Name: 制备及文化活动从成年和老年人类骨骼肌成肌前体细胞/成肌细胞主要的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习从成年及老年人体骨骼肌中分离原代成肌细胞的方法，用于肌肉稳态与衰老的功能研究。该方案避免离心应激，保持细胞自然行为，可在两小时内完成，适用于长期培养及表型保留。

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本工作由生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC；BB/L021668/1）、医学研究委员会（MRC）和关节炎研究英国分会共同资助，属于MRC-关节炎研究英国分会肌肉骨骼衰老综合研究中⼼（CIMA）项目，以及惠康信托机构战略支持基金（097826/Z/11/A）。作者谨此感谢利物浦大学的Dada Pisconti博士在肌肉前体细胞分离方面提供的专业知识和建议。

本研究所涉及的所有人体组织实验均事先获得利物浦大学、艾恩特里医院大学医院以及南威尔士研究伦理委员会（批准号：13/WA/0374）的批准，并按照良好实践指南进行操作。利物浦大学是本研究的伦理责任单位。所有供体均已签署知情同意书，同意参与本研究。肌肉组织来自体质指数（BMI &#60;25）的个体：成年组为30 ± 2.8岁，老年组为69 ± 5岁。
1. 培养前准备
<ol>
	<li>用层粘连蛋白包被培养表面
	<ol>
		<li>在1x中配制10 µg/mL层粘连蛋白的工作液&#160;DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）&#160;缓冲盐水</li>
		<li>用移液器加入最少量的层粘连蛋白溶液，使其完全覆盖细胞将要接种的表面（表1。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育至少30分钟。2 在接种细胞前将层粘连蛋白置于培养箱中。操作层粘连蛋白时需小心，避免使用涡旋振荡器。用DPBS稀释成10 µg/mL的工作液后，可于4 °C保存并多次重复使用。</li>
		<li>使用60 mm（20 cm）2) 培养皿或6孔板中的2个孔（2 x 10 cm）2) 每约 18–19 mg 骨骼肌组织加入适量溶液以接种细胞（5.50 × 104 细胞总数）。在进行功能研究的细胞接种时，务必始终进行细胞计数。 
		注意：样本最初取自女性患者（成年组：30 ± 2.8 岁，老年组：69 ± 5 岁，BMI）的足部手术（趾短伸肌、胫骨前肌或拇展肌） &#60;25).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶解溶液的制备
	<ol>
		<li>制备 250 mM CaCl₂2 工作液：277 mg 储存液 CaCl2 在10 mL 1×DPBS中溶解，用0.2 µm滤膜过滤，4 °C保存。</li>
		<li>配制含有 1.5 U/mL 胶原酶 D、2.4 U/mL Dispase II 和 2.5 mM CaCl₂ 的工作液2 在无血清DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中表2).</li>
		<li>充分混匀后，将酶溶液经0.2 µm滤膜过滤以实现灭菌。提前配制酶溶液，并分装后于-20 °C冷冻保存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织消化：机械和酶解离
<ol>
	<li>样本采集后，将肌肉组织置于 4 °C 的 DPBS 中保存，直至进行消化。每 18–19 mg 肌肉组织至少准备 2 mL 胶原酶-分散酶-CaCl2 溶液，并在组织解离前预热至 37 °C。</li>
	<li>将肌肉活检样本短暂浸入 70% 乙醇中，用新鲜 DPBS 洗涤，然后将组织置于含 1 mL 酶解液的新培养皿中。</li>
	<li>尽可能去除纤维化和脂肪组织，并用无菌剪刀或手术刀片（10 号刀片）迅速但轻柔地将肌肉撕成小块但可辨识的碎片（大小约 &#62;0.5 mm2）。</li>
	<li>将样本转移至 50 mL 离心管中，并加入剩余的 1 mL 胶原酶-分散酶-CaCl2 溶液。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育组织 30–40 分钟。每隔 5–10 分钟轻轻振荡离心管，使肌肉组织移动。</li>
	<li>用培养基润洗移液管，以避免释放的细胞黏附于移液管塑料管壁。加入 2 倍体积的无菌生长培养基，例如 4 mL DMEM（含 20% FBS（胎牛血清）、1% L-谷氨酰胺和 1% P/S（青霉素-链霉素）），以终止消化反应。</li>
	<li>用 5 mL 移液管反复吹打数次&#160;，以促进细胞从肌肉纤维中释放。 
	注意：由于样本体积较小，通常已完全解离。然而，若仍有肌肉碎片残留，可对剩余组织使用新鲜酶解液进行第二次孵育。</li>
	<li>将肌肉悬液通过 70 µm 细胞滤网过滤至 50 mL 锥形离心管中。用更多培养基冲洗残留细胞，并再次过滤。</li>
	<li>在室温下以 443 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。小心弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 F-12 培养基（Ham's F-12 营养混合物）中，其中含 20% FBS、10% HS（马血清）、1% P/S、1% α-谷氨酰胺和 2.5 ng/mL bFGF（重组人碱性&#160;成纤维细胞生长因子）。此处每 60 mm 培养皿使用 4 mL 培养基。</li>
</ol>
3. 细胞接种
<ol>
	<li>从培养箱中取出先前用10 µg/mL层粘连蛋白包被的培养容器（见第1.1节）。</li>
	<li>小心移除培养皿中多余的层粘连蛋白，避免接触表面（否则会破坏蛋白结构）。可用DPBS洗涤培养皿（可选）。</li>
	<li>将细胞直接接种到包被有层粘连蛋白的容器上，并在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养24 h&#160;。</li>
	<li>次日，在明场显微镜下观察细胞（总放大倍数100X）。可见圆形的小细胞附着于表面，培养基中仍有部分碎片残留。</li>
	<li>更换为新鲜的F-12培养基，添加20% FBS、10% HS、1% P/S、1% α-谷氨酰胺和2.5 ng/mL bFGF。</li>
</ol>
4. 细胞的培养与传代
<ol>
	<li>每2-3天更换一次培养基&#160;在显微镜下（总放大倍数100倍，示例见 图2，来自老年人的细胞，第0代，培养7天后）以避免自发性分化。</li>
	<li>在第一次传代（P1）时，更换培养基为含20%胎牛血清、10%马血清、1%青霉素-链霉素和1% α-谷氨酰胺的高糖DMEM培养基。从此阶段起避免使用bFGF，因为FGF是一种强效有丝分裂原，在培养初期是重要因子，但若在培养中长期使用，可能促进成纤维细胞过度生长。</li>
	<li>用于细胞传代：
	<ol>
		<li>移除培养基，并用缓冲液洗涤细胞两次&#160;DPBS</li>
		<li>加入至少0.25% EDTA-胰蛋白酶溶液，使其覆盖细胞表面。轻轻晃动以确保所有细胞均被消化液覆盖，在室温下孵育10秒后弃去。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育细胞2 在培养箱中孵育3至5分钟。轻轻敲击并使用亮视野显微镜（总放大倍数100倍）检查，细胞应呈圆形但未完全从表面脱落。若未观察到细胞形态变化，继续孵育5分钟。</li>
		<li>加入5 mL生长培养基（含高糖DMEM，补充20% FBS、10% HS、1% P/S和1% α-谷氨酰胺），收集细胞，充分混匀后将细胞连同新鲜培养基转移至T75培养瓶中。用另5 mL生长培养基重复洗涤残留细胞，共使用10 mL生长培养基（每T75培养瓶总量）。</li>
		<li>为预铺板（建议在第一代传代时进行），将细胞置于湿润、37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2 孵育40分钟。收集未贴壁细胞的上清液，并将其转移至新的T75培养瓶中继续孵育。此步骤可富集成肌细胞，因为大多数成纤维细胞已在第一个培养瓶中贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每2-3天更换一次培养基&#160;当细胞达到70%融合度时，立即以1:4比例传代培养&#160;以获得最大产量。</li>
	<li>细胞达到70%–80%融合度后，更换为分化培养基（DM）：高糖DMEM培养基添加2% HS、1% P/S和1% α-谷氨酰胺，以诱导分化。细胞应在5–7天内完成分化。&#160;取决于成肌细胞培养物的质量和纯度。</li>
</ol>
5. 转染实验方案
<ol>
	<li>在12孔板中每孔接种50,000个细胞，用于MF20、衰老和活力检测。将细胞培养在盖玻片上或涂有层粘连蛋白的培养皿中。进行Ki67染色时，在12孔板中每孔接种25,000个细胞。</li>
	<li>进行转染时，按照制造商的操作说明，每孔使用5 µL转染试剂、100 nM对照microRNA模拟物或抑制剂、100 nM microRNA模拟物或100 nM microRNA抑制剂，总体积为1 mL。</li>
	<li>转染后6 h&#160;更换为分化培养基（高糖DMEM，添加2%马血清、1%青霉素/链霉素和1% α-谷氨酰胺）。进行增殖实验时，在转染后2 d对细胞进行染色；进行衰老检测时，在转染后7 d进行染色；进行MF20染色时，在转染后七天进行染色。</li>
</ol>
6. 细胞免疫染色
<ol>
	<li>Ki67、MyoD 和 MF 20 免疫染色
	<ol>
		<li>配制封闭液1（含10% HS和0.1% Triton-X的PBS溶液）和封闭液2（含10% HS和0.05% Triton-X的PBS溶液）。对于12孔板，每孔使用500 µL试剂。 
		注意：以下步骤中的孵育操作需使用摇床进行。</li>
		<li>移除细胞中的培养基。</li>
		<li>用 PBS 清洗细胞。</li>
		<li>用预冷的甲醇在摇床上固定细胞 10 分钟。</li>
		<li>除去细胞中的甲醇，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>加入封闭液1，室温下在摇床上孵育细胞1小时。</li>
		<li>加入一抗溶液：Ki67染色使用Ki67兔单克隆抗体（Rabbit mAb to Ki67，1:1,000稀释于封闭液2中）；MyoD染色使用MyoD1 (D8G3) XP 兔单克隆抗体（Rabbit mAb，1:100稀释于封闭液2中）；MF 20染色使用MYH1E（MF 20）一抗（DSHB，1:1,000稀释于封闭液2中）。</li>
		<li>将细胞与一抗在摇床中室温孵育1小时或4 °C过夜。</li>
		<li>收集一抗（若保存在4 °C，可重复使用多次）。</li>
		<li>用 PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>加入相应的二抗：Ki67 或 MyoD 染色使用山羊抗兔 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488 标记（1:1,000 稀释于 PBS 中）；MF 20 染色使用山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488 标记（1:1,000 稀释于 PBS 中）。</li>
		<li>将含有细胞的培养板包裹好，在室温下于摇床上避光孵育二抗 2 小时。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次&#160;用 PBS 洗涤 5 分钟&#160;每次</li>
		<li>加入DAPI溶液（PBS中1:1,000稀释），覆盖细胞，在室温下于摇床上孵育5–10分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次&#160;用 PBS 洗涤 5 分钟&#160;每次</li>
		<li>加入 1 mL 新鲜的 PBS。</li>
		<li>将细胞爬片置于封片液中，或用封口膜密封含有细胞的 PBS 培养板，以防止蒸发。</li>
		<li>4 °C 下保存。</li>
		<li>尽快使用荧光显微镜观察细胞（不超过2周）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活力检测
	<ol>
		<li>移除细胞中的培养基。</li>
		<li>用 PBS 清洗细胞。</li>
		<li>加入用 PBS 稀释的 1:1,000 溴化乙锭和 1:1,000 喹吖因橙。 
		注意：请谨慎操作并遵守健康与安全规范——溴化乙锭为致癌物。</li>
		<li>将含有细胞的培养板用染色液包裹，在室温下于摇床上孵育5分钟。</li>
		<li>使用荧光显微镜拍摄细胞图像：绿色通道用于吖啶橙，红色通道用于溴化乙锭。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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无任何披露内容。

本文介绍一种简单、可靠、经济、可重复且高效的分离方法，用于从成人及老年个体的趾短伸肌、胫骨前肌或拇展肌中获取肌肉前体细胞/原代成肌细胞。该方案旨在支持利用成人及老年个体原代成肌细胞开展研究，尤其适用于无法或难以实施流式细胞术（FACS）或磁珠分选（MACS）等更复杂技术的情况。
本论文所述的分离方法大约需要2小时。在肌肉分离过程中，需用70%乙醇洗涤肌肉，以避免污染。在进行肌肉的酶解离之前，应将肌肉切成小块但肉眼仍可见的大小，并避免因过度剪碎而造成细胞损伤。消化过程可使肌纤维解离，并释放出卫星细胞和成肌前体细胞。以我们处理约20 mg骨骼肌组织的情况为例，使用一个60 mm（20 cm2）的培养皿是收集细胞最合适的表面积。将细胞接种到较大表面积的培养皿中会导致增殖能力下降，而接种到较小表面积的培养皿中则会导致细胞死亡增加以及细胞聚集现象。
分离后，细胞在包被有层粘连蛋白的培养板上进行培养和扩增。使用未包被的表面往往会降低分离的成功率。因此，建议在分离后直接于预包被的表面上收获细胞。若在分离后直接于未包被的表面上收获细胞，则培养物中将主要为成纤维细胞富集的细胞群，而非来源于成肌细胞的细胞。除层粘连蛋白外，也可使用其他促进细胞贴附的溶液，如Matrigel和基于胶原蛋白的试剂。这些包被溶液可能含有促进细胞生长的生长因子及其他化合物，但可能改变细胞行为，从而影响实验结果。根据我们的经验，10 µg/mL的层粘连蛋白是卫星细胞和成肌细胞贴附与增殖的最佳浓度，也是合适的包被试剂，因其不含任何生长因子或其他补体成分。此外，层粘连蛋白天然存在于基底膜中，直接与肌膜相连，在卫星细胞贴附及沿骨骼肌纤维迁移过程中发挥关键功能。
培养基中的添加剂也可能对原代成肌细胞的行为产生不利影响。例如，FGFs 或 IGFs 等生长因子家族对原代成肌细胞培养具有多效性作用，其中 FGF-2 可同时调控有丝分裂和程序性细胞死亡反应31。因此，严格控制培养条件十分必要，尤其是因为从成年和老年个体肌肉中分离的原代成肌细胞在行为上的差异，很可能源于培养物的纯度以及长期培养过程中成纤维细胞过度生长而取代成肌细胞的可能性35。我们采用在首次传代时将细胞在未包被的表面进行1小时预贴壁的方法，以减少成纤维细胞对培养物的污染。
我们所描述的方法适用于从成年及老年个体的肌肉中分离成肌祖细胞。所分离的细胞包含典型的成肌细胞群体，表现为高比例的成肌细胞（通过MyoD表达及MF20免疫染色显示的成肌特性） 图1 和 2）并可作为 体外 用于肌肉稳态相关过程功能研究的模型。
既往研究已对从成年人和老年人体内分离出的人原代成肌细胞的特性差异或无显著差异进行了表征6,20,27,28,29,30,31,35,36,37,38。已有研究证实，存在老年性或功能丧失的人类肌肉前体细胞（MPCs）6,20,22。然而，也有研究显示，新分离的人类MPCs在行为上并无明显差异27。本方案可实现原代成肌细胞的分离，这些细胞至少能部分保留其表型特征，例如从老年人肌肉组织中分离出的原代成肌细胞增殖能力下降或出现衰老现象，并可用于衰老过程中肌肉稳态分子机制的功能性研究22。
采用本方法分离得到的原代成肌细胞不仅可用于成肌分化研究，还可用于探究细胞内变化，例如人类成肌前体细胞在衰老过程中发生的基因表达变化。然而，在细胞长期培养过程中可能发生的变化 离体 在分析衰老过程中发生的表型和基因型变化时，需要考虑细胞培养的影响。我们建议为此目的使用 freshly isolated cells。
此外，本文所述的原代成肌细胞培养方法可实现人原代成肌细胞的扩增和相对长期的培养，从而支持稳定的实验操作 体外 功能研究。我们先前已证明，通过本方法分离的成肌祖细胞可用于与肌肉衰老相关过程的表达谱分析及功能研究22该方法同样适用于成年和老年啮齿类动物的肌肉，可分离获得富含成肌细胞的培养物，用于衰老过程中基因和表观遗传变化的分析以及功能研究22该方法的局限性包括所使用的细胞在一定程度上为混合细胞群体，而非通过更复杂的已发表方法所能获得的纯卫星细胞群体。6,28,29,39,40,41,42,43.
我们提供一种简化、经济且可重复的方案，用于从成年及老年个体中分离原代成肌细胞。根据我们的经验，现有的一些更为复杂的人类原代成肌细胞分离与培养方法（例如通过MACS或FACS分选的卫星细胞）适用于某些特定类型的研究，如细胞转录组或蛋白质组变化的分析。然而，这些方法成本较高，需要一定程度的专业技术，且由于纯化的原代成肌细胞增殖速率较低，成纤维细胞容易过度生长并污染成肌细胞，因此实际操作可能较为困难。
我们提供了一种可重复的实验方案，可简便地分离和培养人原代成肌细胞，用于功能研究。此外，我们建议使用层粘连蛋白42以及有限使用bFGF作为成功培养的关键因素44。我们还建议在细胞传代时避免离心所造成的影响，并在首次传代时省略一次预铺板步骤45。综上所述，我们优化了一种高效分离和培养成人及老年个体肌肉中原始成肌细胞/MPCs的实验方案，该方案同样适用于啮齿类动物肌肉组织，并可用于肌肉稳态相关基因表达及功能研究。

与疾病和衰老相关的骨骼肌质量和功能进行性丧失会导致老年人虚弱、力量下降以及生活质量降低。骨骼肌约占体重的40%1在衰老和疾病过程中，由于脂肪浸润和纤维化导致肌纤维质量下降，单个肌纤维进行性萎缩，肌肉质量减少1,2,3,4,5,6. 最近有研究提出，骨骼肌衰老存在物种特异性差异，具体而言，在啮齿类动物中出现的肌纤维丢失现象在人类中可能并不存在。7然而，老年哺乳动物中残存的肌纤维表现出对损伤的易感性增加以及再生能力受损。8. 成年肌肉的修复与维持由卫星细胞介导9,10肌肉损伤及其他相关信号出现时，卫星细胞被激活并开始增殖。其中一部分细胞返回静息状态，其余细胞则分化为成肌细胞（成肌祖细胞 -&#160;MPCs）。这些细胞有助于现有肌纤维的修复11卫星细胞的功能决定了肌肉再生的成败，且已证实随着年龄增长，卫星细胞的可利用性会发生改变。12,13,14,15此外，来自老年人类和啮齿类动物肌肉的卫星细胞表现出转录谱的转变&#160;再生潜能降低16,17,18,19老年小鼠和人类肌肉中的卫星细胞也已被证实会经历衰老，导致其功能下降20.
最常用于研究肌肉稳态的细胞系是小鼠C2C12细胞系21大量研究也使用了小鼠原代成肌细胞22这些培养体系促进了对小鼠及脊椎动物肌生成、肌肉再生，以及在肌肉疾病和衰老过程中发生的肌管/肌纤维萎缩与肥大过程的深入理解。23,24,25,26最近，一些研究团队描述了使用人原代成肌细胞来研究肌生成和肌肉衰老。然而，对于从成人和老年人肌肉中分离的原代成肌细胞之间的差异，目前尚无统一共识。27,28,29,30,31尽管在发育、衰老和疾病过程中系统性和局部环境存在差异 6,32,33,34, 体外 成肌细胞和肌管细胞培养物仍是研究肌肉发育、生长和萎缩相关分子机制最易获取的工具。此外，这些研究不仅具有高度可靠性，而且相对快速、经济，并可实现高通量分析 体外 工具。此外，由于人类肌肉研究涉及伦理问题，因此在涉及基因表达调控的功能实验中体外 人类成肌细胞和肌管培养物仍是脊椎动物模式生物之外唯一可用的替代方案。
本文展示了一种简单、经济且可重复的实验方案，用于从成年及老年个体的肌肉组织中有效分离原代成肌细胞（即肌前体细胞，MPCs），并描述了标准化的培养条件 体外 培养图1）。由于肌肉原代培养物通常除成肌细胞外还含有成纤维细胞，我们建议进行预贴壁步骤，以提高原代成肌细胞的纯度和质量。总之，我们建立了一种方案，可从成年及老年个体的骨骼肌中高效、可重复地分离、培养并开展富集且具有功能的肌肉前体细胞/原代成肌细胞的功能研究。

<table><tbody><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Greiner Bio One</td><td>628160</td><td>Cellstar 细胞培养皿，聚苯乙烯，60/15 毫米，带通风孔</td></tr><tr><td>细胞培养板（6孔）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3516</td><td>Corning Costar 细胞培养板，6 孔，平底（单独包装）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞培养板（12孔）</td><td>Greiner bio-one</td><td>657 160</td><td>Cellstar 细胞培养多孔板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养瓶</td><td>Greiner Bio One</td><td>&amp;nbsp;690175（25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）；658175（75 厘米&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;).</td><td>Cellstar 滤帽细胞培养瓶</td></tr><tr><td>标准一次性手术刀</td><td>格兰顿</td><td>91310</td><td>无菌不锈钢刀片，型号：10。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Greiner bio-one</td><td>606 180（5 mL）；607 180（10 mL）；760 180（25 mL）</td><td>Cellstar 血清移液管&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>巴斯德塑料移液管</td><td>Starlab</td><td>E1414-0311</td><td>3.0 mL 刻度巴斯德吸管（无菌），独立包装。</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>300613</td><td>20 mL BD 偏心尖端注射器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤光片</td><td>Gilson</td><td>ALG422A</td><td>无菌注射器滤器 CA 0.2 &amp;micro;m 33 mm Pk50</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td>细胞培养滤网，无菌，独立包装，70 μm &amp;micro;m 聚丙烯。</td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏</td><td>11088882001</td><td>胶原酶D；活性： &amp;ge;0.15 U/mg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td>来自多粘芽孢杆菌的Dispase II蛋白酶。活性： &amp;ge;0.5 U/mg 固体</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td>无水氯化钙，珠状 &amp;minus;10 目筛网， &amp;ge;99.9% 痕量金属基准&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9&amp;nbsp;</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜来源的层粘连蛋白。1 mg/mL。</td></tr><tr><td>DMEM-高糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;高糖培养基。含4,500 mg/L葡萄糖和碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠。</td></tr><tr><td>F-12 培养基</td><td>Gibco</td><td>21765029</td><td>Ham's F-12 营养混合物，1×，含 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>FGF-b</td><td>PetroTech</td><td>100-18B&amp;nbsp;</td><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>马血清（HS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1270</td><td>马血清。供体马群，美国来源，经无菌过滤。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>青霉素-链霉素溶液，每毫升含10,000单位青霉素和10毫克链霉素，溶于0.9% NaCl，经无菌过滤。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>L-谷氨酰胺溶液。200 mM，溶液，经无菌过滤。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，经无菌过滤。</td></tr><tr><td>TrypLE Express&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>TrypLE Express 酶（1x），无酚红</td></tr><tr><td>DPBS（细胞培养）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液。改良型，不含氯化钙和氯化镁。</td></tr><tr><td>PBS（免疫染色）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>磷酸盐缓冲液片剂。每200 mL去离子水中加入一片（0.01 M磷酸缓冲液，0.0027 M氯化钾和0.137 M氯化钠，pH 7.4）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>M/4000/PC17</td><td>甲醇分析纯试剂</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>分子生物学用 Triton X-100</td></tr><tr><td>抗MF 20抗体</td><td>DSHB</td><td>MF20-c 2ea 211 &amp;micro;g/ml</td><td>MYH1E (MF 20) 小鼠单克隆抗体</td></tr><tr><td>抗MyoD抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>13812P</td><td>MyoD1 (D8G3) XP 兔单克隆抗体</td></tr><tr><td>抗Ki67抗体</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>兔单克隆抗体 Ki67 [SP6]</td></tr><tr><td>抗小鼠488二抗&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td></tr><tr><td>抗兔488二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11034</td><td>山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td></tr><tr><td>衰老 &amp;beta;β-半乳糖苷酶染色试剂盒</td><td>细胞信号技术公司</td><td>9860</td><td>衰老 &amp;beta;-半乳糖苷酶染色试剂盒</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>二甲基亚砜。BioUltra，分子生物学用， &amp;ge;99.5%（气相色谱）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吖啶橙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8097</td><td>盐酸吖啶橙溶液，10 mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>溴化乙锭溶液。BioReagent，分子生物学用，10 mg/mL 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668019</td><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td></tr><tr><td>转染实验的阴性对照</td><td>Qiagen</td><td>1027271</td><td>miScript 抑制剂阴性对照（5 nmol）</td></tr><tr><td>hsa-miR-378a-3p miScript 引物检测</td><td>Qiagen</td><td>218300</td><td>Hs_miR-422b_1 miScript 引物检测（靶向成熟 miRNA：hsa-miR-378a-3p）。MIMAT0000732：5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>抗hsa-miR-378a-3p miScript miRNA抑制剂</td><td>Qiagen</td><td>219300</td><td>抗 hsa-miR-378a-3p miScript miRNA 抑制剂（靶向成熟 miRNA：hsa-miR-378a-3p）。MIMAT0000732：5'-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC</td></tr><tr><td>Megafuge 2.0 R 离心机</td><td>Heraeus</td><td>75003085</td><td>n/a</td></tr><tr><td>离心机转子</td><td>Heraeus</td><td>3360</td><td>Heraeus Sepatech Megafuge 离心机转子 BS4402/A。最大半径：15.5 cm。</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E 倒置显微镜系统</td><td>尼康</td><td>n/a</td><td>目镜：CFI 10X/22；总放大倍数：100X（MF20，活/死细胞染色和Ki67）。</td></tr><tr><td>Axiovert 200 倒置显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>n/a</td><td>目镜：Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10X/25；总放大倍数：100X（衰老） &amp;beta;- 半乳糖苷酶染色</td></tr><tr><td>Axiovert 25 倒置显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>n/a</td><td>目镜：E-PL 10X/20。总放大倍数：100X（明场）。</td></tr><tr><td>Diaphot 倒置组织培养显微镜</td><td>尼康</td><td>n/a</td><td>目镜：CFWN 10X/20。总放大倍数：100X（明场）。</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>国家诊断公司</td><td>HS-106</td><td>Hydromount</td></tr></tbody></table>

成人及老年人大骨骼肌中肌源性前体细胞/原代成肌细胞的分离与培养

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

骨骼肌稳态依赖于肌肉生长（肥大）、萎缩和再生。在衰老过程及多种疾病中，会出现肌肉消耗现象。肌肉质量和功能的丧失与肌纤维类型萎缩、纤维类型转换、卫星细胞（肌肉干细胞）功能障碍导致的肌肉再生缺陷以及其他病理生理过程相关。这些变化与细胞内以及局部和全身微环境的改变有关。除了最常用的啮齿类动物肌肉衰老模型外，还需要利用人类模型来研究肌肉稳态和消耗，但由于伦理限制，这类模型主要由体外培养系统构成。尽管人类成肌祖细胞（MPCs）和原代成肌细胞在成肌研究中被广泛使用，但利用来自成人和老年人的原代成肌细胞和肌管细胞培养体系来研究与年龄相关肌肉消耗不同方面的分子机制仍缺乏足够的数据，而这有助于验证在啮齿类动物肌肉中提出的衰老机制。使用从成人和老年人分离的人类MPCs、原代成肌细胞及肌管细胞，可为研究与肌肉生长、萎缩和再生相关过程的分子机制提供一个生理上相关的模型。本文详细描述了一种稳健、经济、可重复且高效的实验方案，用于通过酶消化法从人类肌肉样本中分离和维持人类MPCs&#160;及其后代——成肌细胞和肌管细胞。此外，我们确定了来自成人和老年人的原代成肌细胞在体外培养中发生衰老的具体传代次数。最后，我们展示了这些成肌细胞的转染能力，并对其增殖和分化能力进行了表征，提出其适用于在体外开展成肌及肌肉消耗相关分子机制的功能性研究。

将细胞接种至层粘连蛋白包被的表面后24小时，应可见MPCs/原代成肌细胞（图2）。细胞应呈纺锤形，并在第4代时仍表达MyoD（图1A, B）。成纤维细胞可通过其星状形态及不表达MyoD加以区分（图1B, C）。次日细胞贴壁后，应更换为新鲜的bFGF培养基。此后每48小时更换一次培养基。
此处展示的代表性结果以及我们实验室已发表的数据22旨在支持我们所采用的分离与培养方案，并展示可用于人原代成肌细胞功能研究的各种技术。可通过Ki67免疫染色检测成肌细胞的增殖情况，通过细胞活力染色检测细胞活力（图3）。进行分化实验时，应将培养基更换为分化培养基。通常在5–7天内形成肌管，且应呈肌球蛋白重链阳性（图3）。需要注意的是，当从老年人肌肉组织中分离成肌细胞时，肌管的形成效率可能较低（图3）。此外，还可进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-galactosidase）染色，以确定培养物中衰老细胞所占比例（图3）。我们观察到，在长期培养条件下（图3，第4代），从老年人肌肉组织中分离的成肌细胞出现衰老现象的比例更高。
在功能研究中，可利用脂质体转染试剂介导的表达载体、siRNA、microRNA 模拟物和 antimiR 的递送来调控基因和 microRNA 的表达（图4）。该方法可实现 40 - 70% 的转染效率，使基因/microRNA 水平在生理范围内上调或下调（图4；22）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养容器</td>
			<td>近似面积（每孔）</td>
			<td>10 µg/mL 层粘连蛋白的体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm 培养皿</td>
			<td>10 cm2</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm 培养皿</td>
			<td>20 cm2</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm 培养皿</td>
			<td>60 cm2</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 孔板</td>
			<td>2 cm2</td>
			<td>200 µL/孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 孔板</td>
			<td>4 cm2</td>
			<td>500 µL/孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 孔板</td>
			<td>10 cm2</td>
			<td>1 mL/孔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25</td>
			<td>25 cm2</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75</td>
			<td>75 cm2</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 包被培养表面所需层粘连蛋白-DPBS溶液（10 µg/mL）的推荐最小体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>比活性/摩尔质量</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>配制 10 mL 溶液所需的质​​量或体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原酶 D</td>
			<td>0.15 U/mg</td>
			<td>10 mg/mL (1.5 U/mL)</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分散酶 II</td>
			<td>0.5 U/mg</td>
			<td>4.8 mg/mL (2.4 U/mL)</td>
			<td>48 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mM CaCl2</td>
			<td>110.98 g/mol</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 肌肉消化用酶的制备。
<img alt="肌肉活检细胞分离示意图，包括机械解离、酶消化、离心。" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 本实验方案步骤的图示摘要。 使用剪刀或外科手术刀对人肌肉活检组织进行解离（I）。在37 °C条件下，用酶解液孵育30–40分钟（II）。加入生长培养基终止消化，并将溶液经70 µm孔径滤膜过滤至离心管中（III）。在443 × g条件下离心5分钟（IV）。弃去上清液，将沉淀重悬于含有2.5 ng/mL FGF的生长培养基中（V）。将细胞接种至预先包被10 µg/mL层粘连蛋白的培养皿中，并在24小时后更换培养基（VI）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞衰老显微镜观察；成年与老年细胞，相差显微镜，免疫荧光，MyoD分析。" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 来自成年和老年个体肌肉组织的不同传代次数分离的成肌细胞。A. 图像显示从女性患者（成年组：30 ± 2.8岁，老年组：69 ± 5岁，BMI&lt;25）的趾短伸肌、胫骨前肌或拇展肌中分离的成肌细胞。在第0代、接种后5天时，细胞仍呈圆形且体积较小，但在明场显微镜下可见（A）。随后成肌细胞逐渐呈现延长形态，如第2代所示（A）。MyoD在成肌细胞中表达，但在成纤维细胞中不表达（B）。图中显示MyoD阳性细胞的定量结果；误差线表示标准差；n = 3（B）。代表性图像展示成肌细胞与成纤维细胞形态学差异（C）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像；成体与衰老样本中的细胞活力、增殖、分化和衰老。" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 可使用不同染色技术对人原代成肌细胞进行表征。 细胞活力可通过细胞活力检测染色进行可视化，增殖情况可通过Ki67免疫染色进行评估，分化情况可通过MF20（肌球蛋白重链）免疫染色进行评估，而衰老情况则可通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-galactosidase）染色进行可视化。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="miR-378 表达的荧光显微镜观察，细胞骨架染色；相对表达量的柱状图" src="/files/ftp_upload/55047/55047fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 人原代成肌细胞可用于肌肉稳态功能研究 体外. A. 成人人类原代肌管细胞分化后的MF20（肌球蛋白重链）免疫染色，显示miR-378过表达或抑制对肌管大小和数量的影响。 B. qPCR检测显示，在人原代成肌细胞中过表达或抑制miR-378后，miR-378及其经验证的靶基因Igf1r的相对表达水平。数据分别相对于Rnu-6和β-2-microglobulin进行归一化。误差线表示标准误（SEM）；n = 3，* - p < 0.05&lt;0.05，Student T 检验。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55047/55047fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种从成年及老年个体的骨骼肌中分离和培养成肌细胞前体细胞的可靠、可重复且简便的方法。所使用的肌肉包括足部和腿部肌肉。该方法能够分离获得富集的原代成肌细胞群体，用于功能研究。

骨骼肌稳态依赖于肌肉生长（肥大）、萎缩和再生。在衰老过程及多种疾病中，肌肉流失……

本方案的总体目标是提供一种稳健、可重复且简便的方法，用于从成年及老年个体中分离原代肌母细胞。本方案提出了一种优化的原代人肌母细胞分离流程，可作为体外模型用于研究与衰老过程中肌肉稳态相关功能的实验。本方案通过避免离心等应激因素，维持细胞的天然特性，并支持原代肌母细胞的分离及长期培养以保持其表型。开始此操作前，准备一个60毫升的培养皿或六孔板中的两个孔。接着，用移液器加入足量的层粘连蛋白溶液，以完全覆盖培养皿表面。然后，在接种细胞之前，将培养皿置于37摄氏度的湿润培养箱中孵育至少30分钟。接下来，在无血清的DMEM中配制酶溶液。充分混匀后，将酶溶液通过0.2微米滤膜过滤以实现灭菌。在采集样本后，将肌肉组织置于4°C的DPBS中保存，直至进行消化处理。对于18至20毫克的肌肉组织，准备至少2毫升的酶解溶液，并在组织解离前将其预热至37摄氏度。接着，将肌肉活检样本短暂浸入70%乙醇中，用新鲜的DPBS洗涤，再用70%乙醇洗涤，然后将组织置于新的培养皿中，加入足量的酶解溶液以完全覆盖样本。尽可能弃去纤维化和脂肪组织，轻柔地将肌肉撕成小块但仍可辨识的组织碎片。随后，将样品转移至含有至少1毫升酶解液的50毫升离心管中。在37°C条件下孵育组织最多30至40分钟，每隔5到10分钟轻轻振荡离心管以搅动肌肉组织。接下来，用培养基包被移液管，以防止释放的细胞黏附在移液管的塑料管壁上。然后加入 4 mL 无菌生长培养基以终止消化反应。反复吹打数次，以促进细胞从肌纤维上脱落。随后，将肌肉溶液通过置于50毫升锥形管上的70微米细胞筛过滤。用更多培养基洗涤残留细胞，并再次通过细胞筛过滤。然后，在室温下离心样品5分钟，使细胞沉淀。5分钟后，小心弃去上清液。接着，将沉淀溶解于F12培养基中。在此步骤中，从培养箱中取出先前包被有层粘连蛋白的培养容器。小心移除培养皿中多余的层粘连蛋白，避免触碰表面。然后用DPBS轻轻洗涤培养皿。接下来，将细胞直接接种到包被有层粘连蛋白的容器中，并在37摄氏度的湿润培养箱中培养24小时。次日在明场显微镜下观察细胞。小的圆形细胞会贴附在表面，剩余的碎片应可见于培养基中。随后，将培养基更换为新鲜的F12培养基。在此过程中，每两到三天更换一次培养基，并在显微镜下观察到细胞成簇出现时立即进行传代，以避免自发性分化。进行细胞传代时，移除培养基，并用DPBS洗涤细胞两次。加入足以覆盖细胞表面的最少体积的0.25% EDTA胰蛋白酶溶液。轻轻摇动以确保所有细胞均被消化液覆盖，室温孵育10秒后移除。随后，将细胞置于37摄氏度的湿润培养箱中孵育三至五分钟。轻轻敲击并使用亮视野显微镜检查，确认细胞已变圆但尚未完全从表面脱落。然后加入五毫升培养基以收集细胞，充分混匀，并将含有细胞的培养基转移至T75培养瓶中。随后，用另外5毫升培养基洗涤剩余细胞。在第一代进行预贴壁时，将细胞在37摄氏度下孵育40分钟至1小时。之后收集含有未贴壁细胞的上清液，并将其接种于新的T75培养瓶中继续孵育。这将有助于富集培养物中的肌母细胞，因为大多数成纤维细胞应在第一代培养瓶中已贴壁。每两到三天更换一次培养基，并在细胞融合度达到70%时立即进行传代。进行分化时，当细胞达到70%至80%融合度时，更换为分化培养基。细胞应在5至7天内完成分化，具体时间取决于成肌细胞培养物的质量和纯度。在第0代且接种后5天，细胞仍呈圆形且体积较小，但在明场显微镜下可见。随后，成肌细胞将呈现类似传代过程中的细长形态。如图所示，MyoD 在成肌细胞中表达，但在成纤维细胞中不表达。可通过细胞活力染色、Ki67 免疫染色检测增殖、MF20 免疫染色检测分化以及衰老相关 β-半乳糖苷酶染色检测衰老，对人原代成肌细胞进行表征。原代成肌细胞可用于功能分析。本图显示成人来源的人原代肌管细胞经分化后，通过MF20免疫染色观察miR-378过表达或抑制对肌管大小和数量的影响。qPCR分析表明，在人原代成肌细胞中转染miR-378模拟物和anti-miR后，miR-378的相对表达水平发生改变，同时其已验证的靶基因LGF1R的表达也随之变化，证实miR-378过表达或抑制实验成功。一旦掌握，该技术可在两小时内完成。当细胞分选等其他更复杂且昂贵的方法无法实现或不具可行性时，这一稳健且可重复的实验方案尤为适用。这种简化的技术有助于肌肉领域研究人员利用人源体外模型系统探究衰老现象。总之，本方法能够从成年及老年个体的肌肉组织中分离出成肌祖细胞，用于体外功能研究，且该方法也可应用于动物模型。

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