Name: 和无血清收集无饲养小鼠胚胎干细胞条件培养基的无细胞方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学习在无血清和无饲养层条件下收集小鼠胚胎干细胞条件培养基的方法，用于研究其抗衰老活性并开发治疗衰老相关疾病的无细胞疗法。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）的基础科学研究中心项目（2013R1A1A2060930）和医学研究中心项目（2015R1A5A2009124）资助，上述项目由韩国科技、信息通信及未来规划部提供资金支持。本研究还得到了多伦多病童医院的启动运营资助（H. K. Sung）。我们衷心感谢Laura Barwell和Sarah J. S. Kim在修改本稿件过程中提供的出色帮助，同时感谢Dr. Andras Nagy提供了G4小鼠胚胎干细胞系。

注意：血清和饲养层细胞无CM收集方案的示意图见图1。
1. 材料（MEF 的制备、培养基、培养板和溶液）
<ol>
	<li>准备500 ml用于培养MEF的培养基。在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS，胚胎干细胞级）、50单位/ml青霉素和50 mg/ml链霉素。</li>
	<li>按照既定的常规方案13从胚胎中分离MEF，并在MEF培养基中维持培养。</li>
	<li>准备500 ml用于培养小鼠胚胎干细胞（mESC）的培养基。在DMEM中添加15% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 µM非必需氨基酸（NEAA）、100 µM β-巯基乙醇、100单位/ml白血病抑制因子（LIF）、50单位/ml青霉素和50 mg/ml链霉素。</li>
	<li>通过将5 ml 0.1%明胶溶液涂布于10 cm细胞培养皿中，制备明胶包被的培养板（每1块mESC培养板需准备5块明胶包被板）。室温孵育至少10分钟。</li>
	<li>准备500 ml低血清培养基，用于mESC的无血清培养条件。在低血清培养基中加入1.2 g碳酸氢钠（pH 7.0），并通过0.2 µm瓶顶滤器过滤。</li>
	<li>制备衰老相关β-半乳糖苷酶（SA β-gal）染色液以检测衰老细胞：1 mg/ml X-gal（溶于二甲基甲酰胺DMF）、40 mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液（pH 6.0）、5 mM铁氰化钾、5 mM亚铁氰化钾、150 mM NaCl和2 mM MgCl214。 
	注意：（危险）DMF为有毒且具腐蚀性的溶液。操作时应穿戴个人防护装备（例如，腈类或乳胶手套、实验服和护目镜），并在通风橱中使用。</li>
	<li>准备500 ml用于培养人真皮成纤维细胞（HDF，NHDF-Ad-Der-Fibroblast）的培养基。在DMEM中添加10% FBS、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素。</li>
</ol>
2. 小鼠胚胎干细胞的培养（图1A和2A）
注意：所有步骤均须在细胞培养生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>在15 cm细胞培养皿中，加入20 ml含有10 µg/ml丝裂霉素C的MEF培养基处理MEF细胞。于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
	<li>吸除MEF细胞的培养基，用PBS洗涤细胞三次。加入3 ml胰蛋白酶-EDTA（TE，1×），于37 °C、5% CO2条件下孵育3分钟。3分钟后，加入6 ml MEF培养基中和TE，以300 × g离心3分钟。</li>
	<li>用5 ml MEF培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板测定所得细胞悬液中的细胞数量。将失活的MEF细胞（饲养层）以每10 cm细胞培养皿2 × 106个细胞的密度接种于MEF培养基中。于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	<li>接种饲养层24小时后（次日），将MEF培养基更换为mESC培养基。</li>
	<li>将mESC细胞（G4 F1杂交ES细胞）以每皿2 × 106个细胞的密度接种至饲养层上，并加入mESC培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。 
	注意：使用较低传代次数的mESC细胞时，mESC-CM的抗衰老效应可能更强15-17。本研究所用G4 mESC细胞系由加拿大安大略省多伦多市奥德街25号，西奈山医院Lunenfeld-Tanenbaum研究所Dr. Andras Nagy提供，邮编M5T 3H7。</li>
	<li>保持细胞相对较高的密度，于70–80%汇合状态进行传代。每天更换新鲜的mESC培养基。</li>
</ol>
3. 收集无血清且无饲养层的条件培养基（图1B和2B）
注意：所有步骤均须在细胞培养生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>用 5 ml PBS 清洗 mESC 培养板。加入 1 ml TE（2.5×），在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 3 分钟。3 分钟后，加入 2 ml mESC 培养基中和 TE，并在 300 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>用 5 ml mESC 培养基重悬细胞，将 1 ml 细胞悬液接种至每个明胶包被的培养皿中（1 个 mESC 培养板接种 5 个明胶化培养皿），置于 mESC 培养基中培养。在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养至细胞融合度达到 80–85%。</li>
	<li>用足量 PBS 清洗 mESC（每 10 cm 培养皿使用 8 ml），每次清洗 10 分钟，共清洗三次。在低血清培养基中于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 24 小时。 
	注意：清洗步骤对于防止 FBS 污染至关重要。必须严格遵守孵育时间18,19。</li>
	<li>将 mESC-CM 收集至 50 ml 锥形管中，在 2,500 × g 条件下离心 20 分钟。离心后收集上清液（CM），并通过 0.2 µm 瓶顶滤器过滤。</li>
</ol>
4. 小鼠胚胎干细胞条件培养基（mESC-CM）的作用
注意：通过多种方法验证了 mESC-CM 的作用，例如 SA β-半乳糖苷酶染色实验、细胞周期分析和定量反转录 PCR（qRT-PCR）。
<ol>
	<li>SA β-半乳糖苷酶检测（图3A）
	<ol>
		<li>将人真皮成纤维细胞（HDFs）以每孔2 × 104 个细胞的密度接种于6孔板中，加入HDF培养基，于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
		<li>过夜培养后，弃去一半HDF培养基，分别加入mESC-CM和对照培养基，于37 °C、5% CO2条件下继续培养72小时。对照培养基来源于未接种mESCs的明胶包被培养皿中的无血清培养基（Reduced Serum Media）。</li>
		<li>用足量PBS（每孔6孔板加2 ml）洗涤细胞，每次30秒，共洗两次。加入3.7%多聚甲醛（PFA）进行固定，室温孵育5分钟。 
		注意：（危险）多聚甲醛为有毒且具腐蚀性的溶液，操作时需穿戴个人防护装备（例如，腈类或乳胶手套、实验服和护目镜），并在通风橱中操作。</li>
		<li>吸除固定液，按照步骤4.1.3所述方法，用PBS洗涤固定后的细胞两次。</li>
		<li>每孔加入1–2 ml SA β-半乳糖苷酶染色液，于37 °C孵育17.5小时。 
		注意：不可在含CO2的培养箱中孵育。</li>
		<li>吸除SA β-半乳糖苷酶染色液，按照步骤4.1.3所述方法，用PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入伊红溶液进行复染，室温孵育5分钟，再按照步骤4.1.3所述方法，用PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>使用光学显微镜在100倍放大下观察细胞，并通过连接的数码相机采集图像以供后续分析。 
		注意：可采用盲法计数总细胞数，并计算SA β-半乳糖苷酶阳性蓝色细胞所占百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞周期分析（图3B）
	<ol>
		<li>将HDFs以每6 cm细胞培养皿8 × 104 个细胞的密度接种于HDF培养基中，于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
		<li>过夜培养后，弃去一半HDF培养基，分别加入mESC-CM和对照培养基，于37 °C、5% CO2条件下继续培养24小时。</li>
		<li>按照步骤3.1所述方法进行胰酶消化，300 × g离心5分钟。用冷PBS溶液（含0.5 mM CaCl2和2% FBS的PBS，每1.5 ml离心管加1 ml）洗涤细胞两次，每次2,500 × g离心3分钟。最后将细胞重悬于100 µl冷PBS溶液中。</li>
		<li>在涡旋振荡的同时逐滴加入200 µl冷乙醇以固定细胞，4 °C保存至少1小时。</li>
		<li>按照步骤4.2.3所述方法，用冷PBS溶液洗涤细胞两次。</li>
		<li>将细胞重悬于250 µl含50 µg/ml RNase的柠檬酸钠缓冲液（1.12%，pH 8.5）中，37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>加入250 µl含50 µg/ml碘化丙啶的柠檬酸钠缓冲液，室温孵育20分钟。</li>
		<li>使用流式细胞术20检测每个样品中的10,000个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>qRT-PCR（图3C）
	<ol>
		<li>按照步骤4.1.1和4.1.2所述方法接种HDFs并加入mESC-CM。</li>
		<li>根据试剂盒说明书，使用RNA提取试剂盒从HDFs中提取总RNA，并使用分光光度计21对提取的总RNA进行定量。</li>
		<li>根据制造商说明书20，将1 µg总RNA加入含oligo (dT)引物和M-MLV逆转录酶的20 µl反应体系中，合成cDNA。</li>
		<li>使用Green PCR预混液和特异性基因引物（补充表1），在实时荧光定量PCR仪上检测cDNA扩增情况。以GAPDH表达水平作为内参进行数据归一化。PCR程序如下：95 °C预变性10分钟；95 °C 15秒、55 °C 20秒、72 °C 35秒，共45个循环；熔解曲线阶段：95 °C 15秒、60 °C 1分钟、95 °C 30秒、60 °C 5秒15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
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<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li>
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<li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+enrichment+and+analysis%3A+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li>
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<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了成功收集无血清且无饲养层的mESC-CM，应考虑以下建议。最关键的因素是使用早期传代的mESC来收集mESC-CM。此前已有研究表明，与晚期传代的mESC相比，早期传代的mESC-CM具有更佳的抗衰老效果。已有报道指出，mESC的传代次数会影响其发育潜能16和多能性17。
尽管仍需进一步研究以分析mESC分泌组中诱导抗衰老效应的具体因子，但目前我们可以得出结论：mESC-CM足以在细胞水平上降低衰老程度。
鉴定能够将衰老细胞逆转为年轻细胞的小鼠胚胎干细胞（mESC）特异性分泌因子，对未来的研究至关重要。对于分泌分子的高质量分析（如抗体芯片15和分泌组分析），在培养基收集过程中的洗涤步骤（步骤3）尤为关键。若洗涤步骤操作不当，分泌分子将被胎牛血清（FBS）成分污染18,19。
在无血清且无饲养层的培养条件下，孵育时间（24小时）对于培养基收集过程（步骤3）非常关键，因为更长的孵育时间...

本实验方案的目的是从无血清且无饲养层的培养条件下收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM），并对其生物学功能进行表征。
一般来说，由于胚胎干细胞（ESCs）具有多能性和自我更新能力，因此在再生医学和细胞治疗方面具有巨大潜力1-3。然而，干细胞的直接移植存在多种局限性，例如免疫排斥和肿瘤形成4,5。因此，无细胞治疗方法可能为再生医学和抗衰老干预提供一种替代性治疗策略6,7。
衰老被视为组织和器官老化的细胞对应状态，其特征是永久性的生长停滞、细胞生理状态改变以及行为变化。老化是多种常见疾病的主要风险因素，包括癌症、心血管疾病、2型糖尿病和神经退行性疾病8。老化的一个显著特征是组织再生潜能的下降，这由干细胞的老化和耗竭所导致9。许多重要研究表明，某些药物分子（如雷帕霉素9、白藜芦醇10和二甲双胍11）以及血液中的系统性因子（即GDF1112）具有持续延缓老化进程并延长寿命的能力。
在本研究中，收集小鼠胚胎干细胞条件培养基（mESC-CM）时未使用血清（胎牛血清，FBS）和饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs），以排除血清因子及MEFs分泌因子的污染。这些条件使得能够获得无血清且无饲养层的条件培养基，从而准确定位小鼠胚胎干细胞特异性的分泌因子。
本方案效率高、成本相对较低且易于操作。该技术有助于阐明小鼠胚胎干细胞衍生的可溶性因子的特性，这些因子可介导抗衰老效应，未来或可用于开发安全且具有潜在优势的无细胞治疗方法，以干预衰老相关疾病及其他再生医学治疗。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20%，胚胎干细胞级</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 单位/ml 青霉素和 50&amp;nbsp;mg/ml 链霉素</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>#25030</td><td>2&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&amp;nbsp;&amp;micro;M</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&amp;nbsp;&amp;micro;M</td></tr><tr><td>白血病抑制因子&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 单位/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>3.70%</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>丝裂霉素 C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>碘化丙啶&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR 主混合液&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDFs，NHDF-Ad-Der-成纤维细胞&amp;nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器</td><td>Corning</td><td>#430513</td><td>0.2 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

无血清无饲养层小鼠胚胎干细胞条件培养基的收集：一种无细胞方法

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）具有生成多种细胞类型的潜能，这为再生医学领域开辟了新的途径。然而，尽管这些细胞具有诸多优势，ESCs 和 iPSCs 的致瘤性长期以来一直是其临床应用的主要障碍。有趣的是，已有研究表明，ESCs 可分泌多种可溶性因子，能够促进组织再生并延缓细胞衰老，提示 ESCs 和 iPSCs 也可作为无细胞干预手段加以利用。因此，如何获得小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM），同时最大限度减少血清成分（胎牛血清，FBS）和饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）的污染，已成为迫切需求。本文展示了一种在无血清且无饲养层条件下收集 mESC-CM 的优化方法，并利用与细胞衰老相关的多种检测指标对 mESC-CM 进行表征。该实验方案将提供一种在无血清和无饲养层污染的情况下，纯化收集 mESC 特异性分泌因子的方法。

最初，小鼠胚胎干细胞（mESCs）在含有胎牛血清（FBS）及其他补充成分的mESC培养基中，以MEF饲养层进行维持培养（图1A 和 图2A）。条件培养基（CM）则从小鼠胚胎干细胞在无饲养层、无FBS及其他补充成分的低血清培养基中收集获得（图1B 和 图2B）。该培养条件使我们能够收集到特异来源于mESCs的条件培养基，避免了饲养层、FBS或其他补充成分所释放因子的潜在污染。对照培养基则在相同培养条件下但不含有mESCs的情况下收集。 
mESCs 在两种培养基中的形态有所不同：i）正常 mESC 培养条件（图 2A）和 ii）无血清且无饲养层的培养条件（图 2B）。在正常 mESC 培养条件下，mESC 克隆生长于 MEF 层上，呈椭圆形且具有光泽的外...

本方案提供了一种在无血清（胎牛血清，FBS）和无饲养层（小鼠胚胎成纤维细胞，MEFs）条件下，收集小鼠胚胎干细胞（mESC）条件培养基（mESC-CM）的方法，可用于无细胞治疗策略。该方法可能适用于衰老及与衰老相关疾病的治疗。

胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）具有生成多种细胞类型的潜能，这为该领域开辟了新的研究途径……

本实验方案的总体目标是在无血清且无饲养层的培养条件下，收集小鼠胚胎干细胞的条件培养基，并表征该培养基的生物学功能。该方法有助于揭示小鼠胚胎干细胞分泌的可溶性因子在抗衰老方面的活性，为开发安全、无细胞参与的年龄相关疾病治疗策略提供依据。本实验操作将由本实验室的研究教授Dr. Yun-Ui Bae进行示范。在生物安全柜中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用20毫升添加了丝裂霉素C的MEF培养基处理小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养物，培养时间为2小时，培养容器为15厘米细胞培养皿。孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次，并加入3毫升胰蛋白酶-EDTA，在37摄氏度下消化3分钟以使细胞脱落。当细胞从培养皿底部脱落时，加入6毫升新鲜MEF培养基以中和胰蛋白酶活性。离心收集细胞后，将沉淀重悬于5毫升MEF培养基中，并在新鲜MEF培养基中，每10厘米培养皿接种2×10⁶个失活的MEF细胞。将饲养层细胞培养24小时，随后将MEF培养基更换为小鼠胚胎干细胞培养基，并接种2×10⁶个小鼠胚胎干细胞至饲养层细胞上，共培养至少48小时。在生物安全柜中，用五毫升 PBS 冲洗一皿小鼠胚胎干细胞，并按前述方法用胰蛋白酶加 EDTA 消化使细胞脱离。离心收集细胞后，将干细胞沉淀重悬于五毫升新鲜干细胞培养基中，每皿接种一毫升细胞至五皿经明胶包被的细胞培养皿中，培养基为新鲜的胚胎干细胞培养基。将细胞放回培养箱中培养，直至细胞融合度达到 80–85%。然后每孔加入至少8毫升PBS，洗涤三次，每次10分钟，随后在低血清培养基中孵育24小时。不超过24小时后，将上清液转移至50毫升锥形管中进行离心。接着通过0.2微米的瓶顶滤器过滤。为了通过衰老相关β-半乳糖苷酶检测来测试胚胎干细胞条件培养基的作用，将人皮肤成纤维细胞接种于六孔板中，并使用人皮肤成纤维细胞培养基进行培养。在37°C、5%二氧化碳条件下过夜孵育后，将每孔培养基的一半更换为新鲜的小鼠胚胎干细胞条件培养基，继续培养72小时。在培养的第三天，每孔使用2毫升PBS清洗细胞，重复两次，每次30秒。然后，在通风橱中，于室温下用3.7%多聚甲醛固定细胞5分钟。固定后，用2毫升PBS洗涤细胞两次，方法如前所述；随后在37°C、无二氧化碳条件下，加入1至2毫升SA-β-gal溶液对细胞进行标记，孵育17.5小时。染色结束后，再次用PBS洗涤细胞两次，方法同前。然后，在室温下用伊红复染5分钟。再次用PBS洗涤后，通过光学显微镜以100倍放大倍数观察细胞。进行细胞周期分析时，将8 × 10⁴个人类皮肤成纤维细胞接种于六厘米细胞培养皿中，每孔加入新鲜的人类皮肤成纤维细胞培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下过夜培养。第二天早上，用小鼠胚胎干细胞条件培养基更换一半的培养基，然后将细胞放回培养箱。24小时后，用胰蛋白酶-EDTA消化法收集细胞，随后用1毫升PBS溶液洗涤两次。第二次洗涤后，将细胞沉淀重悬于100微升冷PBS溶液中。然后，在涡旋振荡的同时逐滴加入200微升预冷的乙醇固定细胞。将细胞在4摄氏度下保存至少一小时。随后，用新鲜的PBS溶液洗涤细胞。第二次离心后，将沉淀用250 µL含有RNase的柠檬酸钠缓冲液在37°C、无二氧化碳条件下处理30分钟。孵育结束后，用250 µL含碘化丙啶的柠檬酸钠缓冲液对细胞进行标记，孵育20分钟。随后，通过流式细胞术分析每个样本的细胞周期各时相。对于定量逆转录PCR分析，根据试剂盒制造商的说明书，使用RNA提取试剂盒从经小鼠胚胎干细胞条件培养基处理的人真皮成纤维细胞中分离总RNA。使用分光光度计对提取的总RNA进行定量。然后，根据制造商的说明书，配制含有寡聚脱氧胸苷引物和M-MLV逆转录酶的反应混合液。然后将一微克总RNA加入含有反应混合物的PCR管中。最后，使用绿色PCR预混液和相应的基因引物，通过实时PCR仪检测cDNA的扩增情况。在MEF饲养层细胞上、于正常小鼠胚胎干细胞培养条件下培养的小鼠胚胎干细胞呈椭圆形，表面有光泽。在无血清且无饲养层的培养条件下生长的小鼠胚胎干细胞表现出扁平且不规则的形态。用小鼠胚胎干细胞条件培养基处理衰老的人皮肤成纤维细胞，可减少与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量。此外，对这些细胞进行的细胞周期分析显示，经小鼠胚胎干细胞条件培养基处理后，处于S期和G2/M期的细胞数量显著增加，而处于G0/G1期的细胞数量减少。此外，小鼠胚胎干细胞条件培养基处理可降低与衰老相关的基因以及与衰老表型相关的分泌性细胞因子的表达。在进行该操作时，必须注意在24小时后收集无血清且无饲养层的培养基，因为长时间孵育会因营养缺乏而增加细胞自溶或凋亡的风险。观看本视频后，您应能够充分掌握如何收集无血清且无饲养层的小鼠胚胎干细胞条件培养基，以用于无细胞体系的研究方法。请注意，使用如多聚甲醛等试剂可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作该试剂。

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和无血清收集无饲养小鼠胚胎干细胞条件培养基的无细胞方法

小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的质量取决于合适的小鼠品系，例如 CF-1。来源于这些细胞的具有多能性支持能力的 MEFs 及其条件培养基（CM）应含有适量浓度的 Activin A、Gremlin 和 Tgfβ1，以协同维持 Activin/Nodal 和 FGF...

适用于培养人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞的制备

本视频介绍了一种从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞的方法。该方案包括在含有特定小分子抑制剂的培养基中培养干细胞，以促进干细胞的增殖并聚集形成拟胚体（EB）。随后，使用酶消化法将拟胚体解离，并接种至包被有黏附蛋白的培养板孔中，以促进其向皮层中间神经元前体细胞分化。...

从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

用于胚胎培养的血清含有未知成分，可能影响实验结果，尤其是在涉及信号相互作用的研究中。本文采用无血清加氧培养系统，证明了中期妊娠小鼠胚胎在培养16–40小时后 表现出与正在发育的胚胎相当的形态发育 在子宫内.

无血清全胚胎培养系统中的小鼠胚胎发育

小鼠胚胎干细胞可通过 OP9-DL1 共培养系统在体外分化为 T 细胞。in vitro...

T细胞的制备 体外 从小鼠胚胎干细胞

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

蛋白质通常包含多个可发挥不同细胞功能的结构域。基因敲除（KO）无法考虑这种功能多样性。本文中，我们报道了一种基于重组介导的盒式交换（RMCE）的结构-功能研究方法，该方法应用于基因敲除的胚胎干细胞，可实现对蛋白质不同功能结构域或变异体的分子解析。...

利用重组酶介导的盒式交换在小鼠胚胎干细胞中进行结构-功能研究

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。...

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外...

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

我们详细描述了两种基于化学方法培养小鼠胚胎干细胞的方案。这种新方法利用了促进Tet介导的氧化（通过维生素C）和抑制的协同机制 从头合成...

使用MEK抑制剂PD0325901和维生素C维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代性培养方法

本文介绍了进行 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 的方法，包括用于下一代测序的文库构建，以在胚胎干细胞中生成全基因组表观遗传学和染色质相关 RNA...

CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

学习在无血清和无饲养层条件下收集小鼠胚胎干细胞条件培养基的方法，用于研究其抗衰老活性并开发治疗衰老相关疾病的无细胞疗法。

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