无血清无饲养层小鼠胚胎干细胞条件培养基的收集：一种无细胞方法

本实验方案的总体目标是在无血清且无饲养层的培养条件下，收集小鼠胚胎干细胞的条件培养基，并表征该培养基的生物学功能。该方法有助于揭示小鼠胚胎干细胞分泌的可溶性因子在抗衰老方面的活性，为开发安全、无细胞参与的年龄相关疾病治疗策略提供依据。本实验操作将由本实验室的研究教授Dr. Yun-Ui Bae进行示范。

在生物安全柜中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用20毫升添加了丝裂霉素C的MEF培养基处理小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养物，培养时间为2小时，培养容器为15厘米细胞培养皿。孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次，并加入3毫升胰蛋白酶-EDTA，在37摄氏度下消化3分钟以使细胞脱落。当细胞从培养皿底部脱落时，加入6毫升新鲜MEF培养基以中和胰蛋白酶活性。

离心收集细胞后，将沉淀重悬于5毫升MEF培养基中，并在新鲜MEF培养基中，每10厘米培养皿接种2×10⁶个失活的MEF细胞。将饲养层细胞培养24小时，随后将MEF培养基更换为小鼠胚胎干细胞培养基，并接种2×10⁶个小鼠胚胎干细胞至饲养层细胞上，共培养至少48小时。

在生物安全柜中，用五毫升 PBS 冲洗一皿小鼠胚胎干细胞，并按前述方法用胰蛋白酶加 EDTA 消化使细胞脱离。离心收集细胞后，将干细胞沉淀重悬于五毫升新鲜干细胞培养基中，每皿接种一毫升细胞至五皿经明胶包被的细胞培养皿中，培养基为新鲜的胚胎干细胞培养基。将细胞放回培养箱中培养，直至细胞融合度达到 80–85%。

然后每孔加入至少8毫升PBS，洗涤三次，每次10分钟，随后在低血清培养基中孵育24小时。不超过24小时后，将上清液转移至50毫升锥形管中进行离心。接着通过0.2微米的瓶顶滤器过滤。

为了通过衰老相关β-半乳糖苷酶检测来测试胚胎干细胞条件培养基的作用，将人皮肤成纤维细胞接种于六孔板中，并使用人皮肤成纤维细胞培养基进行培养。在37°C、5%二氧化碳条件下过夜孵育后，将每孔培养基的一半更换为新鲜的小鼠胚胎干细胞条件培养基，继续培养72小时。在培养的第三天，每孔使用2毫升PBS清洗细胞，重复两次，每次30秒。

然后，在通风橱中，于室温下用3.7%多聚甲醛固定细胞5分钟。固定后，用2毫升PBS洗涤细胞两次，方法如前所述；随后在37°C、无二氧化碳条件下，加入1至2毫升SA-β-gal溶液对细胞进行标记，孵育17.5小时。染色结束后，再次用PBS洗涤细胞两次，方法同前。

然后，在室温下用伊红复染5分钟。再次用PBS洗涤后，通过光学显微镜以100倍放大倍数观察细胞。进行细胞周期分析时，将8 × 10⁴个人类皮肤成纤维细胞接种于六厘米细胞培养皿中，每孔加入新鲜的人类皮肤成纤维细胞培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下过夜培养。

第二天早上，用小鼠胚胎干细胞条件培养基更换一半的培养基，然后将细胞放回培养箱。24小时后，用胰蛋白酶-EDTA消化法收集细胞，随后用1毫升PBS溶液洗涤两次。第二次洗涤后，将细胞沉淀重悬于100微升冷PBS溶液中。

然后，在涡旋振荡的同时逐滴加入200微升预冷的乙醇固定细胞。将细胞在4摄氏度下保存至少一小时。随后，用新鲜的PBS溶液洗涤细胞。

第二次离心后，将沉淀用250 µL含有RNase的柠檬酸钠缓冲液在37°C、无二氧化碳条件下处理30分钟。孵育结束后，用250 µL含碘化丙啶的柠檬酸钠缓冲液对细胞进行标记，孵育20分钟。随后，通过流式细胞术分析每个样本的细胞周期各时相。

对于定量逆转录PCR分析，根据试剂盒制造商的说明书，使用RNA提取试剂盒从经小鼠胚胎干细胞条件培养基处理的人真皮成纤维细胞中分离总RNA。使用分光光度计对提取的总RNA进行定量。然后，根据制造商的说明书，配制含有寡聚脱氧胸苷引物和M-MLV逆转录酶的反应混合液。

然后将一微克总RNA加入含有反应混合物的PCR管中。最后，使用绿色PCR预混液和相应的基因引物，通过实时PCR仪检测cDNA的扩增情况。在MEF饲养层细胞上、于正常小鼠胚胎干细胞培养条件下培养的小鼠胚胎干细胞呈椭圆形，表面有光泽。

在无血清且无饲养层的培养条件下生长的小鼠胚胎干细胞表现出扁平且不规则的形态。用小鼠胚胎干细胞条件培养基处理衰老的人皮肤成纤维细胞，可减少与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量。此外，对这些细胞进行的细胞周期分析显示，经小鼠胚胎干细胞条件培养基处理后，处于S期和G2/M期的细胞数量显著增加，而处于G0/G1期的细胞数量减少。

此外，小鼠胚胎干细胞条件培养基处理可降低与衰老相关的基因以及与衰老表型相关的分泌性细胞因子的表达。在进行该操作时，必须注意在24小时后收集无血清且无饲养层的培养基，因为长时间孵育会因营养缺乏而增加细胞自溶或凋亡的风险。观看本视频后，您应能够充分掌握如何收集无血清且无饲养层的小鼠胚胎干细胞条件培养基，以用于无细胞体系的研究方法。

请注意，使用如多聚甲醛等试剂可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作该试剂。