头颈部鳞状细胞癌中神经周围浸润的模型

本实验方案的总体目标是快速评估影响头颈部鳞状细胞癌神经周围侵袭的多种处理条件，且具有极高的实验成功率和可重复性。该方法有助于回答头颈部肿瘤学领域中的一些关键问题，例如哪些因素会影响头颈部癌细胞的神经周围侵袭。该技术的主要优势在于，可在相对较短的时间内，从一只小鼠身上快速、重复地完成大量实验。

在开始背根神经节（DRG）解剖操作之前，向V型底96孔板的至少40个孔中加入新鲜的室温培养基。然后，使用一把精细剪刀沿脊柱方向从尾根至小鼠头部做纵向切口，并在骶椎下方横向切断组织，解剖脊柱两侧，一直分离至颅底。

将标本置于显微镜下，在低倍镜下观察脊柱的颈段末端。白色的脊髓位于骨性环的中央，周围包裹着不同程度的椎旁肌肉和软组织。使用显微弹簧剪，切开前两至三个椎体的背侧（即上侧）部分。

然后，利用剪刀的弹簧作用打开最初的骨性切口，以确保椎体解剖位于中线处。以微小的增量继续向骶椎方向进行，沿椎体腹侧（即下侧）以相同的切割方式将脊柱一分为二。将一侧半脊柱放置一旁，将另一半脊柱连同脊髓一起腹面朝下转移至无菌培养皿中。

使用两根18号针头将半脊柱的两端固定在聚苯乙烯解剖平台上。接下来，从较窄的颈椎端开始，轻轻剥离约四个椎体节段的脊髓。在感觉神经插入背根神经节（DRG）的区域，用显微镊子轻轻夹住周围的筋膜，并使用显微弹簧剪修剪该筋膜及其他神经组织，以游离出DRG。

在更高倍镜下，使用弹簧剪尽可能靠近背根神经节（DRG）切断周围神经以释放组织，并修剪近端分支。然后，去除背根神经节上任何散在的神经纤维或筋膜附着物，将分离的组织放入96孔V型底板的一个孔中。为制备半固体基质液滴，将一个玻璃底培养板从冰上转移至解剖显微镜下冰块上的冰盘中。

将容量不超过10微升的移液器枪头以45度角直接接触玻片表面，小心地将1.5微升基质液滴加到玻片上。当基质液与玻片接触后，缓慢将移液器枪头移开。在玻片的四个角各加一滴基质液，然后将玻片转移至室温表面静置约一分钟。

当基质略微变硬后，将培养板放回冰块上，用闭合的显微镊子左手轻轻舀起背根神经节（DRG）。右手小心地将神经组织转移至21号针头的尖端，并用针头将DRG轻轻插入基质液滴的中央。应使用针头使DRG顺利释放到基质中并居中定位。

将DRG组织块插入每个四滴液滴后，将培养板放入37摄氏度的培养箱中孵育3分钟。当所有DRG组织块均被包埋后，依次将培养板倾斜一定角度，缓慢加入4毫升添加了10% FBS的DMEM培养基，使培养基与基质胶中的DRG单元逐渐接触。随后将培养板重新放回培养箱继续孵育48至72小时。

当神经突延伸至基质边缘距离的至少75%时，吸出孔中的培养基，但不要移除基质上的DRG单元。然后，使用200微升移液枪，以平稳的按压动作，将两滴浓度为每毫升含3×10⁵个细胞的培养基加至每个基质DRG检测单元上。随后将培养板放回培养箱中继续培养。

一小时后，沿玻璃底培养板的侧壁轻轻加入 4 毫升含 10% FBS 的 DMEM，并将培养板放回培养箱，直至下次显微镜观察。在解剖并置于基质液滴后，实验的外观应类似于此处所示的基质包埋 DRG。请注意，DRG 并非完全圆形，但位于基质液滴中央，从而允许神经突在 360 度方向上生长延伸。

铺板后立即可见，头颈部鳞状癌细胞在基质周围形成一个环形区域，并在接下来的两到三天内沿神经突延伸扩展。接种在仅含基质的空白对照液滴上的细胞会在基质周围活跃分裂，但不会进入或延伸至基质上方。为了定量分析癌细胞的神经周围侵袭情况，将实验图像通过一条垂直线和一条水平线均分为四个象限。

随后对每个象限中观察到的每条神经周围侵袭延伸进行评分，从而能够比较不同癌细胞系之间癌细胞沿神经突的生长情况。一旦掌握，若操作得当，背根神经节分离技术可在两小时内完成。在进行该操作时，应尽量减少对背根神经节的过度操作，因为挤压损伤是导致实验失败的最常见原因。

通过该实验步骤，可对神经周围侵袭的机制进行研究，有望推动针对此类软组织侵袭的靶向治疗策略的开发。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从小鼠体内分离背根神经节，并建立用于检测神经周围侵袭的实验体系。