培养 秀丽隐杆线虫 在实验室中进行三维培养

本实验的总体目标是构建一种三维线虫培养系统，以更好地模拟自然条件。该方法可解答秀丽隐杆线虫（C elegans）发育、生理学和行为学领域的关键问题。我们最初是在研究腐烂水果（一种三维环境）中自然状态下的线虫行为时，提出了该方法的构想。

与标准的二维培养技术相比，该技术具有优势，因为线虫在自然界中生活在三维环境中。尽管该方法是为秀丽隐杆线虫（C elegans）培养而开发的，但也可应用于其他线虫。本实验操作将由我实验室的研究生李 Tong Young 演示。

开始此操作时，将制备好的溶液在121摄氏度下灭菌15分钟。接下来，配制50毫升无菌胆固醇溶液，浓度为5毫克/毫升。在50毫升锥形管中加入0.25克胆固醇和50毫升99.99%乙醇，充分混匀。

接下来，使用50毫升注射器和0.45微米带通气孔的注射式滤器对胆固醇溶液进行灭菌，并去除任何未溶解的胆固醇。然后，用细菌接种10毫升的LB培养基（Lysogeny Broth）。将接种后的细菌在37°C的摇床培养箱中过夜培养。

在进行连续稀释前，将九毫升氯化钠溶液分配至七个无菌的15毫升锥形管中。以制备大肠杆菌Opi 50菌株的第七次十倍稀释液。随后，取一毫升细菌培养物或稀释后的细菌培养物，加入含有九毫升氯化钠溶液的新锥形管中。

充分涡旋混匀。制备细菌培养物后，在500毫升锥形瓶中加入0.6克氯化钠、1克颗粒状螺旋藻和0.5克蛋白胨。将磁力搅拌子放入锥形瓶中。

然后加入195毫升蒸馏水，并用铝箔覆盖烧瓶。接着，在121摄氏度下高压灭菌样品15分钟。随后，将热的高压灭菌烧瓶放入搅拌仪中，以中等速度搅拌至少两小时，直至温度降至40摄氏度。

或者，可将烧瓶置于40摄氏度水浴中15分钟，使其冷却至40摄氏度，然后再转移至摇床平台上。务必充分冷却，否则从这一步继续操作时温度过高可能导致最终制备的胶状物出现浑浊，而温度过低则可能导致胶状物过早硬化。

当螺旋培养基的温度达到 40 摄氏度时，加入氯化钙、胆固醇溶液、硫酸镁和磷酸钾缓冲液，并继续搅拌溶液。进行 NGT-3D 寿命测定实验时，向培养基中加入 80 微升 150 毫摩尔的 FUDR，使终浓度为 120 微摩尔。然后，将六毫升螺旋培养基转移至无菌锥形管中，并在培养箱中保温。

该培养基将用于形成无菌的上层。接下来，在无菌操作台中，将六毫升稀释后的细菌培养液直接加入锥形瓶中。对于NGT-3D，将6.5毫升培养基倒入8毫升透明塑料试管中，以形成细菌螺旋层。

然后小心地将 200 微升无菌培养基加到半固态 3D 培养基上方，形成一层薄的无菌覆盖层。接着紧密盖上培养室的盖子。对于 NGB-3D，将 65 毫升培养基倒入一个 25 平方厘米的透明塑料细胞培养瓶中。

然后将培养皿置于室温下垂直放置一周，使细菌菌落生长至至少一毫米直径的显著大小。在此步骤中，挑取一条L4期线虫并将其转移至不含细菌的NGM平板上。随后让线虫自由活动数分钟，以去除其体表携带的细菌。

再重复该步骤两次。之后，小心地将清洁的线虫放置于3D培养基表面。线虫应已实际进入3D螺旋基质内部。

然后松散地盖上盖子，在 20 摄氏度下孵育 96 小时。四天后， tightly 盖上盖子，将 NGT-3D 培养室放入 88 摄氏度的水浴中以融化螺旋推进器。使用玻璃移液管，将融化的培养基转移至直径九厘米的塑料培养皿中。

随后，使用透射式立体解剖显微镜，统计处于 L3、L4 和成虫阶段的线虫数量。如图所示，NGT-3D 的构建是一种简单直接的方案，可获得装有螺旋分布且间距均匀的小菌落的螺旋填充试管。为验证秀丽隐杆线虫（C. elegans）是否能在 NGT-3D 中正常还原并生长，需在三维条件下与标准的二维 NGM 平板对比其繁殖力和幼虫发育情况。

在相对子代数量检测中，当细菌菌落数量充足（至少60个菌落）时，NGT-3D中的成年秀丽隐杆线虫雌雄同体的繁殖能力与标准2D MGM培养皿中的雌雄同体相当。此外，当细菌菌落丰富时，NGT-3D中的幼虫发育也正常进行，96小时后大多数线虫处于成虫状态。然而，如果3D基质中的细菌菌落稀疏，则相对子代数量和幼虫发育均会受到负面影响。

这是野生型秀丽隐杆线虫在NGT-3D或NGM平板上的生存曲线。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在完成此操作后，可进一步开展寿命测定和行为分析等其他方法，以回答有关三维环境中衰老与行为的问题。

该技术开发之后，可为遗传学领域的研究人员探索秀丽隐杆线虫（C elegans）的生态学与进化相关问题开辟道路。观看本视频后，您应能很好地掌握如何在三维实验室环境中培养线虫。