Name: 从尸检人脑软脑膜捐助外植体培养的推导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 学习从尸检人脑软脑膜组织培养原代成纤维细胞的技术，用于帕金森病细胞系研究。该方法可在六至八周内获得纤维连接蛋白阳性细胞，为神经退行性疾病机制研究提供可靠的细胞模型。

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本方案的开发由定向捐赠给帕金森病研究所脑组织捐献项目的私人捐款资助。

脑组织捐献登记包括登记人签署表明其捐献意愿的文件。根据法律规定，组织取材所需的尸体解剖许可须由法定继承人提供。使用所采集的尸体解剖标本开展的研究项目需经机构审查委员会（IRB）审核，以确保符合《健康保险可携性与责任法案》（HIPAA）的规定。
注意：软脑膜样本由脑解剖人员或神经病理学家在脑组织解剖过程中采集，并储存于含有25-30 mL脑膜生长培养基的50 mL锥形管中。样本在4 °C保存直至进行处理。应尽快完成样本处理，因为细胞活力会随着死亡后时间的延长而下降。
1. 开始软脑膜解剖前的准备工作
注意：步骤 1.1 - 1.3 应在生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>通过在500 mL滤器装置中混合375 mL的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Media）、100 mL胎牛血清、5 mL 10 mM非必需氨基酸、5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL 100 mM丙酮酸钠、5 mL 10,000 U/mL青霉素/链霉素和5 mL 250 µg/mL两性霉素B，制备脑膜生长培养基。过滤并混匀。培养基可在四周期间内使用。</li>
	<li>开始解剖前，将所有材料放入生物安全柜中：4个培养皿、2个6孔板、2把手术刀、15–20片灭菌的15 mm盖玻片、磷酸盐缓冲液（PBS）、血清移液管、吸液移液管。</li>
	<li>向6孔板的每孔中加入1 mL经高压灭菌的0.1%明胶溶液。静置30–60分钟。准备2个6孔板。</li>
</ol>
2. 软脑膜样本的制备
注意：步骤 2.1 - 2.3 必须在生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>向无菌的10 cm组织培养皿中加入约10 mL PBS，将脑膜样本放入培养皿中。用镊子轻轻用PBS冲洗软脑膜，以去除血液。</li>
	<li>将脑膜转移至另一含有10 mL新鲜PBS的10 cm组织培养皿中继续清洗。根据需要重复操作，尽可能去除血液。</li>
	<li>使用两把手术刀将软脑膜组织切成约6 cm × 6 cm大小的片状。</li>
	<li>将培养皿盖上盖子，转移至水平层流罩内的解剖显微镜下。</li>
</ol>
3. 软脑膜组织的解剖
注意：步骤 3.1 - 3.3 需在水平层流罩内使用解剖显微镜进行。
<ol>
	<li>从软脑膜组织（步骤 2.3）上选择一个足够大的区域，去除该区域的血管，以便制备至少 20–25 个 3 mm × 3 mm 的组织块。用一把解剖刀固定软脑膜组织，另一把解剖刀以轻柔、浅表的刮除动作分离血管。</li>
	<li>从已处理的区域切割出小块组织。采用逐步切割法，先切出较大组织块，再将其进一步切成更小的片段。</li>
	<li>用一把解剖刀固定组织，另一把解剖刀以 rocking motion（ rocking 动作）进行切割。由于组织质地特性，难以将两把解剖刀相互滑动切割；这样做只会撕裂组织，导致边缘不整齐。</li>
	<li>持续将组织块对半切割，直至获得约 20–25 个 3 mm × 3 mm 的组织块。</li>
</ol>
4. 将解剖后的脑膜组织片转移至组织培养板
注意：步骤 4 必须在生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>吸出6孔板中的明胶（来自步骤1.3）。向每孔加入1 mL脑膜生长培养基。使用无菌镊子，将3-4块活检组织放入每孔中。</li>
</ol>
5. 将盖玻片放置于脑膜组织片上
注意：步骤 5.1 - 5.2 需在水平层流罩内使用解剖显微镜进行。
<ol>
	<li>每孔用 1-2 个无菌的 15 毫米圆形盖玻片覆盖组织块。</li>
	<li>用镊子用力按压，确保组织块与培养板底部充分接触，以促进组织块在孔底的贴附。</li>
	<li>将 6 孔板放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
</ol>
6. 细胞培养的维持
注意：步骤 6.1 - 6.3 应在生物安全柜内进行。操作培养皿时需小心，避免盖玻片移动而导致脑膜组织脱落。
<ol>
	<li>培养 2 天后，向每孔中额外加入 1 mL 新鲜的脑膜细胞生长培养基。</li>
	<li>第 7 天时，小心吸除培养基，并向每孔中加入 2 mL 新鲜培养基。</li>
	<li>第 9 天后，继续每隔一天更换一次生长培养基，直至细胞培养达到汇合状态。</li>
</ol>
7. 传代
注意：所有步骤均须在生物安全柜内进行。一旦脑膜成纤维细胞从脑膜组织块迁移出来并开始向培养容器边缘生长，即将脑膜成纤维细胞扩增至更大的培养皿中。
<ol>
	<li>传代开始前，用 1% 明胶对培养皿进行包被处理，持续 15-30 分钟。</li>
	<li>从 6 孔板中吸除培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>每孔加入 1 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 5-10 分钟。此步骤无需移除盖玻片或脑膜组织。</li>
	<li>当细胞变圆并开始脱落时，加入 2 mL 完全培养基。</li>
	<li>用移液器反复吹打细胞，彻底分散所有细胞团块，并将细胞悬液转移至更大的培养皿中。</li>
	<li>按 1:3 至 1:4 的比例，将三个 6 孔板中的细胞合并至一个 T75 培养瓶中。</li>
	<li>当 T75 培养瓶中的脑膜成纤维细胞达到融合状态时，用胰蛋白酶消化细胞，并以每管 1×106 个细胞/mL 的密度在冻存液中进行冻存。一个融合状态的 T75 培养瓶中的脑膜成纤维细胞大约含有 500 至 700 万个细胞。</li>
</ol>
8. 通过免疫染色对脑膜成纤维细胞进行表征
注意：在开始实验前，需配制4%多聚甲醛溶液、含5%正常山羊血清的PBS（封闭缓冲液）、含0.3% Triton X-100的PBS（通透缓冲液）、一抗和二抗溶液，以及将Hoechst 33342从10 mg/mL储存液稀释至1 µg/mL的PBS工作液。
<ol>
	<li>在涂有0.1%明胶的8孔腔室载玻片中接种15,000至30,000个脑膜成纤维细胞。</li>
	<li>24小时后，待细胞贴壁，每孔加入100 µL 4%多聚甲醛，室温固定10分钟。用1×PBS洗涤孔板3次。</li>
	<li>每孔加入150 µL 0.3% Triton X-100，室温透化5分钟。用1×PBS洗涤孔板3次。</li>
	<li>每孔加入200 µL封闭液（PBS + 5%正常山羊血清），室温封闭1小时。</li>
	<li>吸除封闭液，每孔加入150 µL用封闭液稀释的一抗溶液。进行双重染色时，将一抗工作液分别在冰上置于不同的离心管中配制，具体如下：
	<ol>
		<li>在封闭液中配制抗Fibronectin抗体1:300稀释液 + 抗nestin抗体1:200稀释液；在封闭液中配制抗SERPINH1抗体1:250稀释液 + 抗TUJ1抗体1:1,000稀释液；在封闭液中配制抗SERPINH1抗体1:250稀释液 + 抗SOX2抗体1:100稀释液</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用1×PBS洗涤孔板3次。</li>
	<li>在封闭液中配制荧光标记的二抗工作液（山羊抗兔IgG，绿色；Ex/Em2 495/519 nm；山羊抗小鼠IgG，红色；Ex/Em2 590/617 nm），稀释比例为1:400，每孔加入100 µL，室温避光孵育1小时。随后用1×PBS洗涤1次。</li>
	<li>每孔加入100 µL 1 µg/mL Hoechst 33342溶液（蓝色；Ex/Em2 358/461 nm），避光孵育3分钟。用1×PBS洗涤3次，最后一次洗涤后保留1×PBS于孔中，并用铝箔包裹载玻片。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stem%2Fprogenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383(2015).</li>
<li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li>
<li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+autopsy+donor-derived+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells.</a> Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li>
<li>Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+autopsy-derived+fibroblasts+as+a+tool+to+study+systemic+alterations+in+human+neurodegenerative+disorders+such+as+Alzheimer%27s+disease--methodological+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations.</a> J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).</li>
<li>Bliss, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+postmortem+human+dura+mater+and+scalp+for+deriving+human+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures.</a> PLoS One. 7 (9), e45282(2012).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).</li>
<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson%27s+disease%3A+a+clinico-pathological+study+of+100+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li>
<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种简单且可靠的从人死后捐献脑组织时采集的软脑膜中分离脑膜成纤维细胞培养物的方法。目前关于从人死后组织材料中建立细胞培养的方案报道极少。已有两项研究描述了皮肤来源的成纤维细胞培养7,8,9，一项研究描述了硬脑膜样本10，另一项研究描述了未经冷冻保存的冻存硬脑膜样本11。
我们准备两块6孔板，每孔中放入2-3个组织块（大小约为3 mm × 3 mm），以确保在冷冻保存前获得足够的组织块细胞迁移和扩增。关键步骤是用无菌玻璃盖玻片轻轻按压脑膜组织块，使其贴附于培养皿底部。若不使用盖玻片，脑膜组织块将无法贴附在培养皿底部。只有当组织块与塑料培养皿底面直接接触时，才能观察到成功的细胞迁移。如果组织块漂浮在培养基中，则不会观察到细胞从组织块中迁移出来。操作时应先加入约500 µL生长培养基，防止样品干燥...

脑膜由三层膜组成，可保护大脑：硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。近年来，人们认识到脑膜在大脑发育和大脑稳态中也发挥着重要作用1脑膜来源于间充质细胞和神经嵴来源的细胞，有趣的是，已有研究表明，存在于脑膜中的前体细胞能够分化为神经元。 体外 移植后 体内2,3,4脑膜培养物也已成功用作饲养层，因其具有间质细胞来源的诱导活性，可促进胚胎干细胞向多巴胺能神经元分化5此外，在缺血条件下，软脑膜具有直接分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。6.

本方案中，人死后蛛网膜和软脑膜（合称软脑膜）样本作为人脑捐献用于研究的一部分进行采集。脑组织解剖在死亡后24小时内进行，软脑膜样本采集后置于冷的生长培养基中，并在接下来的6-8小时内进行进一步处理，具体步骤如本方案所示。
本方案描述了人脑膜样本的解剖与制备过程，用于建立患者原代软脑膜细胞培养。将组织切成约25-30块，每块大小约为3 mm × 3 mm的方块。每块6孔板的明胶包被孔中放置3块组织，并用圆形玻璃盖玻片压住固定。脑膜解剖过程耗时约25-35分钟。该培养的主要挑战在于无菌性，因为脑组织的获取、运输和解剖通常并非在无菌条件下进行。因此，必须在培养基中添加青霉素、链霉素和两性霉素B的混合抗生素，并使用多孔板分别培养各组织块。
脑膜成纤维细胞通常在第一周内开始生长。每两到三天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态，然后通过酶法进行传代。脑膜成纤维细胞以每毫升每管100万个细胞的密度，用冷冻保存培养基进行冻存。采用本方案，可在6至8周内获得2000万至3000万个可用于冻存的脑膜成纤维细胞。这些脑膜成纤维细胞的后续应用包括用于疾病研究的原代培养、直接神经元分化，或从软脑膜来源的细胞中诱导生成多能干细胞，以帮助理解疾病机制并推动药物开发。

<table><tbody><tr><td>Corning 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>15 mm 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>手术刀，无菌刀片，15 号</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>弯头精密尖头镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL 滤器装置</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>混合培养基组分并过滤。</td></tr><tr><td>Nunc 细胞培养处理带滤帽烧瓶，T175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100 倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B（黄色溶液/250 &amp;micro;g/mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker 冻存液 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;纤连蛋白染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 孔腔室载玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% 多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% 甘油&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>100% 正常山羊血清&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>抗纤连蛋白抗体 [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>在封闭液中按 1:300 稀释</td></tr><tr><td>抗 SERPINH1 抗体</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>在封闭液中按 1:250 稀释</td></tr><tr><td>抗 SOX2 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>在封闭液中按 1:100 稀释</td></tr><tr><td>抗 Nestin 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>在封闭液中按 1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗 TUJ1 抗体</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>在封闭液中按 1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗兔抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>在封闭液中按 1:400 稀释；（绿色通道；激发/发射波长 495/519 nm）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 抗小鼠抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>在封闭液中按 1:400 稀释；（红色通道；激发/发射波长 590/617 nm）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 染色液</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>稀释至终浓度为 1.0 &amp;mu;g/mL；（蓝色通道；激发/发射波长 358/461 nm）</td></tr><tr><td colspan="4">供应商为推荐选项，也可使用其他供应商的类似产品。</td></tr></tbody></table>

从死后人脑供体衍生软脑膜外植体培养物

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

尽管帕金森病的临床表征已取得显著进展，但多项研究报道，临床上诊断为帕金森病的病例中，高达25%未得到病理学证实。因此，从临床诊断为特发性帕金森病的患者中采集的组织可能存在较高的误诊率；故 体外 使用此类组织作为帕金森病的临床前模型进行研究可能会徒劳无功。
通过收集经神经病理学确诊为帕金森病的死后人脑软脑膜组织，且该组织具有黑质纹状体细胞丢失以及称为路易小体的细胞内蛋白包涵体的特征，可以确定临床上观察到的帕金森综合征并非由其他潜在疾病过程（例如肿瘤、动脉硬化）引起。
本方案介绍了死后人类软脑膜的解剖与制备，用于建立脑膜成纤维细胞培养体系。该方法稳定可靠，成功率高。由于脑组织获取通常不在无菌条件下进行，因此培养过程中的无菌操作是主要挑战。为此，必须在培养基中添加含有青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素混合物。
从经尸检证实的帕金森病病例中分离脑膜成纤维细胞，为帕金森病的体外建模提供了基础。in vitro 培养的脑膜成纤维细胞通常在样本制备后3-9天出现，约6-8周内可冻存约2000万至3000万个细胞。脑膜成纤维细胞培养物具有均一性，且细胞表达纤维连接蛋白，后者是常用于鉴定脑膜的标志物。

当软脑膜处理方案成功时，脑膜成纤维细胞的生长通常在解剖后3至9天内首次出现，尽管这一时间可能因脑组织的死后间隔时长而有所不同。图1展示了来自四位不同供体的脑膜成纤维细胞培养结果。图1A显示了一个由玻璃盖玻片（深色对角线）固定的软脑膜组织片段，以及来自一位88岁供体（死后间隔时间为10小时20分钟）在处理后第4天出现的成纤维细胞自组织块向外生长的情况。图1B显示来自一位70岁供体（死后间隔时间为11小时45分钟）在处理后第7天出现的稀疏成纤维细胞生长。图1C显示来自另一位88岁供体（死后间隔时间为24小时）在解剖后第13天的成纤维细胞生长情况。图1D显示一个已汇合的培养物，已被传代至T75培养瓶中，此时细胞可进行冷冻保存。
脑膜成纤维细胞呈双极或多个极性，具有细长或不规则的形态（<str...

人死后脑组织软脑膜外植体培养方案是一种技术上稳健且简便的方法，可在6-8周内获得表达纤连蛋白的脑膜成纤维细胞，并可冷冻保存约2000万至3000万个细胞。

尽管在帕金森病的临床表征方面已取得显著进展，但多项研究指出，该疾病的诊断仍存在……

我是Birgitt Schule，帕金森研究所和临床中心脑捐献项目的主任。在本视频中，我们介绍一种从帕金森病患者死后人脑软脑膜中获取外植体细胞培养物并建立原代成纤维细胞的培养技术。这些成纤维细胞可用于多种应用，包括基于细胞的检测分析。这一点非常重要，因为我们可以利用经尸体解剖证实的、具有路易小体病理特征的散发性帕金森病病例的细胞系进行研究。首先，将所有所需材料放入组织培养超净台中。所有进入超净台的物品都必须用70%乙醇喷洒并擦拭干净。第一步是将脑膜从试管转移至切割皿中。首先，将约10毫升磷酸盐缓冲液倒入无菌的10厘米切割皿中。此处可见脑膜。使用无菌镊子小心地将脑膜转移至切割皿中。操作此步骤时应缓慢进行，以防止撕裂。下一步是用 PBS 清洗脑膜，以尽可能去除血液。如果样本血液过多，可考虑将其转移至另一个切割皿中。在新的10厘米培养皿中加入10毫升PBS。重复此洗涤步骤，以持续清除脑膜中的血液。最后，将脑膜转移至一个新的含有 PBS 的 10 厘米培养皿中。操作完成后，盖上培养皿并将其转移至超净台内的解剖显微镜下。下一步是继续将脑膜切割成更小的片段。使用两把无菌手术刀，以轻微刮擦的动作将血管与脑膜轻轻分离。准备出足够大的区域，以便切割出约18块3毫米×3毫米的组织块，如本图所示。然后，取手术刀，采用 rocking motion（摇动动作）将已准备好的区域切成3毫米×3毫米的组织块。建议采用逐步操作的方式，先将脑膜切成较大的组织块，再将这些组织块进一步切割成更小的片段。盖好切割皿，并将其放回组织培养超净台中。接下来，准备将脑膜转移至已预先包被的六孔组织培养板中，包被方法为每孔加入1毫升0.1%明胶，孵育30至60分钟。向每个孔中加入一毫升脑膜培养基。然后，用无菌镊子将三到四个脑膜组织块转移至每个孔的中央。此培养板上生长的细胞为第零代细胞。下一步使用盖玻片以确保脑膜组织固定不动，并与培养皿保持接触。将一个无菌的15毫米圆形盖玻片置于脑膜组织上。如有必要，可用盖玻片重新调整脑膜组织的位置。然后，使用镊子用力下压盖玻片，确保组织块与培养板充分接触。此图像显示了用盖玻片固定住的脑膜组织块。盖上六孔板盖子，小心将板转移至设定为37°C和5%二氧化碳的培养箱中。培养两天后，向每个孔中额外加入一毫升新鲜脑膜培养基。七天后，吸除培养基，然后向每个孔中重新加入2毫升新鲜培养基。第7天后，每隔一天继续向孔板中补充2毫升新鲜培养基。此图像显示了脑膜组织块在倒置显微镜下的初始培养状态。大约6至9天后，可观察到首次细胞迁出并附着。在15至19天之间，细胞数量增加，生长变得更为密集。脑膜成纤维细胞的特征是表达纤连蛋白。这些图像显示了培养的脑膜细胞经染色后对纤连蛋白呈阳性反应。观看本视频后，您应能充分了解如何从死后人类脑组织捐献者中分离软脑膜外植体培养物。该技术可在三至六周内简单而可靠地获得

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从尸检人脑软脑膜捐助外植体培养的推导

本文介绍了在原代培养中获得富集的小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的方法，这些细胞可分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）。此外，本文还描述了一种通过将小鼠OPCs接种于小鼠背根神经节神经元（DRGNs）的神经突网络上，以建立小鼠髓鞘形成共培养体系的技术。...

从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

本方案概述了从胎儿脊髓中分离胶质限制性前体细胞，并在体外进行培养，用于移植或少突胶质细胞谱系研究。...

从小鼠E13胚胎中分离少突胶质细胞限制性前体细胞

本视频展示了一种制备成人人脑游离脑片培养物的技术。使用振动切片机从脑组织切片中制备薄切片，随后将这些切片悬浮于添加了生长因子的培养基中，以维持组织的活性。...

制备成人人类大脑的游离脑片培养

本视频展示了一种建立胶质细胞三维培养的技术。将来源于大鼠脑的胶质细胞包埋在含有细胞外基质成分的光交联聚合物基质中。在培养基中孵育后，胶质细胞在支撑基质内增殖，形成三维培养体系。...

建立大鼠脑源性胶质细胞的三维培养

在胚胎早期脑发育过程中，脑室脑脊液（CSF）包绕神经上皮及大脑皮层前体细胞。本文介绍了从不同发育阶段的啮齿类胚胎中分离脑室脑脊液的方法，以研究其生物学功能。此外，我们还展示了大脑皮层组织外植体的分离与培养技术，该技术可在极少量培养基或脑脊液条件下实现外植体的生长。...

从啮齿类动物胚胎中分离脑脊液并用于离体大脑皮层组织外植体研究

本方案描述了一种通过脑组织捐献项目及对脑组织进行适当表征来追踪个体脑衰老轨迹的方法。脑捐献者参与了一项长期纵向研究，包括系列多维度评估。本方案包含脑组织处理的详细描述以及准确的诊断方法学。...

Abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

我们介绍一种采用针尖弯曲的颅池内注射技术，该针可固定于颅骨上，从而避免对下方实质组织造成损伤。该方法可用于软脑膜细胞的遗传谱系示踪和操作，以及脑脊液流动的追踪研究。...

通过小脑延髓池注射诱导软脑膜细胞修饰

本文介绍了两种优化的实验方案，用于分析中枢神经系统（包括脑、脊髓和脑膜）中的常驻免疫细胞及外周来源的免疫细胞。这些方案有助于确定在稳态和炎症条件下定位于这些解剖区域的细胞的功能与组成。...

分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

本方案介绍了一种从胚胎第17天小鼠脑组织中制备中枢神经系统细胞培养物的独特方法，适用于神经（免疫）学研究。该模型可通过多种实验技术进行分析，包括实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、显微镜检查、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术。...

建立来自小鼠胚胎脑组织的神经元与胶质细胞混合培养体系以研究感染与先天免疫

脑膜淋巴管内皮细胞（LLECs）是一种近期发现的颅内细胞类型，其功能尚不明确。本研究提供了一种可重复的小鼠LLEC分离与培养方案 体外...

软脑膜淋巴管内皮细胞的获取与原代培养

本文介绍了一种从黑色素瘤相关软脑膜病（M-LMD）患者脑脊液中分离循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）并进行扩增的实验方案，旨在建立用于研究M-LMD的临床前模型。...

体外 黑色素瘤患者脑脊液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关性软脑膜病

关键词：黑色素瘤，软脑膜病，循环肿瘤细胞，脑脊液，体外培养，人脑膜细胞，条件培养基，胰岛素样生长因子结合蛋白，VEGF-A，IGF信号通路，MAPK信号通路，小鼠模型，分子表征，功能分析，体内接种&#45;相关性软脑膜疾病

学习从尸检人脑软脑膜组织培养原代成纤维细胞的技术，用于帕金森病细胞系研究。该方法可在六至八周内获得纤维连接蛋白阳性细胞，为神经退行性疾病机制研究提供可靠的细胞模型。

从死后人脑供体衍生软脑膜外植体培养物

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