一种快速，为隔离，功能可扩展的研究方法，以及细胞衍生的细胞外基质的分析
January 4th, 2017
细胞外基质在定义细胞微环境以及调节细胞行为和表型方面起主要作用。我们描述了一种分离细胞来源的细胞外基质的快速方法，该方法可以适应不同的规模进行显微镜、生化、蛋白质组学或功能研究。
该程序的总体目标是从培养细胞中分离细胞外基质，用于各种下游实验，以帮助了解细胞外基质在正常组织和疾病过程中的功能和特性。该方法可以帮助回答细胞外基质领域中的关键问题，例如细胞外基质的组织、分子组成、蛋白质相互作用或功能特性。此外，细胞外基质可以从任何贴壁细胞类型制备。
该技术的主要优点是它们可以以不同的规模进行，以有效地去除细胞并保留细胞外基质蛋白。演示该程序的是我实验室的研究生 Silvia Rosini 和博士后研究员 Andrew Hellewell。首先，将细胞铺在盖玻片上，用于活细胞和细胞外基质或 ECM 的成像。
对于荧光显微镜研究，固定的 ECM。或用于制备细胞来源的 ECM，用于小规模功能研究。在适当的温度和湿度下孵育细胞，使细胞沉积 ECM。
通常大于 16 小时。在萃取通风橱中，使用去离子水稀释储备液 1 至 14，在合适的容器中制备 20 毫摩尔氢氧化铵。从培养箱中取出细胞，然后轻轻取出培养基。
然后轻轻倒入培养皿壁上，加入不含钙或镁的 PBS。摇动盘子两次，倒出液体。然后再重复洗涤两次。
在萃取通风橱中，取出最后一次 PBS 洗涤液，每 60 毫米培养皿添加 1.5 毫升氢氧化铵，并在室温下孵育板 5 分钟。每分钟轻轻搅拌培养皿，以确保所有细胞裂解。接下来，在每个盘子中加入大量的去离子水并摇动盘子。
然后倒出氢氧化铵溶解物质，该物质由氢氧化铵、裂解细胞和去离子水组成。用大量去离子水再清洗不溶性 ECM 层四次，以确保完全去除所有氢氧化铵溶解材料。必须用去离子水进行大量洗涤以完全去除细胞。
如果这些步骤未充分执行，细胞材料可能会残留在培养皿上并污染下游分析。为了通过免疫荧光检查 ECM，去除剩余的去离子水，加入 2% 多聚甲醛（简称 PFA）固定 ECM，并在室温下孵育培养皿 10 分钟。使用 PBS 洗涤每个固定样品两次，并在根据文本方案进行荧光显微镜检查之前将溶液丢弃在液体废物容器中。
在层流罩中，通过将每种溶液通过无菌 0.2 微米过滤器放入适当的无菌容器中，制备不含钙和镁的 PBS、20 毫摩尔氢氧化铵和去离子水的无菌溶液。在保持无菌技术的同时，使用无菌 PBS 轻轻洗涤盖玻片上的基质生产细胞 3 次。去除最终的 PBS 洗涤液后，向 60 毫米培养皿中加入 1.5 毫升无菌氢氧化铵，并在室温下间歇摇动孵育 5 分钟。
摇动向培养皿中加入大量无菌去离子水，将细胞裂解物倒入适当的废液容器中。再重复洗涤四次，以确保完全去除溶解物质。根据文本方案对细胞进行胰蛋白酶消化和沉淀后，将测试细胞重悬于新鲜的无菌培养基中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
然后将适当数量的测试细胞和培养基接种到盖玻片上的无菌分离 ECM 上，并孵育 2 至 3 小时或所需时间。为了检查肌动蛋白细胞骨架的组织，将测试细胞固定在 2% PFA 中，并用 FITC-鬼笔环肽染色以可视化 F-肌动蛋白，并用 DAPI 染色以可视化细胞核。如视频前面所示，培养大量细胞后，取出细胞并清洗 ECM，将每个板倾斜一个角度，将残留的水排到培养皿底部，并使用 P200 移液器小心地去除任何残留的水，直到板完全干燥。
同时将含有 100 毫摩尔 DDT 的 SDS-PAGE 样品缓冲液加热至 95 摄氏度 2 分钟，并向每个 100 毫米板中加入 200 微升，以便通过免疫印迹进行检查。使用细胞刮刀将样品收集到培养皿的一侧，然后使用 200 微升移液器吸头将其转移到试管中。要通过质谱分析ECM，请从培养皿中收集SDS-PAGE样品缓冲液，将其重新加热至95摄氏度，并在两到三个附加板中使用相同的等分试样，以制备浓度更高的样品。
将细胞刮刀尖端残留的 SDS-PAGE 样品缓冲液提取物转移到试管中，以最大限度地减少 ECM 材料的损失。为了将分离的 ECM 有效提取到 SDS-PAGE 样品缓冲液中，必须将样品缓冲液加热至 95 度，包含还原剂，并广泛刮擦板。此处显示的是在玻璃盖玻片上生长的 COS-7 细胞。
氢氧化铵处理有效地去除了细胞核和肌动蛋白细胞骨架的缺失所确定的细胞。在该图中，用 RFP 标签血小板反应蛋白-1 转染 COS-7 细胞。并在氢氧化铵处理前后对 ECM 进行了可视化。
推断在两张图像中鉴定的荧光点与 ECM 相关。在该实验中，用氢氧化铵去除人真皮成纤维细胞，并用抗胶原 1 抗体探测 ECM，其表现出特征性的腓骨和网状染色模式。如图所示，对氢氧化铵提取的大鼠软骨肉瘤细胞的 ECM 进行纤连蛋白染色。
在这个例子中，将测试 COS-7 细胞接种到 RCS 细胞产生的无菌 ECM 上两个小时，并通过 FITC-鬼笔环肽染色分析 F-肌动蛋白组织。与产生自己的 ECM 的 COS-7 细胞相比。本实验从大鼠软骨肉瘤细胞中分离 ECM，然后通过 SDS-PAGE 分离 ECM 衍生蛋白。
并分离 4 个主要条带，并通过质谱分析。鉴定出纤连蛋白、血小板反应蛋白 1 和 5 以及基质蛋白 1。最后，通过免疫印迹分析人真皮成纤维细胞的内源性 ECM。
检测到纤连蛋白和血小板反应蛋白-1，而细胞内蛋白 α-微管蛋白和 β-肌动蛋白不存在。一旦掌握，如果作得当，可以在一小时内从三个 100 毫米培养皿中去除氢氧化铵细胞并用热 SDS-PAGE 样品缓冲液提取 ECM。在尝试此程序时，请务必记住每次都要制备新鲜的氢氧化铵工作溶液以去除细胞。
使用去离子水进行大量洗涤以确保去除所有细胞也非常重要。遵循此程序，可以对提取的 ECM 进行蛋白质组学分析等方法，以回答其他问题，例如不同细胞类型产生的 ECM 蛋白的相对丰度。观看此视频后，您应该对如何从细胞培养皿中高效去除细胞以及如何提取 ECM 有很好的了解。
不要忘记，与多聚甲醛一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在抽油烟机中工作和佩戴个人防护设备。
概述
本文介绍了一种从培养细胞中分离细胞源性细胞外基质（ECM）的快速方法，该方法可以适应各种实验规模。该技术对于研究ECM在细胞行为及其在正常和疾病状态中的作用至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 细胞外基质研究
- 生化分析
背景
- 细胞外基质对细胞微环境和行为至关重要。
- 了解ECM的特性可以揭示组织功能和病理学的洞见。
- 该方法允许研究任何粘附细胞类型的ECM。
- 在保留ECM蛋白的同时高效去除细胞是一个关键优势。
研究目的
- 分离ECM以用于各种下游实验。
- 调查ECM的组织和分子组成。
- 探索ECM的蛋白质相互作用和功能特性。
使用的方法
- 将细胞接种在盖玻片上以沉积ECM。
- 使用氨水溶解细胞并分离ECM。
- 洗涤步骤确保完全去除细胞材料。
- 使用免疫荧光和SDS-PAGE对ECM进行分析。
主要结果
- 通过显微镜观察证明ECM的成功分离。
- 荧光染色揭示ECM的组织和组成。
- 该方法允许分析各种细胞类型的ECM特性。
- 结果有助于理解ECM在健康和疾病中的作用。
结论
- 所描述的方法对于从培养细胞中分离ECM是有效的。
- 它为进一步研究ECM功能提供了基础。
- 该技术可以增强细胞生物学和组织工程研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, scalable isolation of cell-derived extracellular matrix (ECM) enables high-confidence functional studies and biochemical analyses critical for early discovery and target validation. This method addresses a key bottleneck in ECM research by providing reproducible, contamination-minimized ECM preparations suitable for diverse downstream workflows. Its adaptability across adherent cell types supports portfolio-wide translational research and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of ECM composition and organization for pathway clarification.
- Supports functional target validation by isolating ECM free from cellular contaminants.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct analysis of ECM-protein interactions.
- Provides a platform for comparative studies across cell types and disease models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated ECM substrates for standardized phenotypic and functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative output in immunofluorescence and biochemical assays.
- Supports scalable workflows from small-scale functional studies to large-scale proteomics.
- Enables reliable evaluation of compound effects on ECM dynamics and composition.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ECM analysis with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from in vitro ECM studies to preclinical model validation.
- Reduces biological ambiguity in ECM-driven disease mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of ECM-targeted therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This ECM isolation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling robust hypothesis testing and downstream analytics.
- Discovery Biology: Provides high-purity ECM for hypothesis-driven studies of protein composition and organization.
- Screening: Delivers standardized ECM substrates for reproducible assay development and compound screening.
- Analytics: Supports quantitative immunofluorescence, SDS-PAGE, immunoblotting, and mass spectrometry outputs.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro ECM findings with disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable protocol for diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ECM-related studies.
- Operational Value: Standardizes ECM preparation, ensuring reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust, contamination-minimized ECM analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ECM-targeted programs and translational initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and cell culture handling.
- Needs access to fluorescence microscopy, SDS-PAGE, and mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous washing and extraction steps to prevent cellular contamination.
- Adaptable to any adherent cell type, supporting cross-model standardization.
- Careful handling of hazardous reagents (e.g., paraformaldehyde) is essential for safety.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Removal of Cells with Ammonium Hydroxide Solution
3:21
Sterile Preparation of Cell-derived Extracellular Matrix for Cell Functional Assays
5:01
Isolation of Extracellular Matrix for SDS-PAGE, Immunoblot Analysis, or Proteomics
6:30
Results: Isolation and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix
8:26
Conclusion
