28,29,30。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将响应元件克隆至编码载体基因组或转录本的质粒DNA中。 
	注：对于两个或更多拷贝的响应元件，使用唯一的限制性酶切位点进行插入操作更为简便且通用。
	<ol>
		<li>采用重叠延伸拼接（SOE）PCR方法插入响应元件或唯一的限制性酶切位点。该方法已有详细描述31。</li>
		<li>若使用限制性酶切位点进行插入，可购买商业合成的、经PAGE纯化的正义链与反义链超长寡核苷酸（ultramers），其序列两端包含该唯一限制性酶切位点的突出末端序列（图2）。</li>
		<li>将0.5 µg正义链ultramers、0.5 µg反义链ultramers与DNA连接缓冲液混合至终浓度为1x，并用H2O定容至50 µl。通过将反应体系在85 °C孵育10分钟，随后每30秒降低0.5 °C，直至反应温度降至25 °C，使ultramers退火形成双链。</li>
		<li>将0.5 µg含有新引入的唯一限制性酶切位点的载体DNA、酶切缓冲液（终浓度为1x）、1 µl相应的限制性内切酶混合，并用H2O定容至终体积20 µl。在37 °C下酶切2小时。通过琼脂糖凝胶纯化法纯化线性化DNA32。</li>
		<li>采用标准连接技术33，以3:1的ultramers:载体摩尔比，在16 °C下过夜连接退火后的双链ultramers与酶切后的载体。 
		注：当使用单一限制性酶切位点进行插入时，对酶切后载体末端进行去磷酸化处理，并对退火后的寡核苷酸末端进行磷酸化修饰，可能提高连接效率。</li>
		<li>采用热激法将连接产物转化至大肠杆菌（E. coli）中34。 
		注：编码病毒基因组的质粒通常较大，因此使用专为高效摄取大分子DNA构建体优化的感受态细胞，可能提高转化效率。</li>
		<li>使用 commercially available purification kit（商业化质粒提取试剂盒）从单个菌落中提取质粒DNA35。通过测序验证插入区域，筛选出含有正确方向microRNA响应元件的合适克隆（图2）36。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从质粒DNA中拯救被microRNA靶向的肠道病毒
<ol>
	<li>在一种允许病毒复制但不表达相应 microRNA 的细胞系中拯救被 microRNA 靶向的肠道病毒。本方案使用 H1-HeLa 细胞，因为它们不表达 miR-142、miR-124 或 miR-125，但并非必须使用 H1-HeLa 细胞进行拯救。 
	注意：应严格遵守所有关于感染性病原体安全操作和处置的指导原则。
	<ol>
		<li>将 H1-HeLa 细胞接种于 6 孔板中，使其在转染时达到约 80% 汇合度（接种后 24 小时）。每孔加入 2 mL 添加 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基。</li>
		<li>将转染试剂恢复至室温。在无菌微量离心管中混合 250 µL 无血清培养基、2.5 µg 编码 microRNA 靶向基因组的质粒 DNA 和 7.5 µL 转染试剂，轻轻吹打混匀。室温孵育 15–30 分钟。</li>
		<li>吸除孔中培养基，每孔加入 2 mL 新鲜完全培养基。</li>
		<li>将步骤 2.1.2 中的全部转染混合物逐滴加入 6 孔板的一个孔中，每滴加在孔内不同区域。</li>
		<li>将细胞在 37 °C 培养，直至出现细胞病变效应（CPE）或可检测到报告蛋白（约 24–72 小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获并传代拯救出的病毒至新鲜细胞。
	<ol>
		<li>将细胞接种于 6 孔板中，使其在感染时达到 80–90% 汇合度（接种后 24 小时）。 
		注意：根据后续所有实验所需的病毒量，可相应扩大或缩小规模。</li>
		<li>使用橡胶细胞刮棒或橡胶刮棒将每个拯救孔中的细胞刮入上清液中。轻轻沿孔底拖动刮棒。将细胞和上清液转移至冻存管中。</li>
		<li>对样品进行两次冻融循环，然后在 4 °C 下以 1,200 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞碎片。</li>
		<li>使用 0.2 µm 注射器滤器对澄清的上清液过滤两次。过滤后的上清液即含有病毒。 
		注意：滤膜孔径可根据病毒颗粒大小调整，可能不适用于较大病毒。</li>
		<li>吸除孔中培养基，用无血清培养基洗涤一次，每孔加入 1 mL 新鲜无血清培养基。</li>
		<li>每孔加入 50 µL 过滤后的拯救上清液，轻轻摇动培养板使病毒均匀分布。</li>
		<li>将培养板在 37 °C 孵育 2 小时，然后吸除各孔中的培养基以去除未进入细胞的病毒。</li>
		<li>每孔加入 1.5–2 mL 新鲜完全培养基，在 37 °C 培养至出现明显细胞病变效应或报告蛋白（约 24–48 小时）。</li>
		<li>重复步骤 2.2.2 至 2.2.4。过滤后的拯救上清液即为病毒储备液。将病毒储备液分装为单次使用量，置于冻存管中于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从 microRNA 靶向病毒中进行拯救 体外 转录的RNA转录本
<ol>
	<li>利用上游启动子从编码靶向病毒基因组的 microRNA 的质粒 DNA 生成 RNA 转录本。 
	注意：后续所有步骤均应采用标准操作规范以建立和维持无核酸酶的环境。</li>
	<li>使用转录序列下游的酶切位点将质粒DNA线性化。将5 µg质粒DNA、1x终浓度的酶缓冲液、3 µl限制性内切酶混合，并用H₂O定容至50 µl。2O. 将反应在 37 °C 下孵育 3 小时。</li>
	<li>加入1/20th 0.5 M EDTA 体积的 1/10th 5 M NH₄体积4 向消化反应物中加入醋酸钠和2倍体积的100%乙醇，混匀。在-20 °C孵育1小时至过夜。</li>
	<li>在4 °C、17,000 × g条件下离心10分钟，使沉淀的DNA成团。弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL预冷的70%乙醇中，再在4 °C、17,000 × g条件下离心10分钟，使DNA再次成团。</li>
	<li>弃去上清，再次离心30秒。用移液器吸除残留的上清液，并将沉淀空气干燥。将DNA沉淀重悬于无菌无核酸酶的H2浓度为 0.5–1 µg/µL。</li>
	<li>解冻 体外 在室温下放置转录试剂，将核糖核苷酸置于冰上（含甘油的酶不会冻结，应直接放在冰上）。反应缓冲液保持在室温。</li>
	<li>在PCR管中配制转录反应体系，依次加入ATP、CTP、GTP和UTP溶液各2 µL，2 µL 10×反应缓冲液，1 µg线性化DNA，2 µL酶，最后用无核酸酶的H₂O定容至20 µL。2O.</li>
	<li>在37 °C下孵育反应2小时。</li>
	<li>纯化RNA转录本。 
	注意：实验开始前，按说明用乙醇配制洗涤液，并将洗脱液预热至 95 °C，以用于洗脱步骤。
	<ol>
		<li>用洗脱液（无需预热）将转录反应体系补至100 µL。向反应体系中加入350 µL结合溶液浓缩液和250 µL 100%乙醇，混匀。</li>
		<li>将样品转移至插入收集管中的滤芯，于12,000 × g离心1分钟。弃去滤过液。</li>
		<li>向滤芯中加入 500 µL 洗涤液，于 12,000 × g 离心 1 分钟。弃去穿滤液。重复此洗涤步骤一次。弃去穿滤液。于 12,000 × g 离心 1 分钟，以去除残留乙醇。</li>
		<li>将滤芯转移至一支洁净的收集管中，向滤芯加入50 µL预热的洗脱液。在12,000 × g下离心1分钟。重复此洗脱步骤，共收集100 µL含有纯化RNA转录本的洗脱液。弃去滤芯。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过测量样品在260 nm和280 nm处的吸光度，并结合比尔-朗伯定律，测定洗脱液中的RNA浓度。</li>
	<li>使用RNA凝胶电泳评估RNA的完整性37参见 图3 以获取RNA完整性良好与较差的示例。RNA应分装至单次使用管中，并于-80 °C保存以维持其完整性。</li>
	<li>将转染试剂置于室温下预热。在无菌微量离心管中加入250 µl无血清培养基、2.5 µg纯化的RNA转录本、5 µL增强溶液和5 µL转染试剂，轻轻吹打混匀。室温孵育混合物2-5分钟。</li>
	<li>在6孔板中接种H1-HeLa细胞，使转染时（接种后24 h）细胞汇合度约为80%。每孔加入2 mL添加10%胎牛血清的DMEM培养基接种细胞。</li>
	<li>吸出培养板中细胞的培养基，加入 2 mL 新鲜的完全培养基。</li>
	<li>将步骤3.12中的全部转染混合物逐滴加入6孔板的一个孔中，每滴加一滴应更换孔内不同区域。</li>
	<li>将细胞在37 °C下孵育，直至出现细胞病变效应（CPE）或可检测到报告蛋白（约24–72小时）。</li>
	<li>按照步骤 2.2 至 2.2.9 所述继续进行 microRNA 靶向病毒的拯救。</li>
</ol>
4. 通过计算50%组织培养感染剂量（TCID50）滴定病毒储备液
<ol>
	<li>在96孔板中接种H1-HeLa细胞，每孔104 每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种细胞。37 °C孵育过夜。 
	注意：在允许病毒复制但不表达相应微小RNA的细胞中进行病毒滴度测定。</li>
	<li>用无血清培养基将病毒进行10倍系列稀释，每次稀释总体积为1 mL。 
	注意：若需更高精度，应使用更低的稀释比例。 
	注意：每次稀释后需更换枪头，以防止病毒黏附于枪头导致滴度被高估。</li>
	<li>将96孔板倾斜，吸出培养的HeLa细胞中的培养基。向96孔板的8个孔（每种病毒稀释液1行）中每孔加入100 µL相应的病毒稀释液。在96孔板的第1行和第12行每孔加入100 µL不含病毒的无血清培养基作为对照。 
	注意：吸取和添加培养基时，务必使移液 tip 接触孔壁，以避免细胞脱落。</li>
	<li>37 °C 培养板 2 小时。将板倾斜一侧，吸去孔中的培养基。 
	注意：每次稀释系列之间需更换移液器吸头。</li>
	<li>每孔加入 100 µl 完全培养基。将培养板于 37 °C 培养 72 小时。</li>
	<li>在显微镜下观察各孔，根据是否存在细胞病变效应（CPE）标记为阳性或阴性。</li>
	<li>使用以下公式计算每种病毒的滴度：Log10 （TCID）50/ml) = L + D(S-0.5) + log10 (1/V)。L 是负对数10 最高病毒稀释度中所有孔均为阳性的稀释倍数。D 为对数10 稀释因子。S 是各个比例（pi）的总和。pi 为单个稀释度的计算比例（阳性孔数/每个稀释度的总孔数）。V 为接种液体积（ml/孔）。</li>
</ol>
<img alt="病毒稀释分析表，包含TCID50计算；涉及L、D、S、V变量。" src="/files/ftp_upload/55033/55033tbl1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="表 1"> 
表 1：通过计算 TCID50 定量感染性病毒颗粒。使用一系列十倍稀释的病毒原液感染细胞后的代表性结果。“L”等于4，因为所有孔均显示细胞病变效应（CPE）阳性的最高稀释度为10-4。“D”为10的log10值，由于使用的是十倍稀释，因此等于1。“S”为各比例值之和。本示例中，各比例值分别为1.0、0.875、0.375、0.125和0，其总和（S）为2.375。“V”为最初用于感染细胞的接种物体积（单位：ml）。
5. 评估 microRNA 靶向效率：单步生长动力学
<ol>
	<li>本实验的对照组包括模拟感染的细胞、未修饰的病毒以及含有非靶向或无功能反应元件的病毒。</li>
	<li>为时间进程实验，在12孔组织培养板中接种H1-HeLa细胞，使其在感染时达到80–90%的汇合度（接种后24小时）。每孔加入1 mL添加10%胎牛血清的DMEM培养基进行接种。 
	注意：建议每个时间点单独使用一块培养板。本方案针对复制周期为8–12小时的病毒，共设置7个不同时间点。执行本实验无需使用H1-HeLa细胞。实验应在不表达靶向microRNA的许可性细胞中进行。也可在表达相应microRNA的细胞中进行该实验，以评估在选择性压力下的病毒生长动力学。</li>
	<li>吸除各孔中的培养基。每孔加入0.5 mL无血清培养基洗涤，轻轻摇动培养板后吸除液体。每孔再加入0.5 mL新鲜无血清培养基。</li>
	<li>以高感染复数（MOI；每个细胞的感染性颗粒数）对各孔进行感染，以确保所有细胞均被感染。本方案使用的MOI为3。
	<ol>
		<li>将病毒储备液用无血清培养基稀释至每100 µL含MOI = 3的病毒量。向七个不同的孔中各加入100 µL病毒稀释液，并在37 °C孵育2小时。</li>
		<li>吸除所有孔中的培养基，每孔加入0.5 mL完全培养基，轻轻摇动后吸除，重复洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔加入1 mL完全培养基，于37 °C继续孵育至预定时间点。</li>
	<li>在感染后2、4、6、8、10、24和48小时收集样本用于病毒滴定（每个时间点取一孔）。将孔中700 µL培养上清转移至冻存管中。用橡胶刮刀轻柔刮取整个孔内的细胞，并将其刮入剩余的上清液中。将细胞与上清液的混合物转移至含有700 µL上清液的相应冻存管中。 
	注意：刮取过程中应避免上清液飞溅至其他孔中，以防样本污染。在刮取前先转移700 µL上清液可最大限度减少飞溅。</li>
	<li>将样本置于-80 °C保存，直至所有样本收集完毕。</li>
	<li>对样本进行三次冻融循环，并在4 °C下以1,200 × g离心5分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>按照第4节所述方法进行病毒滴定，并比较随时间变化的病毒生长动力学。</li>
</ol>
6. 评估microRNA靶向特异性：利用合成microRNA模拟物的病毒扩散实验
注意：使用合成的 microRNA 模拟物以验证 microRNA 与 microRNA 靶标相互作用的特异性。
<ol>
	<li>每次实验均需设置模拟转染对照、阴性对照 microRNA 模拟物及实验用 microRNA 模拟物单独对照，以评估 microRNA 介导的毒性。同时建议包含阳性对照即 microRNA 靶向基因或基因组）时，由于 microRNA 模拟物的转染效率较低，可能导致假阴性结果。</li>
	<li>在96孔组织培养板中接种H1-HeLa细胞，使其在转染时（接种后24小时）达到80-90%汇合度。每孔加入0.1 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基接种细胞。 
	注意：本实验应在允许病毒复制但不表达相应微小RNA的细胞中进行。</li>
	<li>将转染试剂 warming 至室温。加入 9 µL 无血清培养基、microRNA 模拟物储备液（每孔终浓度为 200 nM）、0.18 µL 助转染试剂和 0.18 µL 转染试剂，混匀。室温孵育混合物 2–5 分钟。 
	注意：所列体积为每孔用量。建议配制转染用总混合液（master mix），以处理所有孔，从而保持一致性并尽量减少移液误差。microRNA 模拟物的最适浓度因实验条件而异，应参考 microRNA 模拟物产品附带的生产商说明书，确定合理的起始浓度，通常最终浓度范围为 5–200 nM。</li>
	<li>吸出孔板中的培养基，加入 92 µl 新鲜完全培养基。 
	注意：如果样本数量较多，可在配制转染溶液前完成此步骤，并将培养板置于37 °C保存，直至后续操作准备就绪。</li>
	<li>将第6.3步中的全部转染混合物逐滴加入细胞中。</li>
	<li>37 °C 下孵育 6 小时。</li>
	<li>以低感染复数（MOI）感染每个孔，以确保仅有较低比例的细胞被感染，从而便于分析病毒的传播。本方案采用的MOI为0.2。
	<ol>
		<li>用无血清培养基将病毒储备液稀释至 MOI = 0.2，每 100 µL 含相应病毒量。吸除孔内培养基，每孔加入 100 µL 病毒稀释液。</li>
		<li>37 °C 下孵育 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸出每孔中的培养基，加入 100 µL 新鲜的完全培养基。</li>
	<li>37 °C 培养 20–22 小时。</li>
	<li>测定上清液中的病毒滴度。
	<ol>
		<li>收集每个孔中的上清液，并加入 100 µL 新鲜的完全培养基。 
		注意：若使用悬浮细胞，需将后续步骤中获得的细胞沉淀重悬于100 µL新鲜完全培养基中，并返回样品孔进行活力检测。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心5分钟，去除收集的上清液中的细胞碎片。</li>
		<li>将澄清的上清液转移至新管中，并在不表达相应微小RNA的许可细胞上滴定感染性病毒，具体步骤如第4节所述。 
		注意：所有样品均需置于冰上，以防止感染性丧失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定细胞的活力。
	<ol>
		<li>每孔加入10 µL MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）试剂。</li>
		<li>37 °C 下孵育 2–4 小时，直至出现紫色沉淀。</li>
		<li>加入100 µL去垢剂试剂。</li>
		<li>室温避光孵育2小时。</li>
		<li>在570 nm处读取所有孔的吸光度。 
		注意：为比较细胞存活率百分比，需将所有样品归一化至模拟转染细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

miRNA响应元件在病毒基因组中的设计、组成及其定位将决定靶向效率和特异性。优化这些因素需要通过反复试验。然而，基于RNA结构分析以及既往关于病毒复制和miRNA特征的研究进行合理设计，有助于以最少的优化实现该技术的应用10,11,12,13,38。
在启动REs设计时，研究人员应首先收集一组在目标细胞中表达、在非目标细胞中表达降低且已被实验验证的microRNA。完成收集后，应进行多项基于预测的分析，以评估是否存在竞争性microRNA-靶标相互作用的可能性。许多病毒编码microRNA或非编码RNA，通过螯合细胞内的microRNA来调控病毒和宿主基因的表达。此外，已有研究表明，多种RNA病毒可与细胞microRNA相互作用，以增强其复制能力<sup cl...

开发一种广泛适用、简便且高效的工程化载体靶向感染特异性宿主细胞的方法，为提高病毒的安全性、生物学认知及治疗应用提供了重要机遇。目前已有多种实现病毒嗜性靶向的机制，包括转导水平、转录水平和翻译水平的调控技术。然而，这些方法通常并非对所有载体系统均适用，可能需要靶细胞中存在缺陷的信号通路，或需将较大的编码序列插入病毒基因组。此外，这些方法还可能导致病毒毒力减弱，显著削弱其治疗活性，并限制对未修饰病毒系统的研究认知。
microRNA是一类小分子（22-25个核苷酸）非编码RNA，可在真核细胞中介导基因沉默。microRNA通过与信使RNA（mRNA）中的互补靶序列（应答元件）结合，导致转录本不稳定、降解或翻译抑制。通常情况下，microRNA以部分互补的方式结合应答元件，从而对基因表达产生轻微调控作用1,2,3,4,5。通过提高应答元件的互补性，可实现对基因表达更显著的调控6。目前已在多种物种中鉴定出数千种成熟microRNA，其中许多在不同细胞类型和组织类型中表现出差异性表达模式7,8,9。这些microRNA表达特征可用于实现病毒扩增的细胞特异性限制，方法是将完全互补的应答元件插入病毒基因组中10,11,12,13。该microRNA靶向技术的总体目标是在不额外引入减毒因素的前提下，控制载体基因组的嗜性。
该方法在调控病毒嗜性方面的实用性最初在慢病毒载体中得到验证，可用于限制特定组织中的转基因表达14,15,16。此后，该技术已广泛应用于多种复制型和非复制型病毒载体，以增强基因治疗效果，并通过消除正常组织中的非预期毒性，提高多种溶瘤病毒的安全性10,11,12,13,17。该方法还被用于开发安全有效的减毒活疫苗，并优化病毒及疫苗的生产工艺18,19,20,21。通过对载体进行miRNA靶向设计，可在接种宿主或靶向系统中实现减毒，同时在生产系统中维持野生型水平的生长。miRNA靶向还可用于提升科研用病毒的生物安全性，通过限制病毒在某一物种（e.g. 人类）中的传播，同时保持其在其他宿主中的传播能力22。最后，通过分离病毒的生长特性，miRNA靶向技术还可实现对病毒生命周期的深入分析，以及对致病和免疫过程中特定细胞类型作用的精细研究23,24,25,26。
该技术提供了一种易于实施且适用于所有病毒系统的替代性靶向方法。此外，随着在特定细胞类型中具有差异表达模式的成熟微小RNA（microRNA）种类不断增多，该技术展现出高度的灵活性。基于微小RNA的靶向策略已在多种病毒系统中证明有效，且不会影响病毒系统的正常功能。该技术的主要局限性包括需要通过试错进行优化、可能出现逃逸突变以及对内源性转录本产生潜在的脱靶效应。然而，这些局限性通常可通过优化并合理设计响应元件加以克服。由于基因组具有正义链取向，并且在完全位于细胞质内的复制周期中可被微小RNA调控机制所接触，正义链RNA病毒对该靶向策略尤为敏感。本文介绍了一种构建微小RNA靶向的肠道病毒以及验证其靶向效率与特异性的实验方案 体外

<table><tbody><tr><td>编码限制性内切酶的寡核苷酸</td><td>IDT</td><td>PAGE纯化的Ultramer</td><td>由研究人员设计的序列</td></tr><tr><td>编码独特限制性位点的寡核苷酸</td><td>IDT</td><td>25nM</td><td>由研究人员设计的序列</td></tr><tr><td>Expand高保真PCR试剂盒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>市面上还有许多其他高保真DNA聚合酶PCR试剂盒</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶系统</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>无RNase</td></tr><tr><td>5 M NH&lt;sub&gt;4&lt;sub&gt;乙酸盐</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>包含在MEGAclear试剂盒中</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020转染试剂</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA转染试剂</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml螺口管</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>microRNA模拟物</td><td>Dharmacon</td><td>不同型号</td><td></td></tr><tr><td>MTT细胞增殖检测试剂盒</td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha;感受态细胞</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II载体</td><td>Agilent Technologies</td><td>不同型号（例如212205）</td><td>存在多种带有T7或T3启动子以及不同克隆位点的质粒，可用于克隆和RNA转录。</td></tr></tbody></table>

基于微小rna的肠道病毒嗜性调控

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

在不伴随减毒的情况下实现病毒复制的细胞特异性限制，可促进疫苗开发、基因治疗、溶瘤病毒治疗以及对病毒生物学特性的理解。目前已有多种调控病毒嗜性（tropism）的机制，但这些方法往往具有病毒类别特异性，且许多会导致病毒毒力减弱。此外，包括小RNA病毒（picornaviruses）在内的多种病毒存在基因组尺寸限制，难以容纳某些靶向策略所需的大段外源遗传物质。微小RNA（microRNAs）是一类短链非编码RNA，可通过与信使RNA中的互补靶序列结合，抑制其翻译或加速其降解，从而调控真核细胞中的基因表达。不同细胞具有独特的microRNA表达谱，许多microRNA可作为生物标志物。这种差异性表达模式可用于限制在表达特定microRNA的细胞中进行基因表达，同时在不表达这些microRNA的细胞中维持表达。在调控病毒嗜性的应用中，通常将与特定microRNA互补的序列插入病毒基因组，一般位于3'非编码区，使病毒在存在相应microRNA的细胞中被靶向降解，从而阻断病毒基因的表达和/或复制。microRNA靶向技术理论上可应用于所有病毒载体，且在缺乏相应microRNA的环境中不会影响病毒的复制能力。本文描述了构建microRNA靶向的小RNA病毒以及评估该靶向策略有效性与特异性的实验方法。 体外本方案适用于具有裂解性复制周期且复制迅速的病毒，但通过调整分析时间点及所用的病毒滴定检测方法，可将本方案适用于多种不同的病毒。

表1 代表了小RNA病毒滴定实验的典型结果，并描述了如何计算50%组织培养感染剂量（TCID50）。本文所述的基于microRNA调控病毒嗜性的整体概念示意图如下所示 图1. microRNA 与应答元件在细胞内相互作用时的方向性，应答元件寡核苷酸用于退火和质粒插入的合理设计，以及编码 microRNA 靶向病毒基因组的质粒 DNA 图谱 体外 转录过程如图所示 图2. 图3 显示通过琼脂糖凝胶电泳观察到的不同完整程度的RNA转录本。正确操作并使用无杂质的DNA模板可获得完整转录的RNA，如图3A第2泳道所示。线性化DNA模板中残留的杂质或痕量核酸酶可能导致少量转录异常的RNA和/或降解产物，类似于图3A第3泳道所见。质粒DNA线性化不完全，或DNA中含有大量杂质（如残留乙醇），将导致转录异常及降解产物，如图3A第4和第5泳道所示。 图3 还展示了转染无污染RNA转录本后，Mengovi...

本文介绍了一种通过在小RNA病毒基因组中插入与特定微小RNA互补的序列来调控其嗜性（tropism）的方法。该方案可根据不同病毒生命周期的长度和特性进行相应修改，从而适用于所有不同类别的病毒。

基于微小RNA的肠道病毒嗜性调控

在不伴随减毒的情况下实现病毒复制的细胞特异性限制，可促进疫苗开发、基因治疗、溶瘤病毒治疗以及……

以下实验的总体目标是评估基于 microRNA 的调控在体外对小 RNA 病毒嗜性的效率和特异性。通过制备在其基因组中编码 microRNA 反应元件的小 RNA 病毒来实现这一目标。第二步，利用这些病毒去感染表达或不表达相应 microRNA 的细胞。然后，评估病毒的复制动力学、传播能力及毒性，以确定靶向的效率和特异性。该靶向方法可用于病毒学领域，以提高病毒的安全性、生产效率和应用价值，或促进针对病毒感染相关生物学过程的研究。该技术的主要优势在于对病毒基因组的改造需求极少，并且具有高度的通用性，因为目前已鉴定出大量细胞微小RNA（microRNA）表达特征。开始此操作时，将容许性细胞接种于96孔板中，并加入完全生长培养基。在第1行和第12行加入不含血清且不含病毒的培养基，作为未感染对照。随后，将细胞在37摄氏度下孵育过夜。接下来，用无血清培养基将病毒进行10倍系列稀释，每次稀释总体积为1毫升。在96孔板的第1行和第12行各加入100微升不含病毒的无血清培养基作为对照。将96孔板倾斜，吸去已接种细胞的培养基。随后，将每种病毒稀释液各100微升加入96孔板的8个孔中。将96孔板置于37°C孵育2小时。 2小时后，将培养板倾斜，吸去各孔中的培养基。每孔加入100微升完全培养基，于37摄氏度培养72小时。72小时后，在显微镜下观察各孔，根据是否存在细胞病变效应对每孔判定为阳性或阴性，并计算病毒滴度。 在此步骤中，将细胞接种于12孔组织培养板中用于时间进程实验，使细胞在感染时达到80%至90%的融合度。24小时后，吸除培养基，并通过向每孔加入0.5毫升无血清培养基、轻轻晃动培养板后吸除培养基的方式洗涤细胞。随后，向每孔加入0.5毫升新鲜的无血清培养基。接下来，用无血清培养基稀释病毒储备液。将每种病毒稀释液各100微升加入七个不同的孔中，并在37摄氏度孵育2小时。2小时后，吸去所有孔中的培养基，通过向每个孔中加入0.5毫升完全培养基，轻轻摇动后吸去培养基，重复洗涤两次。随后，向每个孔中加入1毫升完全培养基，并将样品在37摄氏度继续孵育至预定时间点。从每个孔中转移700微升培养基至一个低温冻存管中。用橡胶刮刀轻轻刮过整个孔表面，将细胞刮入剩余的上清液中。接着，将细胞与上清液的混合物转移至含有700微升上清液的相应低温冻存管中。将样品置于-80°C，直至所有样品收集完毕。然后，将样品反复冻融三次。在4°C条件下以1,200 × g离心5分钟，去除细胞碎片，随后对病毒进行滴度测定。在此步骤中，将容许性细胞接种于96孔组织培养板中，使其在转染时达到80%至90%的融合度。随后，将转染试剂恢复至室温。通过在每个孔中混合9 µL无血清培养基、200 nmol的microRNA模拟物原液、0.18 µL增强试剂和0.18 µL转染试剂来配制总混合液，并充分混匀。将混合物在室温下孵育

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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