在凝胶表面生长的植物根部的光片荧光显微成像 光片荧光显微镜，植物根系，凝胶培养，活体成像，根系发育，三维成像

本实验的总体目标是利用光片显微镜对植物根系进行长期观察。为实现这一目标，必须采用温和的样品制备方法、可控的生长条件，以及不会干扰植物正常发育的成像技术，例如光片显微镜技术。实验开始时，将植物生长在一层厚度为两毫米的凝胶表面。

将含有拟南芥幼苗的凝胶切下，舀起并转移至显微镜样品台上。在显微镜内，植物保持其自然直立状态生长。根部在液体培养基中生长，而叶片则暴露在空气中。

照明系统仅照亮叶片。水面被覆盖以保持根部处于黑暗环境中。与现有方法（如将根部包埋于凝胶内部）相比，该技术的主要优势之一在于，我们习惯于在凝胶表面培养植物。

因此，我们可以继续采用之前完全相同的培养方案。其次，根部与液体培养基直接接触，例如可用于更换为药物处理。在方形培养皿中倒入30毫升新鲜高压灭菌的含1.5%植胶的半倍浓度MS培养基，形成约2毫米厚的凝胶层。

将无菌种子并排播种，每粒种子之间至少间隔一厘米。然后用微孔胶带封好培养皿。将培养皿垂直置于培养箱中培养，最长培养10天。

在本实验中，我们使用六天大的植物来观察侧根的发育情况。我们提供了用于3D打印样品 holder 的模型，并已测试了不同的材料。

透明树脂在刚性和耐水性方面最为合适。从固体材料加工样品 holder 的尺寸详细描述见于文稿中。使用手术刀在植物周围切割凝胶。

然后，将植物生长的凝胶块小心挖起，并将其轻轻转移至样品托上。将1%的琼脂糖在80摄氏度下融化，冷却至33摄氏度。将凝胶块粘附在样品托上，并小心地将植物固定在凝胶上。

使用体视显微镜确认植物的位置，并确保目标区域未被任何凝胶覆盖。为防止植物干燥，应尽可能将样品台滑入一个1,000微升移液器吸头中。将样品台放置于移液器吸头盒上，如有需要，可继续制备更多样品。

我们的显微镜是一种经典的开放式离心显微镜，未作重大改装。我们设计了一套照明系统，用于在显微镜内部培养植物。红色和蓝色LED呈环形排列。

可以单独开关成对的LED，以实现方向性照明。照明系统的光谱与我们的生长室中的光谱相匹配。来自LED的几乎所有光线都会被GFP发射滤光片阻挡。

我们无法检测到任何杂散光到达相机。因此，成像时可以保持光源开启。光照强度可调节，范围为30至250微摩尔每平方米每秒。

将LED环固定在开放式旋转台臂的下方，可使用螺丝或胶水进行固定。将其重新安装到显微镜上，并连接电线。组装灌注系统。

将管路以单向方式连接至样品室。调节流速至每分钟1毫升。加入3个边长为毫米的无菌黑色塑料薄膜方块，并将其均匀分布在水面上。

将样品插入显微镜中。确认样品 holder 上没有塑料片粘附。使用两片黑色铝箔制成的盖子封闭样品室。

打开光源并调节光照强度。关闭室内灯光，开始记录。该方法可用于记录数小时至数天的根系生长过程，此处展示的为一条侧根的生长情况。

单个时间点的Z轴层扫图像显示出良好的光学切片特性。我们以三维形式完整捕捉了侧根形成的过程，从而能够研究该过程的动态变化。观察该记录中的单一层切片，即使在根部较深位置，仍可看到良好的分辨率。

观看本视频后，您应能清晰理解用于光片显微镜的植物样品制备方法。通过遵循本实验方案，我们现在能够观察器官发生、植物向性运动或植物适应过程中细胞内蛋白质定位或基因表达模式。这将有助于我们理解植物发育过程中的时空调控机制。