In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

由于其独特的理化特性，纳米颗粒越来越多地用于工业和医学。然而，与长期接触纳米颗粒相关的人类健康担忧仍然存在。这些风险可以通过研究细胞内纳米颗粒的行为和细胞对纳米颗粒的诱导代谢反应来量化。

这部分是由于缺乏允许检测和定量 sincle 细胞中内化纳米颗粒的方法。虽然许多分析工具（包括显微镜和质谱法）可用于估计纳米颗粒的细胞摄取，但这些工具只能在微观层面提供定性信息。相反，基于原子光谱的原位方法可以减少样品制备过程中产生的成像伪影的数量，并且可以直接观察纳米颗粒。

为了利用这一点，我们提出了一种相关方法，该方法使我们能够在天然状态或带有荧光标签的实验室床上研究纳米颗粒。在这里，我们描述了一种基于荧光显微镜和核微探针分析相结合的方法。这提供了细胞密度、化学元素特殊分布和每个细胞纳米颗粒数量的图像。

作为演示，我们将使用荧光显微镜和核微探针分析对暴露于二氧化钛纳米颗粒超过 24 小时的细胞进行研究。对于该方案，需要一个由聚合物 PEEK 制成的定制样品架。它必须适用于细胞培养和体外观察。

用两微米厚的聚碳酸酯箔盖住支架。聚碳酸酯箔用一层薄薄的 Formvar 溶液粘在 PEEK 培养皿上。安装后，样品架需要消毒。

多个无菌样品架可以储存在无菌 12 孔板中，每孔一个，直到需要使用。通过荧光显微镜检查转染基质行 GFP 质粒的细胞，以确保转染成功，并且它们表达荧光蛋白。用胰蛋白酶收获细胞，并在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。

通过添加新鲜培养基终止胰蛋白酶作用。在 4 摄氏度下以每分钟 1200 转的速度离心 5 分钟，使细胞沉淀。去除上清液并加入适量的新鲜培养基。

对细胞进行计数，并用新鲜和恒温的完全培养基进行稀释，以获得每微升 500 个细胞的细胞悬液。在聚碳酸酯箔的中心放置 40 微升液滴。小心地将样品放入细胞培养箱中 2 小时。

轻轻加入 2 mL 新鲜培养基，放置 24 小时。荧光二改性氧化钛纳米颗粒被设计、合成并与常用的荧光团接枝，以便在体外检测、跟踪和定位纳米颗粒。对于此步骤，应该已经在超纯水中制备了浓度为 1 毫克/毫升的二氧化钛纳米颗粒悬浮液。

通过在室温下使用一分钟长的强烈超声处理脉冲来分散纳米颗粒。在适当的培养基中稀释纳米颗粒，以获得每平方厘米 4 微克的暴露悬浮液。将以前的细胞培养基切换到这种新的含纳米颗粒的培养基中，并轻轻混合以实现均匀的纳米颗粒分布。

以相同的方式制备一组对照细胞，而不添加二氧化钛纳米颗粒。将细胞群孵育 24 小时。使用多聚甲醛，这些样品可以固定并使用荧光显微镜进行原位和单细胞成像处理。

然而，低温物理固定保留了细胞的超微结构和生化完整性。投入冷冻固定可在几毫秒内迅速停止细胞活动，并避免使用固定化合物。为了低温固定细胞，我们执行以下作。

通过在液氮中冷却来制备铝转移板。将板存放在装满液氮的盒子中，使板表面在冷氮气中高于液体。将足量的 2-甲基丁烷冷却至 150 摄氏度。

用培养基制备一个 50 毫升的 Falcon，用超纯水准备两个 Falcon。确保附近有吸水纸，以便在冷冻样品之前干燥样品。在培养基中冲洗细胞一次，然后在无菌超纯水中再冲洗两次，以去除培养基中残留的多余盐。

在吸水纸上快速干燥样品。将细胞在冷却的 2-甲基丁烷中冷冻 30 秒，然后将它们放在冷却的铝制转移板上。箱子必须尽可能保持关闭状态，以防止水蒸气凝结在冷板表面。

冷冻所有样品后，使用以下方法进行冷冻干燥以升华掉任何水分。首先，在低压和低温下进行 12 至 24 小时的初级干燥。接下来，保持低压力，进行至少 24 小时的二次干燥阶段，并将板温度升高到 40 摄氏度。

冷冻固定后，样品可以在无菌和干燥条件下储存数天，避免灰尘和湿气。核显微探针分析在法国波尔多的 Ifera 工厂进行。3.5 兆伏单子粒子加速器提供兆电子伏特能量范围内的轻离子束。

使用互补离子束分析技术在微探针光束线上进行化学元素成像。通过微 PIXE、粒子诱导 X 射线发射、STIM、扫描透射离子显微镜和微 RBS、卢瑟福背向散射光谱法使用的技术。样品放置在分析室内，并在真空下用不同的颗粒进行辐照，以便进行不同的离子束分析。

STIM 用于根据松散穿过不同密度细胞区域的能量粒子来记录细胞的航空密度图。Micro-PIXE 和 Micro-RBS 分析提供了单细胞水平化学元素的空间分布和定量。1.5 兆电子伏特质子微束聚焦到直径约 1 微米，并在感兴趣的细胞中进行扫描，由 STIM 识别。

样品中存在的原子（从钠到钛）发射的 X 射线可以测定元素浓度。收集背散射质子是为了测量归一化 X 射线强度所需的入射粒子总数。为了校准 X 射线检测器的响应，拥有用于量化元素浓度的认证校准标准品至关重要。

为了分析离子束数据，我们为 ImageJ 开发了一个新的插件。首先，计算 STIM 密度图。扫描透射铁显微镜图像的对比度是由于密度的局部差异，并允许检测细胞结构，例如细胞核和细胞质。

可以同时处理多个映射。每个映射对应于从入射粒子传输能量的介质。数据分析的第二步包括计算单个细胞光谱。

粒子诱导 X 射线发射分析可产生样品的化学成分和化学元素的元素图。根据记录时的光束位置对光子进行排序并选择以特定元素为中心的能量窗口后，计算出化学元素图。映射通常表示在光束位置检测到的事件数，并包含定量数据。

计算一堆化学图，每个选定元素一个。使用磷的 PIXE 数据找到每个细胞的感兴趣区域。然后，通过将每个细胞感兴趣区域的单个光谱相加来计算对应于每个整个细胞的光谱。

从这里，可以使用专用的 PIXE 和 IBS 分析软件提取有关每个细胞中化学丰度的定量数据。这里我们显示了多聚甲醛固定后细胞的荧光图像。顶行显示未暴露于二氧化钛纳米颗粒的细胞，而底行显示已暴露的细胞。

蓝色通道显示细胞核，绿色通道显示线粒体，红色通道显示钛。可以清楚地看到，控制中不存在二氧化钛。从右侧的合并通道可以看出，纳米颗粒仅存在于细胞质中，被排除在线粒体之外。

然而，这种方法缺乏的是有关纳米颗粒浓度的定量信息。核显微探针分析有望提供这一点。这些图像都是使用各种微探针分析技术拍摄的。

同样，顶行显示对照细胞，底行显示含有钛纳米颗粒的细胞。最左边的图像显示了低温固定细胞密度的 STIM 测量值。以下三个面板显示了 PIXE 获得的细胞中存在的钾、磷和钛的丰度。

同样，在对照和细胞核中都没有钛。为了逐个细胞量化钛的摄取，我们根据最右侧面板中显示的细胞边界定义感兴趣区域，并测量这些区域中的元素丰度。从这些 PIXE 测量中，我们绘制了对照和暴露群体在单细胞水平上的元素丰度分布。

对照群体用白色绘制，暴露的群体用黄色绘制。与每平方厘米 4 微克的暴露剂量相比，此处存在的钛的中位数相当低。钛的吸收范围在人群中差异很大，从每平方厘米 0.2 微克到每平方厘米 1.8 微克不等。

我们还注意到纳米颗粒暴露样品中游离细胞内离子（如钾和钙）的增加，这表明二氧化钛纳米颗粒的存在诱导了细胞稳态的改变。核微探针分析可以提供亚细胞水平的有用信息，并提供构成生物样品的化学元素的定量。这些技术具有许多优点。

一种是不需要化学固定的样品制备。第二，可以研究更大的区域，并能够专注于其他感兴趣的区域。三、化学元素的定量，灵敏度为每克几微克。

第四，细胞区室的鉴定，如细胞核、核仁和细胞质。在研究纳米颗粒在单细胞中的内化时，准确测定这些对于定量纳米颗粒毒理学至关重要。正如这里研究的案例所示，观察和量化单个细胞内纳米颗粒的能力使我们能够更好地了解内源性和外源性化学元素（如金属氧化物纳米颗粒）的价值积累。

该协议强调了核微探针分析对纳米颗粒与活细胞相互作用的未来研究的适用性。定量方法提供了有关这些纳米颗粒在检测、鉴定、定位和定量方面的影响的信息，以及在单细胞水平上对天然和化学修饰纳米颗粒的影响。