人子宫颈管γδ T细胞的分离与流式细胞术分析

本实验的总体目标是从人子宫颈管刷取样本中分离并鉴定一种非常规的上皮内细胞——γδ T细胞群体。该方法有助于解答关于子宫颈管上皮内免疫事件的关键科学问题，从而为设计有效的感染预防策略提供支持。该技术的主要优势在于，它为体外研究子宫颈管上皮内的γδ T淋巴细胞提供了一种强大且高效的工具。

本实验操作将由我实验室的高级研究助理 Laura Romero 演示。采集后立即将含有细胞刷的试管置于冰上。采集后一小时内，对含有细胞刷的试管进行涡旋振荡，每次10秒，共4次脉冲。

然后，离心试管，并小心取出刷子，避免扰动细胞沉淀。接着，向细胞中加入1毫升IMDM培养基，将试管置于冰上。将细胞刷置于50毫升锥形管中的100毫米细胞筛上，用20毫升新鲜IMDM培养基冲洗刷子。

离心洗涤液。用1毫升新鲜IMDM重悬沉淀，并与原细胞刷收集管中的细胞合并。为通过流式细胞术分析宫颈管细胞，将1至3 × 10⁵个细胞分装至每支5毫升管中，每管含100 µL FACS缓冲液，在4°C避光条件下孵育30分钟，加入目标抗体和活性染料对细胞进行标记。

孵育结束后，用一毫升试剂盒缓冲液洗涤细胞。离心后彻底弃去上清液。使用磁珠和相应的IgG同型对照抗体设置补偿对照。

然后，加载第一个样本管，并在前向散射与侧向散射散点图中对全部宫颈管细胞群体设置门控，随后排除细胞双联体。根据活率染料的表达情况排除死细胞，对活的CD45阳性及CD3阳性细胞进行门控。γδ1和γδ2阳性细胞定义为表达γδ T细胞受体（TCR）的CD3阳性细胞亚群。

采用磁珠分离法分离γδ T细胞时，将最多1×10⁷个 freshly harvested的宫颈管细胞重悬于40 µL TCR γδ MicroBead试剂盒缓冲液中。按照试剂盒提供的两步染色方案说明书，先用抗TCR γδ半抗原抗体标记细胞，随后加入FITC偶联的抗半抗原MicroBeads，在4至8°C条件下孵育15分钟。孵育结束后，用1 mL试剂盒缓冲液洗涤细胞，并彻底弃去上清液。

将细胞重悬于500微升试剂盒缓冲液中，并将细胞悬液直接加入置于适当分离磁铁中的磁珠柱上，用新离心管收集流穿液。当所有细胞均流过柱子后，用500微升新鲜缓冲液洗涤柱子三次，并将洗涤液与收集的细胞合并。为收集γδ T细胞，将柱子转移至一个锥形管中，使用柱塞以1毫升新鲜缓冲液将T细胞从柱子中冲洗下来。

通过荧光激活细胞分选法分离γδ T细胞时，使用活力染料对细胞进行标记，抗体组合如前所述。随后，根据细胞的活力染料以及CD45、CD3和γδ阳性表达情况进行分选。在人子宫颈管细胞样本中，可轻松检测到一群独特的表达γδ V1的T细胞。

对门控的CD3阳性且γδ1阳性细胞进行详细的表型分析显示，这些细胞大多数为CD4阴性和CD8阴性。如前所示，通过磁珠分选法分离宫颈管细胞，可获得纯度接近98%的TCR γδ细胞群体。该纯度水平也可通过荧光激活细胞分选实现，从而验证了这两种技术均可用于分离宫颈管γδ T细胞。

有趣的是，对从女性 HIV 感染患者和健康供体对照中分离的宫颈管上皮内细胞、γδ T 细胞进行分析，结果显示 HIV 感染个体中这些重要细胞的数量和活力略有下降。若操作得当，掌握该技术后可在两到三小时内完成。在进行该操作时，需注意尽快处理样本，并在整个操作过程中将细胞保持在冰上，以维持良好的细胞活力。

通过该操作步骤，还可结合其他方法，例如单细胞分选联合高灵敏度通量多重PCR，以进一步探究子宫颈管上皮内 compartment 中的炎症反应和信号通路相关问题。该技术建立后，为艾滋病病毒（HIV）及传染病领域的研究人员探索黏膜易感性的新型细胞标志物提供了重要基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人子宫颈管刷取样本中制备上皮内淋巴细胞。