Name: 在脑组织成像金属激光剥蚀 - 电感耦合等离子体 - 质谱法（LA-ICP-MS） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习使用激光剥蚀-电感耦合等离子体-质谱法（LA-ICP-MS）对小鼠脑组织中的金属元素进行定量空间分布成像。该技术可保留金属的空间信息，有助于研究神经退行性疾病中的金属生物化学变化。

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DJH 和 PAD 得到澳大利亚研究理事会联合项目（LP120200081）与安捷伦科技公司及 ESI 有限公司的支持。BK 的贡献得到鲁尔大学研究学院 PLUS 的支持，该学院由德国卓越计划 [DFG GSC 98/3] 资助。DJH 部分得到拉马乔蒂基金会的支持。KK 得到西格丽德·尤塞尔ius 基金会的支持。

本文所述操作程序已获得霍华德·弗洛里动物伦理委员会批准，并遵循国家卫生与医学研究委员会的动物护理标准。
1. 分析样品的制备
注意：此步骤根据待分析的样品基质不同而有所变化。
<ol>
	<li>样品制备与切片 
	注意：使用4%多聚甲醛（PFA）固定并以含30%蔗糖的0.1 M PBS进行冷冻保护时，会导致组织中的金属元素不同程度地浸出。参见Hare 等19 有关具体细节，请参见相关说明。确保所有样品均经过相同的固定和冷冻保护步骤。
	<ol>
		<li>经心脏灌注已处死的动物，使用冰冻的 0.1 M PBS（pH 7.4）（参见 Dodt 方法部分） 等20 （详见操作步骤）并取出脑组织。</li>
		<li>将脑组织置于4% PFA中过夜以固定组织。</li>
		<li>用0.1 M PBS中的30%蔗糖溶液对脑组织进行冷冻保护，浸泡24小时，然后更换新鲜的30%蔗糖溶液，继续浸泡24小时。19</li>
		<li>在-20 °C下将脑组织于冷冻切片机中冷冻至少1 h。</li>
		<li>使用适当的包埋介质将脑组织固定在样品台夹具上。</li>
		<li>使用无金属的一次性刀片在冷冻切片机上对脑组织进行切片（例如， 聚四氟乙烯（PTFE）涂层刀片）并置于标准显微镜载玻片上。切片的最佳厚度应约为30 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若使用石蜡包埋样本，切至所需厚度，将切带漂浮于温水浴中，然后转移至标准显微镜载玻片上。 
	注意：生物样本长期固定及石蜡包埋的精确影响尚不明确。如需进行比较分析，应确保所有样本均经过相同的样本制备流程，具体操作参见1.1。
	<ol>
		<li>将载玻片依次浸入3次二甲苯中脱蜡，随后分别浸入1次100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇，并至少用符合ISO 3696标准或同等纯度的纯化水（以下简称“水”）洗涤3次（参见Hare 等.21 有关详细方法）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让样品在空气中干燥约1小时&#160;在无尘环境中保存，例如将样本垂直放置于载玻片盒内的支架上，并将盒盖留缝。</li>
</ol>
2. 基质匹配标准品的制备
注意：以下是先前已发表的简化版实验方案9。有关制备基质匹配组织标准品的详细步骤，请参阅原始论文。
<ol>
	<li>获取市售羊脑（或类似材料），用水冲洗，去除所有血液和结缔组织。</li>
	<li>使用手术刀仔细分离约50 g皮层组织，并使用带有聚碳酸酯一次性探头的手持组织匀浆器在低功率下进行部分匀浆。将其分装为每份5 g的等分试样，具体份数取决于所需的校准范围和校准点数量。</li>
	<li>通过溶解各分析物的可溶性盐，制备用于添加至每个标准品中的金属溶液例如， FeSO4·H2O) 溶于1%硝酸中，制备成0.1、1和100 mg金属/mL的溶液-1 储备液</li>
	<li>向5 g分装的组织中加入预计算体积的储备液（例如， 5 µL 的 10 mg/mL-1 最终浓度约为 10 µg/g-1 湿组织）以在每个标准品中实现一系列加标金属浓度。
	<ol>
		<li>根据每种标准品所需的目标终浓度，组合使用各金属储备液，以确保加入标准品中的溶液种类最少。向每种标准品中最终加入一定量的水，以保证各标准品中添加的液体体积相等。</li>
		<li>在低功率下匀浆加标标准品，时间约为30秒。若不立即使用，应将样品置于封有帕拉膜的聚丙烯管中，于-20 °C冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下方法确定每种标准品的准确浓度和均一性 或者 以下步骤：
	<ol>
		<li>微波消解
		<ol>
			<li>将6份精确称量（约50 mg）的标准品置于已清洗的PTFE消解罐中，每份加入4 mL浓硝酸（65%）和1 mL 30%过氧化氢。密封后，在500 W功率下消解30分钟。</li>
			<li>冷却消解容器后，在通风橱中打开，并用10 mL水等分多次定量转移消解液至已酸洗的50 mL离心管中。加水至总体积约50 mL，准确称量最终溶液的质量。</li>
			<li>对每个标准品重复步骤 2.5.1.1 - 2.5.1.2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若无微波消解设备，可采用以下步骤：
		<ol>
			<li>将六份精确称量（25 - 200 mg）的标准品加入经酸洗/无金属的聚丙烯管中，冻干过夜。</li>
			<li>加入40 µL浓硝酸，敞口置于加热块上，于70 °C加热5分钟，然后加入10 µL 30%过氧化氢。继续加热5分钟，再用950 µL 1%硝酸准确定容至1 mL总体积。 
			注意：建议使用所选方法消化有证标准物质，以确保消化过程的准确性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用标准方案，通过溶液雾化电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定每种消解液中的金属浓度。通过测定各等分试样的相对标准偏差（%RSD）来评估每种标准品的均一性，确保所有%RSD值均在15%以内。根据每份等分试样测得的质量，计算每种均质组织标准品中金属的精确浓度。</li>
	<li>返回至匀浆组织标准，将5 x 5 mm的塑料一次性组织学模具装满并冷冻 iso-戊烷，置于液氮中冷却。将冻存的标准组织块从模具中取出，在冷冻切片机上切片。 与样品相同厚度。 
	注意：建议为后续实验制备多种不同厚度的切片。风干的标准品可长期保存于密闭且无尘的容器中。</li>
</ol>
3. 分析前 LA-ICP-MS 的准备
<ol>
	<li>将标准样品和待测样品放入烧蚀室中，确保它们位于激光烧蚀（LA）装置所配备的CCD相机的景深范围内。如果需要对仪器进行调谐，请加入合适的参考物质（例如，NIST 612 玻璃中的痕量元素）。用手拧紧烧蚀室门上的两个螺丝，以密封烧蚀室。</li>
	<li>在ICP-MS软件中，选择“维护”或类似面板中的氩气阀门打开，并在相应的对话框中将载气流速设置为1.2 L min-1。 
	注：本实验方案使用氩气作为载气。某些示例中使用氦气或氦气与氩气的混合气体作为载气。有关使用氦气和氩气混合物作为气溶胶载气的技术细节，请参见Günther和Heinrich22。</li>
	<li>在LA软件中，点击“吹扫”按钮，用氩气至少吹扫细胞30分钟。 
	注：可通过点击“吹扫时间”或类似按钮来调整吹扫时间。当使用具有双体积烧蚀池的烧蚀系统时，应周期性地将载物台移至各个角落，并对角穿越整个烧蚀池，以尽可能去除残留空气。此操作可通过选择“归位载物台”或等效功能实现。</li>
	<li>点击“等离子体开启”以启动ICP-MS，并预热两小时，在此期间可执行步骤3.5至4.4。不同制造商的仪器设置可能有所不同，但合适的LA-ICP-MS操作条件示例可参见Hare 等10。</li>
	<li>组织标准样品的代表性烧蚀
	<ol>
		<li>选择线工具，在组织表面绘制一条约3 mm长的单线烧蚀路径。</li>
		<li>通过在实验列表中右键点击烧蚀线并修改以下参数来设定参数：光束直径（由用户根据需要选择；此处使用30 µm的方形光束）、扫描速度（每秒4倍光束直径；即120 µm s-1）和能量通量（软组织为0.3 &#160;-0.5 J cm-2；对于更硬的基质，必要时可优化）。在30 µm的组织厚度下，激光束不会完全穿透组织厚度，从而避免来自显微镜支撑材料的潜在污染。可通过归一化至碳23来校正烧蚀组织量的差异。通过选择“默认”单选按钮，将这些参数设为后续每条线的默认值。</li>
		<li>选择初始线，右键点击并选择“复制扫描”，重复该线六次。确保各线在x-或y-轴方向上以光束直径为间距偏移。这样每个标准样品共得到七条线，线间距等于光束直径。</li>
		<li>对每个标准样品重复步骤3.5.1至3.5.3，确保每条线长度相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在样品上绘制烧蚀区域时，请采用以下两种方法之一： 
	注：确保样品线使用与标准样品相同的扫描参数（光束直径、扫描速度、能量通量）。
	<ol>
		<li>若LA系统配备宽视野成像功能，选择线工具，并从样品左上角开始绘制一条足够长的线，以覆盖样品最宽处，激光参数与3.5节所述一致。按照3.5.3节所述方式复制该扫描线，根据光束直径设定线间距，重复足够多次以确保完全覆盖整个样品区域。</li>
		<li>若无宽视野成像功能，确定并记录覆盖整个样品的矩形四个角对应的x和y坐标（通常在主屏幕上显示为“载物台位置”或类似名称），并加以记录。利用这些坐标，按照3.7.1节所述方法布置平行烧蚀线，覆盖整个样品区域。</li>
		<li>在样品扫描约20小时后，最迟应重复3.5节所述过程，绘制用于间歇性扫描的标准样品线。根据样品扫描持续时间，可能需要多次执行此操作。实验结束前，额外增加一次对标准样品的扫描。 
		注：在烧蚀室吹扫过程中确定x和y坐标时，若选择归位位置及相应的轴校准，将改变先前获取的x和y坐标具体数值，但其差值（即线长）不受影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 为电感耦合等离子体质谱仪设置数据采集方法
<ol>
	<li>对于消融标准线，将线的长度除以激光扫描速度，以确定单条线的总分析时间。对样品线重复此操作。</li>
	<li>在 ICP-MS 软件中创建新方法（此处显示为“批处理”），并确保选择“时间分辨分析”或等效模式。选择要检测的 m/z 值，然后调整每个 m/z 的积分时间，使每个循环的总积分时间为 0.25 s。点击“另存为批处理”并相应命名（例如，Std1）。 
	注意：由于样品将以激光束直径四倍的速度穿过激光束，这可确保每个质量数记录的数据点相当于激光束直径12。例如，使用 100 µm 的光斑尺寸时，若扫描速度为 400 µm s-1，积分时间为 0.25 s，则生成的图像将具有真实的像素尺寸。可通过调整积分时间以提高灵敏度；当积分时间增加至 0.33 s 时，扫描速度应减慢至激光束直径的三倍。</li>
	<li>对于标准物质，在相应输入框中输入每条线扫描的分析时间，并额外增加 15 s，以计入激光预热和冲洗时间。输入样品运行列表（即 扫描执行的顺序），其采集次数（通常按顺序编号；即 001、002、等）应等于标准线的总数量。</li>
	<li>对于样品，通过将当前方法或批处理另存为不同文件名来复制标准物质所用方法，并调整总采集时间（包括额外的 15 s）和总采集次数，使其与将用于样品消融的线条数量一致。 
	注意：由于大多数 LA-ICP-MS 系统使用单向触发（LA 触发 ICP-MS），因此必须确保在下一条消融线开始前，ICP-MS 软件已处于等待 LA 触发的状态。此时 ICP-MS 的采集窗口将显示为“等待启动”。</li>
</ol>
5. 运行实验
<ol>
	<li>通过将第一个方法或批次添加到队列中来启动ICP-MS队列，并确保软件正在等待LA系统发出的触发信号。</li>
	<li>在LA软件中，单击“emission”以启用激光电源，然后单击“run”，并在相应的输入框中将激光预热时间设置为10 s，清洗时间设置为20 s。 
	注意：此超前运行将确保当激光开始下一条烧蚀线时，ICP-MS已准备就绪，可立即开始采集新数据。</li>
	<li>单击“start”以启动激光序列。若使用双体积腔室，请确保样品杯已就位。</li>
</ol>
6. 计算定量标准
注意：将 ICP-MS 数据转换为图像的方法有多种，包括使用以开源语言编写自制软件工具17,24,25、商业宏程序26以及数据分析软件7。此处使用近期开发的软件插件（详见 Paul et al.27），该插件基于专门的 LA-ICP-MS 数据分析套件28。
<ol>
	<li>将包含运行数据的所有批次文件夹（001.d，002.d， 等等将数据传输至安装有分析软件的独立计算机上。将批次中每条数据的 *.csv 文件分别提取到不同的文件夹中。 
	注意：强烈建议使用脚本自动将 *.csv 文件传输到新文件夹。详见所附 Python 代码。该脚本适用于 Agilent 7700 或 8800 系列 ICP-MS，但可进行修改以适配其他厂商的输出文件。</li>
	<li>打开软件平台，按照标签顺序依次导入并分析标准品，以生成定量图像，具体步骤如下所述。</li>
	<li>导入第一个标准批次的数据时，选择“Agilent .csv”作为“文件类型”，“整个文件夹”作为“导入类型”，并确认“日期格式”与计算机格式一致。点击“导入”，选择包含第一组标准品 .csv 文件的文件夹，然后转到“基线”选项卡。</li>
	<li>基线校正
	<ol>
		<li>使用工具栏主应用程序下拉菜单中的“自动选择”选项卡（命令 2），选择“来自导入的信息”，然后点击“继续”。</li>
		<li>单击“全选”，并为积分选择“Baseline_1”。</li>
		<li>选择每条扫描线的前 10 秒（对应激光预热时间），通过输入秒数“0”和“（线条持续时间 - 10 秒）”来裁剪数据，然后点击“Add integrations”例如，&#160;对于35秒的扫描线，输入数值“0”和“25”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用6.4节所述的“自动选择”选项卡来选择样本数据，但选择“Output_1”作为积分项。裁剪每条标准线起始和结束部分的数据，以排除背景信号例如 对于一条35秒的扫描线，输入数值“13”和“4”。</li>
	<li>为排除标准品中可能存在的孔洞导致的信号下降，在“样品”选项卡中，点击图表区域左上方的“通道”，选择一个信噪比高的通道例如， C13 或 P31）。记录信号中任何急剧下降的情况，并选择一个足够低的 CPS 值，使其低于样品内的正常波动范围，但又足够高以识别信号中的急剧下降。</li>
	<li>点击“DRS”选项卡，为“当前数据还原方案”选择“Baseline_Subtract”。在“索引通道”中选择通道6.6，在“屏蔽低信号时使用的阈值”中选择CPS值。输入一个数值 &#60;0.5 s，用于“低信号前后裁剪时间”，以补偿激光信号传递至ICP-MS过程中的延迟。</li>
	<li>为确认低信号区域是否得到充分遮蔽，请返回“样本”选项卡并选择一个已处理的（例如., Fe56_CPS）通道信号。如有必要，重复并优化 CPS 值以及“低信号前后截取时间（秒）”的设置，步骤同 6.7。</li>
	<li>点击“结果”标签，然后从主应用程序的下拉菜单中选择“导出数据”。输入文件名以生成结果的电子表格数据文件（例如， 标准1计算、标准2……）</li>
	<li>在合适的电子表格程序中打开数据文件，计算每个待定量分析通道的CPS值。利用溶液雾化ICP-MS测定的预知金属浓度，计算从CPS值转换为ppm（µg g⁻¹）的转换系数。-1针对每个可量化的元素。</li>
	<li>对运行中的所有标准品组重复执行步骤 6.3 - 6.10。</li>
</ol>
7. 构建定量图像
<ol>
	<li>在命令提示符中输入“Biolite()”以打开软件。</li>
	<li>单击“加载图像”并选择包含样本图像 .csv 文件的文件夹，以导入样本数据。</li>
	<li>背景校正
	<ol>
		<li>单击“基线”选项卡以对样品进行背景校正。在屏幕上显示的磷（P31）图像上，使用矩形绘制工具选择背景区域。尽可能多地选择多个区域，以生成覆盖整幅图像的信号/等离子体漂移分布图，从而确保对这些干扰因素进行充分补偿。</li>
		<li>为了使背景信号更明显，选择图形编辑工具（显示图像的左上角），然后右键单击图像。选择“修改图像外观”，并将“Z=处的第一个颜色”更改为一个较大的负值（例如 -100,000)。点击“完成”继续。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击“标准品”选项卡，以调出CPS/ppm校正因子表格。输入步骤6.10中计算得到的各元素的数值。此步骤有助于校正ICP-MS的灵敏度漂移。点击“开始！”</li>
	<li>从“数据”选项卡中打开“数据浏览器”，其中包含每个元素和每个步骤的图像。</li>
	<li>要完成图像的导出准备，请在“StdCorrImages”文件夹中选择目标图像，右键点击图像名称（*_ppm），然后选择“NewImage”。再次右键点击该图像，打开“Modify Image Appearance”窗口，选择所需的颜色表和颜色标尺。通过右键点击图像并选择“Add Annotation”来为图像添加颜色标尺。在左上角的下拉菜单中选择“ColorScale”，然后使用选项卡调整所需的颜色标尺。</li>
	<li>要导出图像，请确保已选中目标图像，然后转到“文件”选项卡，点击“保存图形…”，选择所需的格式并保存图像。或者，也可使用复制和粘贴工具传输所选图像。</li>
	<li>对所有感兴趣的图像重复步骤 7.6 和 7.7。</li>
	<li>量化离散区域
	<ol>
		<li>要激活 ROI 工具，请转到“分析”选项卡中的“包”，然后选择“图像处理”。</li>
		<li>选择所需图像，进入“Image”选项卡并点击“ROI…”。点击“Start ROI draw”，使用绘图工具在样本中选择感兴趣区域。完成绘制后，点击“Finish ROI”。</li>
		<li>要获取选定 ROI 的统计信息，请转到“Image”选项卡并点击“Stats…”。</li>
		<li>将结果复制并粘贴到另一个电子表格中。对所有感兴趣的区域和元素重复 ROI 选择（7.9.2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

RWH 和 COC 是 ESI Ltd. 的受薪雇员。FF 和 TPH 是 Agilent Technologies Australia 的受薪雇员。

对神经组织中的金属进行成像只是该方案在提供任何生物基质中金属分布和含量信息方面的其中一个示例。尽管标准参考材料的制备过程可能较为繁琐，但该实验只需进行一次，即可存档以供后续使用。
与同步辐射X射线荧光显微技术等其他方法相比，激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）在可及性和灵敏度方面具有一定的优势。然而，在使用LA-ICP-MS进行实验设计时，也需考虑其存在的某些局限性，因此该技术常作为化学成像的有益补充手段，可结合其他金属分析技术以及比较组织化学方法共同应用5。
与小鼠脑中已知的解剖学特征进行比对，可为金属含量水平与空间分布之间的潜在功能关系提供有价值的信息。此前，我们曾使用在线资源 Allen 脑图谱29，该图谱是 C57BL/6 小鼠脑中解剖学和基因表达数据的开放获取数据库，用于分析金属依赖性酶表达14以及神经解剖结构27,30的空间相关性。此外，还有其他资源可供使用，例如 Rodent Brain WorkBench31，可辅助将金属成像图谱与解剖结构进行配准和对齐，从而帮助准确识别常为微小解剖区域中的金属分布情况。
该技术的应用有助于评估金属水平和分布如何在正常生命过程（例如，衰老）以及疾病状态下发生微尺度变化；同时也可用于研究含金属化合物及旨在靶向金属代谢的药物的作用效果。目前，激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）作为空间金属分布成像技术的主要局限在于通量和灵敏度。分析速度与空间分辨率之间存在权衡5,12，更高分辨率的图像需要更长的分析时间。该技术适用于检测浓度较高的生物元素，但锰、钴和硒等元素因在正常组织中丰度较低和/或常规ICP-MS检测能力有限而受到限制。ICP-MS技术的新进展，例如三重四极杆质谱分析仪的引入，使得对硒32等难检测分析物的靶向检测灵敏度显著提高33。作为一种依赖技术发展的方法，激光系统与质谱仪设计的持续进步将推动该成像技术不断发展，进一步提升分析速度和检测灵敏度34。

金属独特的氧化还原化学性质促进了多种神经功能，包括信号转导、能量生成以及神经递质的合成。在多种主要的神经退行性疾病中，这些金属的稳态失衡不仅被证实与疾病发病机制相关，还被视为潜在的新型治疗干预靶点1。为了更好地理解金属在阿尔茨海默病和帕金森病（AD 和 PD）等疾病中的作用，必须能够测量在疾病过程所损害的脑区中金属分布和含量的变化情况。这些变化通常反映了生化反应的细微改变，可能与启动细胞死亡过程的机制密切相关，例如我们近期提出的铁与多巴胺在帕金森病中导致神经毒性的机制2。
传统上，特定解剖区域内金属含量的测定依赖于精细的组织切除、消解及一系列分析技术的应用3。然而，这种方法会丢失空间信息，而当所研究的疾病状态涉及微小且界限明确的区域或特定细胞类型时，空间信息可能至关重要。目前已有多种分析方法可用于在生物系统中可视化金属分布，这些方法适用于完整样本或组织切片，并可在二维和三维层面进行，所用技术包括发射光谱法、荧光探针和质谱法4。每种技术在灵敏度、化学物种的选择性以及可达到的空间分辨率方面各有优缺点。有关可用技术的全面综述，请参见 Hare et al.5 的综述文章。
基于质谱（MS）的方法是这些技术中最为灵敏的，能够检测大多数生物学相关金属在其天然浓度下的含量6。激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）成像采用聚焦的紫外激光束，其直径（或当使用四边形光束形状时的宽度）范围为1至&#62;100 µm，并使样品在激光下移动7。通过代表性剥蚀标准参考物质可获得定量信息，这些标准物质可通过多种不同方法制备8，各种方法在技术难度和分析实用性方面各不相同。最常用的方法是基体匹配法，即制备一种主要化学成分与待测样品相近的标准物质，通过添加目标分析物，并利用独立的分析手段准确评估其均匀性和绝对金属浓度9,10。对所制备的标准物质进行剥蚀后可用于外部校准，从而从所得样品图像中提取每个&#160;像素的浓度数据。
图像分辨率由光束尺寸和样品扫描速度共同决定。标准四极杆设计的电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）（占全球已安装ICP-MS系统的90%以上11）是一种串联式质量分析器，其质量检测器依次循环检测所有选定的质荷比（m/z），而非同时采集数据。因此，每次质量循环的采集时间必须等于样品通过激光束一个光束宽度所需的时间，以确保获得代表目标分辨率的像素12。激光光束尺寸的选择是一个关键参数，对灵敏度和总分析时间均有显著影响。由于激光烧蚀会物理去除材料，并由氩气载气将其输送至ICP-MS，质量分析器所能检测到的物质量遵循平方反比定律。例如，将激光光束直径从50 µm减小至25 µm，会导致烧蚀材料量减少为原来的四分之一。此外，作为一种扫描方法，更小的光束直径会增加烧蚀选定区域所需的总时间。因此，实验设计必须在所需的空间分辨率、灵敏度需求和时间限制之间取得平衡。
激光剥蚀电感耦合等离子体质谱成像（LA-ICP-MS）已应用于多种样品、基质及疾病状态的研究，包括神经系统疾病的动物模型13,14、创伤性脑损伤15、含金属抗癌药物的分布16、胎盘中毒性物质暴露17，以及牙齿中金属分布作为生命早期饮食转变的生物标志物18。本实验方案中，我们描述了一种在30 µm分辨率下对野生型（WT）小鼠脑组织中的铁、铜和锌进行成像的通用方法，该方法可根据分析人员的需求，轻松地适配于多种样品类型和实验目标。

<table><tbody><tr><td>苏打玻璃显微镜载玻片</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>常规载玻片适用于所有实验</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯涂层切片刀</td><td>C.L. Stuckey</td><td>DT315R50</td><td>刀片尺寸取决于冷冻切片机的刀架，请在订购前确认</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>任何供应商均可</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>市售级白砂糖即可使用</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>列出了预混小包，也可按照常规实验室方案自行配制</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247624</td><td>任何供应商均可</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>任何供应商均可</td></tr><tr><td>羊脑</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>大多数本地肉铺均可获得</td></tr><tr><td>金属盐</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>使用含有目标分析物的水溶性金属盐</td></tr><tr><td>Omni TH 组织匀浆仪</td><td>Omni Inc</td><td>THP115</td><td>其他类型的匀浆仪也可使用</td></tr><tr><td>聚碳酸酯匀浆探头</td><td>Omni Inc</td><td>TH115-PCRH</td><td></td></tr><tr><td>微波消解仪</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>可选，参见第2节</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>TechnoPlas</td><td>P4010</td><td>无金属聚丙烯管，酸洗处理的管也可使用</td></tr><tr><td>65% 硝酸</td><td>Merk Millipore</td><td>100441</td><td>痕量分析级</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95321</td><td>痕量分析级</td></tr><tr><td>10 × 10 mm 一次性冷冻模具</td><td>Ted Pella</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76871</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>使用本地供应商提供的液氮</td></tr><tr><td>NWR213 激光剥蚀系统</td><td>ESI Ltd</td><td>n/a</td><td>本实验中使用；其他厂商的设备也可使用，但可能需要对方案进行调整</td></tr><tr><td>Agilent 8800 系列 ICP-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>n/a</td><td>本实验中使用；其他厂商的设备也可使用，但可能需要对方案进行调整</td></tr><tr><td>Iolite</td><td>Iolite Software</td><td>n/a</td><td>可从 http://iolite-software.com/ 获取；其他方法也可用，详见实验方案</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>IGOR Pro</td><td>Wave Metrics</td><td>n/a</td><td>可从 https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm 获取</td></tr></tbody></table>

通过激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（la-icp-ms）成像脑组织中的金属元素

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

金属在生物体内广泛存在，其生物学作用取决于特定解剖区域内的化学反应活性和丰度。在大脑中，金属的分布具有高度区室化特征，这取决于它们在中枢神经系统中的主要功能。对金属空间分布的成像为揭示大脑的生化结构提供了独特视角，使得神经解剖区域与其已知功能在依赖金属的生理过程方面能够进行直接关联。此外，多种与年龄相关的神经系统疾病均表现出金属稳态失衡，这种失衡通常局限于脑内微小区域，而这些区域通常难以分析。本文介绍了一种利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）及专门设计的图像处理软件对小鼠脑组织中金属进行定量成像的综合方法。重点针对铁、铜和锌这三种在脑内最丰富且与疾病密切相关的主要金属，我们详细描述了样品制备、分析、定量测量以及图像处理的关键步骤，以生成分辨率达数微米级别的金属分布图谱。该技术适用于任何切割的组织切片，能够展示器官或系统内金属分布的高度异质性，并可用于识别精细解剖结构中金属稳态及绝对含量的变化。

为了展示这种LA-ICP-MS成像方法的能力，本文介绍了一项简单的实验，使用一只野生型C57BL/6小鼠脑组织的单一切片，该切片沿胼胝体中线分割，并在冠状面进行切片。同时描述了使用Biolite进行数据分析的工作流程（图1），如第6和第7节所述，以及生成所分析切片中金属分布的代表性图像的方法（图2）。
可以看出，小鼠脑内金属的分布因解剖区域不同而存在差异。这可归因于金属（尤其是与之结合的蛋白质）在不同脑区所发挥的多样化功能27。例如，铁在中脑和齿状回区域的浓度较高，而锌则在皮层区域最为丰富。作为常用的内标元素8，碳的分布则较为均匀。元素分布图（图2）若结合现有的解剖与功能参考图谱29使用，将尤为有用；通过分析金属共定位情况以及特定金属结合蛋白的表达，有助于揭示金属在特定脑区中的功能，或其水平变化与已知疾病相关生物分子之间的关联。本文所述方法针对更广泛的分析物进行了优化，但因此可能降低对锰等低丰度元素的检测灵敏度；可通过延长驻留时间、牺牲其他质量数的检测，对方法进行调整以重点检测该类分析物。
采用LA-ICP-MS成像技术的主要优势在于能够观察实验组间金属浓度及其分布的相对差异。我们此前已利用该技术证明了在模拟帕金森病的神经毒素损伤后铁含量升高2,10，以及人类阿尔茨海默病脑组织中皮层铁水平的变化21。本文所述方案可轻松适用于其他任何组织类型，仅需对所列方法进行少量修改即可。
<img alt="科学研究中的多步骤数据分析流程、图表和成像。" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 图像处理工作流程。 本工作流程是对第6和第7节的补充，展示了如何将ICP-MS获得的原始时间分辨数据转换为小鼠脑组织中金属分布的定量图像。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="元素分布分析；光谱实验中的 Mn55、Cu63、Fe56、Zn66 离子图像。" src="/files/ftp_upload/55042/55042fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 小鼠脑组织中生物金属的典型元素分布。 采用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）分析单个小鼠脑半球30 µm厚冠状切片所获得的代表性元素分布图。碳-13（C13）、镁-24（Mg24）和磷-31（P31）图像以金色调色板显示（每秒计数，CPS）（上排）。定量图像（下排）显示锰-55（Mn55）、铜-63（Cu63）、铁-56（Fe56）和锌-66（Zn66），采用相应的蓝-红渐变调色板（µg g-1）。脑切片的总分析时间约为5小时。比例尺 = 2 mm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55042/55042fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充代码文件 1. 6.1 节中描述的开源 Python 代码，可根据 ICP-MS 仪器制造商的数据输出方法，使用合适的 Python 编辑器进行修改。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55042/CopyFilesFromSubDirs_3.txt" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）对组织中的金属元素进行定量成像，是一种灵敏的分析技术，可为金属在正常生理功能及疾病过程中的作用提供新的见解。本文中，我们描述了一种对小鼠神经组织切片中的金属元素进行定量成像的实验方案。

通过激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）成像脑组织中的金属元素

金属在生物体内普遍存在，其生物学作用由自身的化学反应活性及在生物体内的丰度共同决定。

本方法的总体目标是利用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法对组织切片中金属元素的空间分布进行定量分析。该方法可解答基础生物学和疾病研究中的关键问题，尤其适用于金属生物化学参与疾病病理过程的研究。该技术的主要优势在于能够保留传统整体组织金属分析方法中通常会丢失的金属空间分布信息。该技术对神经退行性疾病的治疗和诊断具有重要意义，因为它使我们能够监测在发生细胞死亡的脑区中金属元素的变化情况。通常，初次接触该方法的研究人员在开展这些耗时且复杂的实验时可能会遇到困难。该方法的可视化演示至关重要，因为实验设计和数据分析过程具有挑战性，每一步操作都必须按照特定顺序执行。首先，将脑组织样本和所有基质匹配的组织标准品放入激光消融室中。确保样本位于LACCD相机的景深范围内。关闭室门，并用手拧紧螺丝。然后，在ICPMS软件中打开载气阀门，并将流速设置为1.2升每分钟。在LA软件中，使用载气对烧蚀室进行30分钟的吹扫。对于双体积的烧蚀室，每十分钟将样品台移动至腔室的每个角落，以减少烧蚀室中残留的空气量。打开电感耦合等离子体质谱仪（ICPMS），并让仪器预热两小时。在仪器预热期间，在激光剥蚀软件中于第一个组织标准样品表面绘制一条长约三毫米的剥蚀线。单击该剥蚀线，并设置默认的光束直径、扫描速度和辐射通量。将该线复制六次，线间间距为光束直径。对每个标准样品重复此过程。然后，使用线条工具从样品的左上角开始，穿过样品最宽处，按照与标准样品相同的参数绘制消融区域。根据标准品所用的间距，复制该线条以确保样品完全覆盖。然后，在扫描样品后不超过20小时，或在每份样品之间，绘制一组用于间歇性扫描标准品的线条。在实验结束时添加一次标准品的扫描。根据谱线长度和扫描速度，确定样品和标准谱线的分析时间。然后，在ICPMS软件中创建一个新的批处理，并选择时间分辨分析。选择感兴趣的质荷比值，并为每个比值设置积分时间，使一个循环的总积分时间为0.25秒。保存批次。对于标准批次，为每条线的分析时间额外增加15秒缓冲时间，以考虑激光预热和冲洗时间。为每条标准线设置包含采集步骤的样品运行列表。对于样品批次，复制标准批次，并根据样品的烧蚀模式相应调整时间和采集次数。待ICPMS预热完成后，将第一个批次添加到队列中，并确保软件正在等待LA仪器的触发信号。随后，在LA软件中打开激光电源，并设置激光预热时间和冲洗时间。启动激光序列，并检查ICPMS在消融后是否正确开始数据采集。数据采集完成后，从CSV文件中提取标准样品的数据。进行牵引基线校正，并扣除背景信号。识别由组织标准品中的孔洞引起的信号下降。对这些低信号区域进行屏蔽，然后将数据导出为电子表格。针对每种已鉴定的元素，计算从 CPS 转换为 PPM 的转换系数。对每个标准品重复此过程。然后，打开定量图像构建软件，从 CSV 文件中导入样品数据。选择背景的多个区域以进行背景校正。选择图形编辑工具，右键单击图像，然后选择“修改图像外观”。将 Z 轴的第一个颜色设置为较大的负值，然后单击“完成”以增强背景信号。随后在“标准品”选项卡中，输入每个标准品的 CPS PPM 校正因子，然后单击“开始”。在数据选项卡中打开数据浏览器，右键单击校正后的图像文件，然后点击新建图像。打开修改图像外观窗口，设置颜色表和比例尺。使用添加注释工具在图像上放置一个颜色标尺。调整颜色标尺窗口中的颜色标尺。图像完成着色和标注后，可将其复制粘贴至其他程序，或从图像构建软件中导出。要启用感兴趣区域（ROI）工具，请从分析软件包中选择图像处理，并选择一幅图像。在图像标签页中，点击 ROI 并开始绘制 ROI。选择感兴趣区域，然后点击完成 ROI。在图像标签页中，点击统计以获取 ROI 数据。将数据复制并粘贴到电子表格中，确保每次添加感兴趣区域（ROI）时都进行保存。根据需要重复该过程。本研究采用此技术分析了野生型小鼠脑组织中的金属含量及其分布情况。此处显示了碳、镁和磷的分布，单位为每秒计数。锰、铜、铁和锌则展示了定量图像。碳的分布被用作内标。铁在中脑和齿状回中含量最为丰富。锌在皮质区域中含量最高。这些图像提供的信息可用于追踪金属结合蛋白的表达与功能活性。一旦掌握，原本需要数天完成的实验可在一小时内正确 setup。在进行该操作时，重要的是要将消融线与ICPMS的数据文件同步。完成该操作后，可对相邻切片进行组织学染色等其他方法，以提供金属与特定蛋白质共定位等额外信息。我们最初产生该方法的想法，是源于希望研究在帕金森病的实验室模型中金属水平如何变化。尽管该方法可用于研究神经退行性变，也可用于不同类型组织和疾病状态，包括人体组织以及多种生物基质。该技术建立后，为神经科学领域的研究人员探索疾病的人体样本和动物模型中金属含量的变化提供了途径。观看本视频后，您应能较好地掌握如何设置激光剥蚀电感耦合等离子体质谱实验。请注意，处理生物材料可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取相应预防措施，例如穿戴合适 的个人防护装备。

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

在脑组织成像金属激光剥蚀 - 电感耦合等离子体 - 质谱法（LA-ICP-MS）

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来源：Hare, D. J., 等. 利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）对脑组织中的金属进行成像。 J. Vis. Exp.

激光消融-电感耦合等离子体质谱法可视化小鼠脑组织中的金属元素

此前已有报道称，二蒽醇（DT；1,8-二羟基-9,10-二氢蒽-9-酮）可作为小分子组织成像的基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质；本文提供了在超高清分辨率四极杆-傅里叶变换离子回旋共振（quadrupole-FTICR）仪器上，采用正离子模式MALDI-MS技术，利用DT对组织切片表面内源性脂质进行MALDI成像的实验方案 。...

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使用尺寸排阻ICP-MS进行定量金属蛋白质组学分析的标准

通过结合中红外激光解吸与电喷雾后电离技术，开发了一种在常压下运行的质谱成像（MSI）离子源。采用外源性冰基质作为吸能介质，以促进组织相关物质的共振解吸。本文提供了对新生小鼠整体进行红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱成像（IR-MALDESI...

基于红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）的全身体质谱成像

基于基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）的分子成像可实现对生物样本中多种分析物的同步定位。本文介绍了一种利用MALDI-IMS检测和可视化阿尔茨海默病及脑淀粉样血管病样本脑组织中β淀粉样蛋白的实验方案。...

利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

本方案介绍了一种利用薄膜扩散梯度（DGT）结合质谱成像技术，对多种不稳定的无机营养元素和污染物溶质进行亚毫米级二维可视化的实验流程。文中详细描述了溶质采样及高分辨率化学分析方法，用于对陆生植物根际溶质进行定量分布图谱绘制。...

土壤中不稳定的无机植物养分与污染物的二维可视化与定量分析

使用左旋多巴（L-DOPA）进行多巴胺替代药物治疗是帕金森病最常用的对症治疗方法，但伴随有包括称为运动障碍的不自主异常运动等副作用1。本文介绍了一种基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI成像质谱）的实验方案，可用于检测与运动障碍相关的神经肽在大鼠脑内水平的变化。...

帕金森病中神经肽的基质辅助激光解吸电离成像质谱分析

该技术的目的是利用药理学磁共振成像（phMRI）结合静脉注射选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）氟西汀，评估活体且自由呼吸动物中5-羟色胺（5-HT）神经递质的功能。...

药理学挑战fMRI在临床前研究中的应用：以5-HT系统为例

学习使用激光剥蚀-电感耦合等离子体-质谱法（LA-ICP-MS）对小鼠脑组织中的金属元素进行定量空间分布成像。该技术可保留金属的空间信息，有助于研究神经退行性疾病中的金属生物化学变化。

通过激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）成像脑组织中的金属元素

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