Name: 原位金属氧化物纳米粒子的核探针检测与单细胞定量研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 学习利用核微探针分析技术原位检测金属氧化物纳米粒子，实现单细胞水平的化学元素定量分析。该方法可减少成像伪影，为纳米粒子毒理学研究提供精确的定量数据。

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我们感谢 Serge Borderes 对视频的执导与剪辑。法国国家科研署支持 TITANIUMS 研究项目（ANR CES 2010，编号&#176; CESA 009 01）。法国国家科学研究中心（CNRS）和欧洲共同体作为整合性活动，通过欧盟合同编号&#176; 227012。本工作得到了玛丽·居里行动—初始培训网络（ITN）的支持，作为“支持研究生在工业界实习及培训卓越的整合性活动”（SPRITE，D1.3）的一部分，欧盟合同编号为317169。C'NANO Grand Sud Ouest 和阿基坦大区支持了 TOX-NANO 研究项目（n&#176;20111201003）和研究项目 POPRA（n&#176; 14006636-034).

1. 样品 holder 的制备
<ol>
	<li>样品 holder 的设计与制备
	<ol>
		<li>通过在1 mm厚的PEEK框架上钻出一个5 mm × 5 mm的方孔来制造样品holder。</li>
		<li>用70%（v/v）乙醇冲洗清洗，并置于无菌培养板中，待用。 
		注：需要一种适用于细胞培养和细胞操作的样品holder。该holder需适用于细胞培养、体外光学显微镜观察以及核微探针分析与成像。此holder由PEEK框架制成13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品 holder 的准备
	<ol>
		<li>通过将1 mg的Formvar粉末溶解于100 mL氯仿中，制备Formvar溶液。</li>
		<li>将聚碳酸酯薄膜拉伸在金属框架上，确保无褶皱。</li>
		<li>使用无菌枪头将Formvar溶液均匀涂布于样品holder的孔周围。</li>
		<li>小心地将样品holder用胶水粘附到已拉伸的聚碳酸酯薄膜上（5 mm × 5 mm方块）。</li>
		<li>重复上述步骤，为每个重复样品制备一个样品holder。 
		注：聚碳酸酯（PC）薄膜具有生物相容性，足够厚且能耐受各种实验流程和分析条件。 
		注意—氯仿有毒。避免吸入、摄入或皮肤接触。务必在通风良好的化学通风橱中操作，并使用适当的过滤装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品 holder 的灭菌
	<ol>
		<li>将组装好的样品holder放入锥形瓶中，加入50 mL 70%（v/v）乙醇，在37 °C、180 rpm条件下于培养振荡器中振荡过夜。</li>
		<li>用无菌蒸馏水多次冲洗holder。</li>
		<li>在无菌条件下自然晾干，并在生物安全柜（II级）的杀菌紫外灯下每面照射30分钟。</li>
		<li>将样品保存在无菌的12孔板中（每孔放置一个样品holder），待用。 
		注意：多个样品holder可在室温下密封于Parafilm膜的无菌干燥12孔板中保存数天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在适当的样品 holder 中培养细胞。
注意：必须在生物安全型层流工作台（II级）中进行本方案，以排除污染性微生物。操作抗生素（例如青霉素、链霉素）时需佩戴手套。处理生物材料（细胞系、基因修饰来源的人类细胞）时应遵循最佳操作规范。
关键： 应检测所使用的细胞系，以确保其未被支原体（Mycoplasma）感染。
<ol>
	<li>使用制造商提供的转染方案，将携带 Matrix-roGFP 质粒的 U2OS 细胞系进行转染17,18,19。</li>
	<li>为确认质粒携带的生物传感器成功转染并防止质粒丢失，需在适当的培养基中对转染细胞进行筛选和维持培养。</li>
	<li>通过荧光显微镜观察转染细胞，以确认转染成功，并验证荧光表达以及线粒体呈现网状和管状网络结构19。 
	暂停点：细胞可在液氮中冷冻保存数年。</li>
	<li>将转染后的细胞群体在适当的培养基中培养，以获得亚融合状态的细胞群体。在 37 °C、5% (v/v) CO2 及饱和湿度条件下培养细胞。</li>
	<li>接种细胞时调整浓度，使其在固定当天达到约 80% 的融合度。通常可使用每 µL 500 个细胞的浓度。用 400 µL 的 0.25% (v/v) 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，37 °C 孵育 3 分钟，随后加入 1 mL 培养基终止胰蛋白酶反应。在 230 × g、+4 °C 条件下离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，并加入适量新鲜培养基重悬细胞。 
	注意：本方案适用于所有类型的细胞，接种细胞数量应根据细胞大小和倍增时间进行调整。 
	注意事项：避免胰蛋白酶、抗生素和血清反复冻融。保持无菌状态，将储存液分装成小份，于 −20 °C 冻存，并在有效期内使用。清洗细胞沉淀时应小心彻底，以完全去除残留的胰蛋白酶。残留的微量胰蛋白酶会延缓并降低细胞贴壁效率。</li>
	<li>计数细胞，并用预热至 37 °C 的新鲜完全培养基稀释，制备成每 µL 含 500 个细胞的细胞悬液。 
	注意：细胞悬液的浓度需根据细胞类型进行调整，以便接种 40 µL 液滴。</li>
	<li>将 40 µL 细胞悬液滴加至聚碳酸酯膜的中心位置，小心地将样品置于 +37 °C、5% (v/v) CO2 及饱和湿度条件下孵育 2 小时。 
	关键步骤：样品放入培养箱后，应尽可能减少机械扰动，以促进细胞快速贴附。根据细胞类型不同，可能需要超过 2 小时的孵育时间以获得最佳贴壁效率。请确保培养箱内环境充分饱和，防止液滴蒸发。</li>
	<li>使用光学显微镜检查细胞是否已牢固贴附于聚碳酸酯膜上。轻柔加入 2 mL 新鲜完全培养基，继续培养 24 小时。</li>
</ol>
3. 纳米颗粒的制备与暴露
注意：荧光染料修饰的 TiO2 NPs 经设计、合成，并用四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）进行化学修饰。20,21 这种表面修饰可实现纳米颗粒的检测、追踪与定位 原位 和 细胞内 在活细胞和固定细胞中，或在多细胞生物体中。12,13,18
注意：纳米材料和纳米颗粒必须小心处理。避免吸入、食入或与皮肤接触。为防止在空气中扩散，纳米颗粒需保存在溶液（超纯水）中。
<ol>
	<li>在超纯水中制备浓度为 1 mg.mL−1 的TiO2 纳米颗粒悬浮液。使用超声波发生器和专用锥形微探头，在室温下以高强度超声脉冲（750 W，20 kHz，振幅：30%）处理 1 分钟，使 TiO2 纳米颗粒充分分散。</li>
	<li>将 TiO2 纳米颗粒用培养基稀释至所需浓度，以获得终浓度为 4 µg.cm−2 的暴露悬浮液。用含有纳米颗粒的培养基替换细胞原有培养基，并轻轻混匀，使 TiO2 纳米颗粒均匀分布。对照组细胞以相同方式处理，但不添加 TiO2 纳米颗粒。</li>
	<li>将细胞群体在 37 °C、5% (v/v) CO2 及饱和湿度环境中孵育 24 小时。</li>
</ol>
4. 多聚甲醛固定与荧光显微镜观察。
<ol>
	<li>在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中配制新鲜的甲醛溶液（PFA，4% w/v）。
	<ol>
		<li>将4 g PFA粉末溶于100 mL PBS中。在通风橱内，使用磁力搅拌器和磁子，将溶液加热至65 °C并持续搅拌。逐滴加入1 M NaOH，提高pH值，直至溶液变澄清。将溶液冷却至室温，并调节pH至7.4。新鲜配制的溶液应立即使用，或于+4 °C保存并避光。 
		注意： 可使用预制的PFA溶液，但现配的PFA溶液可确保更佳的固定效果及固定样品的长期保存。 
		注意： PFA 具有毒性，避免吸入、食入或与皮肤接触。务必使用正常运作的化学通风橱和适当的过滤器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育时间结束后，移除含有 TiO₂ 的细胞培养基2 纳米颗粒。用新鲜培养基冲洗细胞群体一次，再用 PBS 冲洗一次（2 mL）。移除 PBS，迅速加入一份新鲜且预冷的 PFA（4% w/v，+4 °C）进行冲洗。
	<ol>
		<li>加入PFA（2 mL，4% w/v，+4 °C），室温孵育15分钟。</li>
		<li>去除PFA，在振荡条件下用PBS冲洗细胞（2 mL，3次，每次5分钟）。 
		暂停点： 这些化学固定的样品可用于 &#34;冷冻固定&#34; 荧光成像后进行后续步骤（进入步骤5），或仅用于荧光成像（进入步骤4.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 Hoechst 染色细胞核33342 在 PBS 中孵育细胞 10 分钟。Hoescht33342 终浓度为500 nM。孵育后，移除溶液，并用PBS洗涤。 
	注意： Hoechst33342 具有细胞膜通透性，可能具有毒性。配制和使用 Hoechst 时应避免直接接触，并佩戴手套。33342. 
	关键的: 确保使用 Hoechst33342 染色液需新鲜配制，并保持无菌条件。</li>
	<li>处理固定样品 原位 以及使用荧光显微镜进行单细胞成像（图1).</li>
</ol>
5. &#34;无浸入式冷冻&#34;固定与脱水
<ol>
	<li>将铝制转移板置于液氮中冷却以进行制备。将该转移板存放于装有液氮的容器中，并使转移板表面位于液氮液面之上，处于低温氮气蒸气环境中。 
	注意： 转移板可由任何可冷却至液氮温度并能放入冷冻干燥机样品室的金属板制成（此处使用铝板）。 
	关键步骤： 应尽可能保持容器密闭，以防止水蒸气在冷板表面沉积。制备过程中存放在板上的样品不得被液氮覆盖。</li>
	<li>先用培养基冲洗细胞一次，再用无菌超纯水短暂冲洗两次，以去除残留的任何细胞外盐分。 
	关键步骤： 确保所有培养基均为新鲜配制并保持无菌条件。使用前将所有培养基加热至 37 °C。冲洗过程必须非常短暂（数秒），并尽快去除样品上多余的液体。</li>
	<li>将细胞在液氮冷却的 2-甲基丁烷中于 -150 °C 进行浸入式冷冻 30 秒，随后将其放置于铝制转移板上。在制备其余所有样品期间，将样品暂存于此。当所有样品完成冷冻固定后，将转移板整体转移至冷冻干燥机中。 
	关键步骤： 整个冷冻固定过程不应超过 20 分钟，以防止在转移盒中临时存放的样品发生结构改变。</li>
	<li>按以下程序进行样品冷冻干燥：1）在低压和低温条件下进行初级干燥 12 至 24 小时（-99 °C，10-3 mbar）；然后 2）进行次级干燥阶段，至少持续 24 小时，保持低压的同时将板温升至 +40 °C（+40 °C，10-3 mbar）。 
	警示： 液氮极冷，接触可导致严重冻伤或眼部损伤。运输时应使用合适的台面容器，并佩戴安全防护装备（低温手套、眼部和面部防护）。 
	警示： 2-甲基丁烷极易燃。该物质在 +20 °C 蒸发时可迅速造成空气中有害污染。避免吸入、食入或皮肤接触。使用呼吸防护和眼部防护，以及防护手套。务必在功能正常的化学通风橱中操作。可于 +4 °C 下储存。 
	关键步骤： 使用适当的温度计（可测 -150 °C）在 &#34;浸入式冷冻&#34; 过程中监测 2-甲基丁烷的温度。2-甲基丁烷必须保持在冷却的液态。将冷冻固定的样品转移至常温环境可能导致因温度上升或水蒸气在样品表面冷凝而造成的细胞损伤。因此，转移操作应尽可能迅速（30 秒内完成）。 
	暂停点： 冷冻固定后，样品可在无菌干燥条件下（防尘防潮）于室温保存数天。使用精细镊子小心操作样品，并将其置于用封口膜密封的无菌 12 孔板中。可使用干燥剂以保持内部空气干燥。</li>
</ol>
6. 核微探针分析
注意：核微探针分析在AIFIRA（Applications Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine）的微束线站上进行，采用了互补的离子束分析技术——粒子激发X射线发射（µ-PIXE）和扫描透射离子显微术（µ-STIM）。该装置基于一台3.5 MV的粒子加速器，可提供能量在MeV范围内的轻离子束。22,23
暂停点：AIFIRA 是由波尔多大学主办的离子束设施，在对所提议的实验进行科学评估后，向法国国内及国际研究团队开放使用。
<ol>
	<li>使用双面胶带将PEEK样品架固定在带孔板上。</li>
	<li>将承载样品的样品台置于与光束方向垂直的竖直平面内。</li>
	<li>关闭分析室并抽真空。</li>
	<li>扫描透射离子显微技术（µ-STIM） 
	注意：STIM 用于记录细胞在将能量损失转换为细胞质量后得到的面密度图，该方法利用了能量损失与样品面密度（以 µg·cm⁻² 表示）成正比的特性。-2).
	<ol>
		<li>使用2 MeV的氦（He）离子束+）微束作为探针，其在焦平面上的尺寸直径约为300 nm，且处于低注量率（2000 离子/秒）-1）。使用平面硅探测器（PIPS探测器，25 mm）测量透射离子的能量2，11 keV能量分辨率 @ 5.4 MeV），置于样品后方的束流轴线上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微束粒子激发X射线发射（µ-PIXE）和微束卢瑟福背散射谱学（µ-RBS） 
	注意：µ-PIXE 和 µ-RBS 分析可提供亚微米分辨率下化学元素的空间分布与定量信息。
	<ol>
		<li>使用1.5 MeV质子（H+微束（50–150 pA），聚焦至直径1 µm，对STIM在4至8小时及约100 × 100 µm范围内识别出的相同感兴趣细胞进行扫描2.</li>
		<li>通过位于入射光束轴45°位置的高分辨率Si(Li)固态探测器（能量分辨率为145 eV，@Mn-Kα），收集样品中存在原子（比Na重的元素）所发射的特征X射线光子。利用所检测到的光子能量识别发射源的性质（例如元素的原子序数Z），并通过X射线强度确定元素的浓度。</li>
		<li>在 -135° 方向使用硅探测器（部分耗尽型探测器，25 mm）同时收集背向散射质子2，11 keV FWHM @ 5.4 MeV）来测量入射粒子的总数，并用于X射线强度的归一化。 
		关键的: 用于校准X射线探测器响应，采用一组经认证的原子浓度定量校准标准品。参考物质为沉积在6.3 µm厚Mylar箔上的薄原子膜集合。发射的X射线能量范围为0.6 keV（Li，K线）至20.2 keV（Rh，K线）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用 IBA-J 插件重建化学元素分布图 ImageJ.24 
	注意：已开发出一种作为 ImageJ 插件的专用软件，用于处理原始核微探针分析数据。原始数据对应于粒子束与细胞相互作用产生的事件列表，这些事件按时间顺序记录，并与束流位置信息同步记录。
	<ol>
		<li>使用 IBA-J 插件根据事件类型对数据进行分类：透射离子能量（STIM）、背散射离子能量（RBS）或 X 射线光子能量（PIXE）。然后，分别处理每种类型的数据。</li>
		<li>计算 STIM 区域密度图</li>
		<li>计算平均X射线光子能量谱，并针对每种目标化学元素定义能量窗口，以获取该元素的空间分布。</li>
		<li>定义感兴趣区域（ROI）(例如 单个细胞、致密结构、聚集体 等等。并计算相应的X射线谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析相应的RBS谱，以计算入射粒子的总数25.</li>
	<li>使用 Gupix 软件拟合 X 射线光谱26 以确定每个感兴趣区域（ROI）的元素浓度。 
	注意：该方法的典型检测限（LOD）范围为 1 至 10 µg.g-1 根据元素的原子序数不同，干重也会有所变化（检出限随原子序数Z的增加而降低）。</li>
</ol>

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<li>Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X10006452">The Guelph PIXE software package IV.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).</li>
<li>Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+Dioxide+Nanoparticles+Induce+Endoplasmic+Reticulum+Stress-Mediated+Autophagic+Cell+Death+via+Mitochondria-+Associated+Endoplasmic+Reticulum+Membrane+Disruption+in+Normal+Lung+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells.</a> PLoS ONE. , 1-17 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们介绍一种方法，可提供超越其他成像技术所能获得的信息，尤其在亚细胞水平上具有显著优势。除了成像能力外，核微探针分析还能够对构成生物样品的化学元素进行定量分析。在本研究中，我们考察了人类细胞群体，并聚焦于单个暴露于TiO2纳米颗粒的细胞中特定感兴趣区域的分析。该技术与其他技术的结合，可同时提供细胞形态学成像以及元素化学组成的精确定量数据。
要成功应用核微探针分析，必须遵守以下要点以避免潜在问题。首先，必须采用低温固定方案来固定细胞，以保持其超微结构和生物化学完整性。其次，必须对厚度小于 20 µm 的薄样品进行分析。如有需要，可对冷冻固定的样品进行切片处理。样品必须始终保持冷冻状态。第三，还需注意，核微探针分析呈现的是生物样品的二维图像，因此所获得的化学元素分布为二维投影，可能引起误判。未来通过采用断层扫描采集技术，将有望克服这一局限性。
核微探针分析也存在局限性。必须强调的是，其主要限制在于需要在真空条件下进行分析。因此，必须采用能够保持细胞超微结构和生物化学完整性的细胞固定方案。因而...

细胞稳态由不同微量元素（离子、金属、外源性无机化合物）的摄取调控、同化及细胞内定位所决定。这些成分常以痕量形式存在，但仍可能对系统生理产生显著影响。因此，在正常及病理/应激状态下研究细胞生物化学，是全面理解细胞代谢机制的关键步骤。为此，开发能够检测细胞内化学物质丰度、结构组织及其相关代谢功能的成像与分析技术变得十分必要。目前仅有极少数方法能够提供 原位 关于给定样品整体化学性质的定量信息。除了对块体形态样品进行分析的方法外， 原位 分析在不损失质量与结构信息的前提下，对生物样本进行整体性考察，从而保留其内含的化学物质（微量元素和离子）及蛋白质。此外，随着纳米科学的不断发展，有必要开发更先进的成像与分析方法，以实现细胞尺度下环境监测，观察并量化纳米物体的行为与相互作用。1
纳米颗粒（NPs）被定义为至少在一个维度上尺寸介于1至100 nm之间的物体。2 由于其独特的理化性质，纳米颗粒在工业中被广泛应用。纳米颗粒也被用于生物应用和纳米医学领域。3,4 尽管纳米颗粒具有多种理化特性，但其可能对人类健康和环境产生不良影响的风险。这种风险可能由不同浓度水平下的长期或重复暴露引起，但目前尚未明确证实。5,6,7,8 特别是，纳米颗粒在细胞内的归趋及其引发的细胞反应至今仍未被充分阐明。部分原因在于目前可用于在单个细胞中检测和定量内化纳米颗粒的方法仍然十分有限。9
用于估算纳米颗粒细胞剂量的经典分析工具包括显微技术、质谱法（MS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）10,11以及液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），但这些方法仅能在宏观尺度上提供有用信息。若不采用组分分离方法，它们均无法精确评估亚细胞结构中的纳米颗粒含量或其分布情况。因此，利用这些方法难以系统地进行剂量-效应评估，而基于原子光谱学的方法则具有优势，例如核微探针分析12,13、同步辐射X射线荧光显微技术14和二次离子质谱法（SIMS）15,16。这些方法尤为有价值，因为它们可补充荧光显微镜的观测结果，特别是在纳米颗粒无法用荧光分子标记、因而需以其原始状态进行研究的情况下。即使在纳米颗粒表面接枝了荧光探针的情形下，一方面每个颗粒的标记程度未知，导致定量仍然困难；另一方面，纳米颗粒表面的化学修饰可能改变其在细胞内的分布。
本文重点介绍一种基于核微探针技术组合的方法，旨在对生物样品的主要元素、次要元素和微量元素进行形态学及元素组成成像。
核微探针分析被证明特别适用于生物组织中痕量化学元素的测定。其束斑横向分辨率（0.3至1 µm）和化学元素检测灵敏度（1至10 µg·g⁻¹）均具有显著优势。-1 干质量）非常适合在细胞水平上开展研究。核微探针技术基于检测离子束（通常以兆电子伏特能量运行）与样品中存在原子相互作用后所发射的粒子（光子、电子、离子）。在细胞中发生的相互作用主要包括：1）原子被激发或电离，随后在原子返回基态时发射光子；2）入射粒子发生散射，导致其能量和方向发生变化。通过测量发射粒子的能量，可识别参与相互作用的原子种类。为实现元素分布成像，离子微束会在样品表面反复扫描，通常扫描区域约为100 × 100 µm2 包含多个细胞。检测发射出的粒子，并记录每个束斑位置下粒子的能量。根据束斑位置对粒子进行分类，从而确定产生这些粒子的结构，是数据处理的目标。本文将详细介绍一种基于荧光显微镜与核微探针分析的方法，用于在细胞及亚细胞尺度上检测并定量外源性纳米颗粒（NPs），以研究纳米颗粒与生物系统相互作用所产生的影响。我们将特别关注该方法在以下方面所提供的研究机遇 原位 二氧化钛纳米颗粒（TiO₂）的定量分析2 亚细胞水平的NPs聚集体

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC，LGC 标准品</td><td>ATCC HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>不含L-谷氨酰胺的MCCOY 5A培养基</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>L0211-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Dominique DUTSCHER</td><td>500105U</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;L-谷氨酰胺 200 mM，100 mL&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素，&amp;nbsp; 20 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10092772</td><td></td></tr><tr><td>0.25% (v/v) 胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp; 500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Red</td><td>脂萼</td><td>VR-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-roGFP 质粒</td><td>AddGene</td><td>#49437</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>H3570</td><td>小心操作</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;纳米颗粒制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TiO2 P25 AEROXIDE</td><td>德固赛/赢创</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T3163</td><td>纳米颗粒表面修饰</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;样品制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯箔</td><td>Goodfellow</td><td>CT301020</td><td></td></tr><tr><td>聚醚醚酮支架（PEEK）</td><td>Matechplast</td><td>A-239-4047</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，ACS 级，纯度 99.5%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>02860-6x1L</td><td></td></tr><tr><td>氯仿，无水，99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>372978-1L&amp;nbsp;</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>Formvar 100 g</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1201</td><td>有害。使用浓度为10 &amp;micro;克每毫升氯仿</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;样品固定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粉末，95% 多聚甲醛</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500G</td><td>注意：有毒。使用 PBS 中的 4% 溶液</td></tr><tr><td>PBS（pH 7.4，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>93443</td><td>有害的</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;样品冷冻固定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>液化空气医疗</td><td></td><td>有害的</td></tr><tr><td>甲基丁烷 &gt;=99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>&amp;nbsp;M32631-1L</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>铝制转移板</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸馏去离子水</td><td>自制</td><td></td><td>使用 Barnstead Smart2Pure 系统在实验室中制备</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barnstead Smart2Pure</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50129870</td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MSC-Advantage</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>145-0102SP</td><td></td></tr><tr><td>计数板 2 个孔</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>PIPS探测器，25 mm²，12 keV能量分辨率 @5.5 MeV</td><td>堪培拉&amp;nbsp;</td><td>PD25-12-100AM</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率Si(Li)固态探测器，145 eV能量分辨率（@Mn-K）&amp;alpha;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Everhart-Thornley型二次电子探测器（SED）&amp;nbsp;</td><td>奥赛物理学</td><td>1-SED</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准品 钠或氯化物（以NaCl计）</td><td>微物质</td><td>34381</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准品 镁以氟化镁（MgF2）形式存在</td><td>微尺度物质</td><td>34382</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准 铝作为Al金属</td><td>微物质</td><td>34383</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准硅（以SiO计）</td><td>微尺度物质</td><td>34384</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准 硫以CuSx形式存在</td><td>微尺度物质</td><td>34385</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准品 钙以CaF2形式存在</td><td>微物质</td><td>34387</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准品 钛作为Ti金属</td><td>微物质</td><td>34388</td><td></td></tr><tr><td>XRF校准标准品 铁（以Fe金属形式）</td><td>微物质</td><td>34389</td><td></td></tr><tr><td>750W 超声波破碎仪</td><td>声学材料</td><td>11743619</td><td></td></tr><tr><td>3MM 微型探针</td><td>生物阻断科技</td><td>220-05</td><td></td></tr><tr><td>真空冷冻干燥机</td><td>Elexience</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜 Zeiss AxioObserver Z1</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>431006-9901</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台 xy</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>432031-9902</td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 20X，NA 0.50 Ph2 M27 物镜</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>420351-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63倍，数值孔径1.40，Ph3M27物镜</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>420781-9910</td><td></td></tr><tr><td>蔡司滤光片组 02</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>488002-9901</td><td></td></tr><tr><td>蔡司滤光片组 38HE</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>489038-9901</td><td></td></tr><tr><td>蔡司滤光片组 31</td><td>卡尔·蔡司显微成像有限公司</td><td>000000-1031-350</td><td></td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>Erlab</td><td>Captair SD321</td><td></td></tr><tr><td>粒子加速器</td><td>HVEE</td><td>singletron</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>ImageJ 1.51</td><td></td></tr><tr><td>SimNRA 软件</td><td>马克斯·普朗克研究所&amp;uuml;德国，马克斯·普朗克等离子体物理研究所</td><td>SIMNRA 6.06</td><td></td></tr><tr><td>Gupix 软件</td><td>加拿大圭尔夫大学</td><td>GUPIXWIN 2.2.4</td><td></td></tr></tbody></table>

原位检测与单细胞定量金属氧化物纳米颗粒的核微探针分析方法

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

基于化学元素成像的微区分析技术能够实现细胞水平上化学成分的定位与定量。这些技术为生命系统的表征提供了新的可能性，尤其适用于检测、定位和定量生物样本及环境中金属氧化物纳米颗粒的存在。事实上，这些技术均满足以下关键要求：(i) 灵敏度高（干重范围内从1至10 µg·g-1），(ii) 空间分辨率达到微米量级，(iii) 可进行多元素同时检测。基于这些特点，微束化学元素成像技术可有效补充常规成像技术（如光学显微镜和荧光显微镜）的不足。本实验方案描述了如何对暴露于二氧化钛纳米颗粒的培养细胞（U2OS）进行核微探针分析。细胞必须生长并直接暴露于一种特殊设计的样品 holder 中，该 holder 可用于光学显微镜以及核微探针分析阶段。采用浸入式冷冻固定法对样品进行低温固定，可同时保持细胞结构和化学元素分布的原始状态。在样品上同步开展的核微探针分析（包括扫描透射离子显微术、卢瑟福背散射谱以及粒子激发X射线发射）可提供有关细胞密度、化学元素局部分布以及细胞内纳米颗粒含量的信息。生物学领域对这类分析工具的需求日益增长，尤其是在纳米毒理学和纳米医学迅速发展的背景下，亟需加深对纳米颗粒与生物样本之间相互作用的理解。特别地，由于核微探针分析无需对纳米颗粒进行标记，因此可在细胞群体中独立于其表面状态，实现单个细胞水平上的纳米颗粒丰度定量。

细胞培养及荧光标记TiO的荧光成像2 NPs
我们设计了一种适用于细胞培养、细胞操作以及多模式分析的样品 holder。具体而言，该 holder 需能够支持常规光学显微镜观察以及核微探针分析与成像。此样品 holder 采用沉积在 PEEK 框架上的 2-µm 厚聚碳酸酯膜制成。细胞可直接在聚碳酸酯膜上生长，在无菌培养条件下培养数天后，可用于不同的实验设置，例如纳米颗粒（NPs）暴露实验。
化学表面修饰结合荧光染料（TRITC）实现了对TiO₂的检测2 纳米颗粒（NPs）及其 原位 和 体外 使用荧光显微镜在活细胞或经甲醛固定细胞中进行定位。细胞核和线...

我们描述了一种用于检测存在的化学元素的方法 原位 在人类细胞中以及它们的 体外 定量分析。该方法适用于任何细胞类型，尤其适用于单细胞水平的定量化学分析。 体外 金属氧化物纳米颗粒暴露

基于化学元素成像的微区分析技术能够实现细胞水平上化学成分的定位与定量。

由于具有独特的理化性质，纳米颗粒在工业和医学领域的应用日益广泛。然而，长期暴露于纳米颗粒对人类健康可能带来的风险仍令人担忧。这些风险可通过研究纳米颗粒在细胞内的行为及其诱导的细胞代谢反应来加以量化评估。这在一定程度上是由于缺乏能够在单个细胞水平上检测和定量内化纳米颗粒的方法。尽管已有多种分析工具（包括显微镜和质谱）可用于评估纳米颗粒的细胞摄取，但这些方法仅能在微观层面提供定性信息。相反，基于原子光谱的原位方法可减少样品制备过程中产生的成像伪影，并能实现对纳米颗粒的直接观察。为了利用这一优势，我们提出了一种相关联的方法，可使我们研究处于天然状态或经荧光标记的纳米颗粒。本文描述了一种基于荧光显微镜与核微探针分析相结合的技术。该方法可提供细胞密度、化学元素空间分布以及每个细胞中纳米颗粒数量的图像。作为示范，我们将利用荧光显微镜和核微探针分析，研究细胞在二氧化钛纳米颗粒中暴露24小时后的反应。本实验方案需要使用由聚合物PEEK定制的样品支架，该支架必须适用于细胞培养及体外观察。用两微米厚的聚碳酸酯薄膜覆盖样品台。将聚碳酸酯薄膜用一层薄薄的Formvar溶液粘附到PEEK培养皿上。安装完成后，需要对样品台进行灭菌处理。可将多个无菌样品载体分别存放于无菌的十二孔板中，每孔一个，直至使用时取出。通过荧光显微镜检测转染了基质行GFP质粒的细胞，以确认转染成功并表达荧光蛋白。用胰蛋白酶消化收集细胞，并在37°C下孵育3分钟。通过加入新鲜培养基终止胰蛋白酶作用。在4℃、1200转/分钟条件下离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，加入适量新鲜培养基。计数细胞，并用新鲜且恒温的完全培养基进行稀释，制备成每微升含500个细胞的细胞悬液。取40微升细胞悬液滴加于聚碳酸酯膜的中央。将样本小心放入细胞培养箱中孵育2小时。轻轻加入两毫升新鲜培养基，静置24小时。为实现体外检测、追踪和定位纳米颗粒，设计、合成并接枝了常用荧光染料的荧光双修饰二氧化钛纳米颗粒。此步骤中，应预先配制浓度为每毫升一毫克的二氧化钛纳米颗粒超纯水悬浮液。在室温下使用持续一分钟的高强度超声波脉冲分散纳米颗粒。将纳米颗粒用适当的培养基稀释，制备成每平方厘米含4微克的暴露悬浮液。将原有的细胞培养基更换为含有纳米颗粒的新培养基，并轻轻混匀以实现纳米颗粒的均匀分布。以相同方式制备一组对照细胞，但不添加二氧化钛纳米颗粒。将细胞群体培养24小时。使用多聚甲醛固定这些样品，随后可进行原位和单细胞成像，利用荧光显微镜观察。然而，低温物理固定能够保存细胞的超微结构和生物化学完整性。浸入式冷冻固定可在数毫秒内迅速终止细胞活动，且无需使用固定剂化合物。为实现细胞的低温固定，我们执行以下步骤。通过将铝制转移板置于液氮中冷却来制备。将该板储存在装有液氮的容器中，使板表面位于液面之上，处于低温氮气蒸气中。将足量的2-甲基丁烷冷却至-150摄氏度。准备一

in-situ-detection-single-cell-quantification-metal-oxide

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

原位金属氧化物纳米粒子的核探针检测与单细胞定量研究

在薄层器官和肿瘤组织上进行的激光诱导击穿光谱成功检测到了天然元素以及人工注入的钆（Gd），后者来源于基于钆的纳米颗粒。化学元素成像的空间分辨率达到100...

激光诱导击穿光谱：一种用于组织中纳米颗粒成像与定量的新方法

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

由于钯、金和钴的重要性及其广泛使用...

利用具有纳米级车轮状孔结构的新型传感器/吸附剂从城市矿山中检测和回收钯、金及钴金属

增强暗场显微镜结合光谱成像与光谱图谱分析，能够以高于传统方法的速度和准确性，对组织学样本中的纳米材料进行筛选、定位和鉴定。本文旨在提供在组织学样本中对金属氧化物纳米颗粒进行暗场成像和高光谱图谱分析的方法。...

通过增强暗场显微镜与高光谱成像技术鉴定组织学样本中的金属氧化物纳米颗粒

使用宏观样品来分离电致辅助变形（EAD）中的电学效应和热学效应非常困难。已开发出金属样品的微纳米结构以及定制的测试程序，用于评估施加电流对样品中位错形成及演化的影响，且排除焦耳热的干扰。...

一种新方法 原位 纳米尺度样品的机电性能表征

本文简要概述了美国陆军研究实验室在块体纳米晶金属加工方面的持续研究工作，重点介绍了用于制备新型金属粉末的方法学。...

美国陆军研究实验室对块体纳米晶金属的加工

本研究介绍了一种用于增强基于纳米探针生物传感信号的实验方案。该方案基于将氯金酸还原至现有纳米探针表面，这些纳米探针由金、银、二氧化硅或氧化铁纳米颗粒组成。...

快速纳米探针信号增强 原位 金纳米颗粒的合成

本文介绍了一种利用基于生物纳米孔的电子平台在单分子水平检测离散金属氧簇——多金属氧酸盐（POMs）的实验方案。该方法为研究这些分子的传统分析化学工具提供了一种互补手段。...

单个金属纳米颗粒的高分辨率物理表征

本文介绍了一种在氮化硅膜上进行细胞培养，并在利用同步辐射低温X射线纳米探针进行X射线荧光成像前进行...

在氮化硅膜上进行细胞培养及用于同步辐射X射线荧光纳米分析的低温制样

通过非水溶胶-凝胶法制备氧化铁纳米颗粒，并用阴离子短链分子或聚合物进行包覆。利用振动样品磁强计（VSM），展示了磁强测量技术在监测磁性纳米颗粒被人类干细胞摄取及发生生物转化过程中的应用。...

利用磁力测量法监测化学合成氧化铁纳米颗粒的细胞摄取及后续生物降解

我们提供了一种定量微区分析方法的总体框架，该方法利用入射电子束摆动条件下产生的电子通道效应，可靠地提取杂质元素的占位情况及其化学态信息，适用于少数物种、轻元素、氧空位以及其他点、线、面缺陷的分析。...

通过电子通道增强型微分析对晶体材料中功能掺杂剂/点缺陷的原子位点进行定量分析

学习利用核微探针分析技术原位检测金属氧化物纳米粒子，实现单细胞水平的化学元素定量分析。该方法可减少成像伪影，为纳米粒子毒理学研究提供精确的定量数据。

原位检测与单细胞定量金属氧化物纳米颗粒的核微探针分析方法

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