Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

该程序的总体目标是使用光片显微镜获得对植物根系的长期观察。为了实现这一目标，必须采用温和的样品制备方法、受控的生长条件以及不会改变植物发育的成像技术，例如光片显微镜。首先，植物生长在两毫米薄的凝胶层表面上。

然后将带有 Aribidopsis 幼苗的凝胶切出，舀起并转移到显微镜样品架上。在显微镜内，植物以其自然的直立位置生长。根在液体介质中生长，而叶子留在空气中。

照明系统仅照亮树叶。水面被覆盖，以保持根部处于黑暗中。与现有方法（例如将根嵌入凝胶内）相比，该技术的主要优势之一是我们用于在凝胶表面生长植物。

因此，我们可以坚持与以前完全相同的 growing 协议。其次，根部与液体介质直接接触，例如，液体介质可以换成药物治疗。将 30 mL 新鲜高压灭菌的含有 1.5% 植物凝胶的半强度 MS 培养基倒入方形培养皿中，形成约 2 mm 的层。

并排播种无菌种子，中间至少留出一厘米的距离。然后，用微孔胶带包裹板。在生长培养箱中垂直培养板长达 10 天。

在这个实验中，我们使用 6 天龄的植物来观察侧根的发育。我们提供了一个用于 3D 打印样品架的模型。我们测试了不同的材料。

透明树脂在刚性和耐水性方面最合适。手稿中详细描述了从固体材料加工样品架的尺寸。用手术刀切开植物周围的凝胶。

然后，舀起植物生长的凝胶块，小心地将其移植到样品架上。在 1 摄氏度下融化 80% 的仇恨并将其冷却至 33 摄氏度。将凝胶块粘在样品架上，然后小心地将植物粘在凝胶上。

使用立体显微镜验证植物的位置，并确保感兴趣的区域没有被任何凝胶覆盖。为防止植物变干，请尽可能将样品架滑到 1， 000 微升移液器吸头上。将支架放在移液器盒上，并在需要时准备更多样品。

我们的显微镜是经典的开放式旋转显微镜，没有进行重大修改。我们在显微镜内实施了用于培养植物的照明系统。红色和蓝色 LED 排列成一个环。

可以单独打开和关闭成对的 LED 以进行定向照明。照明系统的光谱与我们生长室中的光谱相匹配。几乎所有来自 LED 的光线都被 GFP 的发射滤光片阻挡。

我们无法检测到任何到达相机的杂散光。因此，成像时可以保持灯亮着。光强度可以调节，范围从每秒每平方米 30 到 250 微摩尔。

将 LED 环拧入或粘上开放式旋转舞台臂下侧。将其装回显微镜并连接电线。组装 profusion 系统。

将试管单向连接到样品室。将速度调整为每分钟 1 毫升。加入 3 毫米见方的无菌黑色塑料箔，并将它们分布在水面上。

将样品插入显微镜。确认样品架上没有塑料片粘住。用两个黑色铝箔制成的盖子关闭腔室。

打开灯并调整灯光强度。关闭房间灯并开始录制。这种方法允许在几个小时到几天内记录根的生长，这里通过侧根的生长来表示。

单个时间点的 z 堆栈图像显示出良好的光学截面特性。我们以 3D 形式捕获了侧根形成的整个过程，这使我们能够研究这个过程的动力学。查看此录音的单个切片可显示良好的分辨率，即使在根深处也是如此。

看完这个视频，你应该对光片显微镜的植物样品制备方法有一个清晰的了解。遵循此协议，我们现在能够查看器官发生、植物趋向性或植物适应过程中的细胞内蛋白质定位或基因表达模式。这将有助于我们理解植物发育的时空调控。