Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

该方法的总体目标是评估特定癌基因序列中尿液游离 DNA 的完整性。这种方法可以帮助回答泌尿系统癌症领域的关键问题，例如膀胱癌和前列腺癌的早期无创诊断。这种技术的主要优点是易于作和分析。

该技术的意义延伸到泌尿系统恶性肿瘤的诊断，因为它们通常会释放尿液中的细胞和游离核酸。虽然这种方法可以提供对尿液样本的了解，但它也可以应用于其他系统，例如血清或血浆。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为尿液中游离 DNA 的浓度通常很低。

当我们试图找到一种简单的无创膀胱癌早期检测方法时，我们第一次有了这种方法的想法。要开始该程序，请获取 50 毫升 Clean Catch 第一次早晨尿液样本，该样本已在 4 摄氏度下储存不超过 3 小时。将样品倒置两次，然后将样品分成两个 50 ml 锥形离心管。

样品在 4 摄氏度下以 850 倍 G 离心 10 分钟。然后，对于每根试管，将 10 毫升上清液的上部转移到两个 5 毫升的试管中，在沉淀上方留下至少 2 毫升的上清液。丢弃沉淀并将上清液储存在零下 80 摄氏度。

根据需要对其他尿液样本重复此过程。要开始 DNA 纯化，请为每个样品解冻一份尿液上清液。涡旋解冻的样品并将试管倒置两次。

将 1 毫升样品放入 5 毫升试管中，并将剩余样品储存在零下 80 摄氏度。根据制造商的说明准备适用于尿液样品的 DNA 纯化试剂盒。向样品中加入 100 μL 蛋白酶 K 和 1 mL 裂解缓冲液，并用移液管充分混合。

将样品在 56 摄氏度下孵育 15 分钟。在孵育过程中，在离心柱中制备洗涤缓冲液。孵育后，让样品冷却至室温，然后加入 1 毫升无水乙醇，并通过移液充分混合。

将 650 μL 样品转移到色谱柱中。以 6000 倍 G 离心 1 分钟。更换收集管并重复此过程，直到所有样品都已上样到色谱柱上。

然后加入 500 μL 第一种洗涤缓冲液，并以 6000 倍 G 离心柱 1 分钟。更换收集管，加入 500 μL 第二种洗涤缓冲液，并以最大速度离心色谱柱 3 分钟。将色谱柱放入干净的收集管中，以最大速度再离心 3 分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。

将色谱柱转移到干净的 1.5 ml 微量离心管中。将 50 μL 洗脱缓冲液上样到色谱柱上，让缓冲液浸泡到色谱柱中 7 分钟。然后将色谱柱以 6000 倍 G 离心 1 分钟。

将洗脱液移回色谱柱中，并以最大速度离心色谱柱 1 分钟，以获得尿液游离 DNA。要开始制备标准品，首先使用纯化试剂盒从适当的细胞系中分离 DNA。根据试剂盒制造商的说明，用分光光度计定量细胞系中每个纯化尿液样品的 DNA。

将 UCF DNA 稀释至 1 ng/μL，并将稀释的样品储存在零下 20 摄氏度，直到准备好进行完整性测试。稀释细胞系 DNA 以创建 6 个 100 μL 不同浓度的标准品。将标准品储存在零下 20 摄氏度。

要开始 DNA 完整性测试，请在冰上解冻 UCF DNA 样品、标准品、适当的 PCR 引物和绿色超混合液。然后用联排管设置 72 孔转子盘板。将 2 份 10 微升等分试样的标准品放入孔中，然后将每个样品放入孔中。

准备两口 10 微升不含 RNase 的水作为阴性对照。对于每个填充的孔，准备 1 微升每种引物、12.5 微升绿色超混合液和 6.5 微升不含 RNase 的水的混合物。将 15 μL 混合物转移到每个填充的孔中，然后将孔转移到 72 孔转子盘中。

根据制造商的规格使用实时仪器进行 PCR。使用仪器软件，检查是否有任何重复的循环阈值差异为 1 或多个。从分析中丢弃这些样本，并评估剩余样本的中位循环阈值。

对中位循环阈值为 36 或更低的每个样品进行熔解分析，以评估 PCR 产物特异性。然后使用标准曲线确定每个应用的浓度（以纳克/微升为单位）。分离尿液游离 DNA，并在实体瘤中显示 DNA 拷贝数增加的四个区域评估 DNA 完整性。

还评估了对照序列，以验证每个样品中的 DNA 数量是否足以进行完整性测试。计算每个基因的总游离 DNA 浓度和变异系数。该方法检测膀胱癌的敏感性为 73%，特异性为 84%，但对前列腺癌的敏感性为 58%，特异性为 44%。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一个工作日内完成。按照此程序，可以执行其他方法，如数字 PCR 或下一代测序，以回答其他问题，例如目标基因的拷贝数诱导剂。观看此视频后，您应该对如何以非常简单的方式从尿液中分离游离 DNA 以及如何使用实时 PCR 方法研究特定感兴趣区域的完整性有很好的了解。