Name: 用GFP标记TMEM184A构建肝素受体身份确认 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解利用GFP标记TMEM184A构建体确认肝素受体身份的方法。该技术通过电穿孔转染和荧光共定位分析，为孤儿基因功能鉴定提供可靠工具，适用于血管细胞生物学研究。

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Lowe-Krentz 实验室的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）向 LLK 提供的研究基金 HL54269 资助。

1. GFP-蛋白表达载体的设计
<ol>
	<li>购买或设计并构建一个基于目标蛋白的GFP标签表达载体。 
	注意：对于购买的构建体，可从商业实验室获得标准载体，这些载体包含部分或全部以下建议：对于膜蛋白，选择将GFP定位在C末端，因为这样更不容易干扰膜蛋白的转运。如果认为目标蛋白的C末端紧密折叠形成蛋白结构域，则应在目的基因与GFP之间考虑加入一段间隔序列。选择适用于真核细胞广泛表达的构建体，但同时允许在细菌系统中进行构建体的扩增。包含一个切割位点（例如TEV蛋白酶识别位点），以便在某些实验中若GFP可能干扰蛋白活性时可将其切除。可添加其他插入片段，例如用于定位或亲和相互作用的额外标签例如， His6）。对于本文所述的实验，此步骤并非必需，但可能有助于其他实验，或在需要去除GFP时，直接位于基因与GFP之间的区域具有应用价值。</li>
</ol>
2. 血管细胞中GFP-TMEM184A的表达
<ol>
	<li>如先前报道的方法，在0.2%明胶包被的组织培养皿中培养内皮细胞或血管平滑肌细胞1,6,7。</li>
	<li>向已冲洗过的100 mm或更大尺寸的融合细胞培养皿中加入5 mL&#160;细胞培养用胰蛋白酶溶液（0.5% w/v）。在37 °C孵育至细胞刚好从培养皿表面脱落，然后将细胞转移至无菌聚丙烯离心管中。</li>
	<li>向细胞/胰蛋白酶溶液中加入胰蛋白酶抑制剂（例如，等体积的常规培养基），该步骤与常规细胞培养中所用方法一致，以限制胰蛋白酶活性。在约600 × g条件下离心5分钟（或根据标准组织培养条件选择适当的转速和时间，刚好使细胞沉淀即可）。吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于1 mL&#160;HeBS（HEPES缓冲盐溶液）电穿孔缓冲液中，尽量减少细胞处于沉淀或悬浮状态的时间。将细胞悬液置于冰上，并在冰上完成后续所有操作。 
	注意：在重悬前可用HeBS洗涤沉淀一次。</li>
	<li>向细胞中加入足量的GFP标记的TMEM184A质粒，使DNA终浓度达到20 µg/mL&#160;。对于GFP载体，采用相同的实验流程。</li>
	<li>将约0.4 mL HeBS中的细胞悬液加入电穿孔比色杯中。使用前预先将比色杯冷却。</li>
	<li>采用以下条件进行电穿孔：指数衰减模式，500 µF，∞ 欧姆，170 V。 
	注意：应针对特定细胞类型优化电压。前期对内皮细胞和平滑肌细胞的研究使用GFP-纽蛋白（vinculin）载体确定了此处列出的最佳电压值，例如10。
	<ol>
		<li>为优化电穿孔效果，可首先参考仪器制造商提供的推荐参数（其中包括某些标准细胞类型的设置）。使用目标载体或大小及荧光特性与目标载体相似的对照荧光蛋白载体进行实验。 
		注意：较小的核酸分子比大分子载体更容易进入细胞，因此仅含荧光蛋白的载体可能比更大的载体更易表达。</li>
		<li>使用荧光显微镜评估细胞活力、转染后24小时和48小时表达荧光载体的细胞百分比以及表达强度。 
		注意：若细胞存活率较低，可略微降低电压和/或电击时间。为提高细胞存活率，应尽可能缩短细胞从培养表面解离到重新接种回培养环境之间的时间间隔。若细胞存活率较高但表达水平较低，可略微延长电击时间或增加一次电击脉冲以提高载体摄取效率。最佳条件和表达水平因细胞类型而异。若表达载体的细胞比例较高但荧光强度较低，可通过提高DNA浓度并随时间监测转染细胞的荧光强度（该强度取决于蛋白半衰期及表达水平）来改善信号强度。如有需要，某些实验中可通过使用抗GFP抗体对GFP进行免疫荧光染色来增强染色强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔后，将细胞接种至六个含盖玻片的30 mm组织培养孔中用于成像，或接种至组织培养皿中。按照标准细胞培养程序进行培养。</li>
	<li>可选步骤：24小时后更换培养基，以去除残留的HeBS电穿孔缓冲液。</li>
</ol>
3. GFP-TMEM184A 定位的可视化
<ol>
	<li>培养至少24小时后，用PBS轻轻振荡洗涤细胞。避免暴露于强光下，以防止GFP荧光淬灭。</li>
	<li>在室温下，用PBS中含4%多聚甲醛（PFA）的溶液轻轻振荡固定细胞15分钟。避免使用含甲醇的试剂，因其可能导致细胞通透化。若无需评估配体相互作用，则可使用甲醇固定。 
	注意：多聚甲醛具有毒性。请佩戴适当的个人防护装备，在通风橱中谨慎操作，并妥善处理废弃物。</li>
	<li>同上法用PBS洗涤。如需进行基于抗体的染色，请参见下文3.6步骤。</li>
	<li>使用Mowiol或其他合适的封片介质将盖玻片封固于载玻片上。</li>
	<li>使用共聚焦或荧光显微镜，配合适用于GFP激发和发射光谱的滤光片组对载玻片进行成像。优先选用共聚焦显微镜，因其具备在z轴方向分离样本的能力。为定量分析目的，将图像以灰度模式保存为TIF格式（同时可另存全彩图像用于图示展示）。</li>
	<li>为与细胞表达的野生型TMEM184A进行比较，可使用针对TMEM184A序列中肽段(s)制备的一抗对其他细胞进行免疫荧光染色，例如1。GFP-TMEM184A的鉴定也可通过抗GFP抗体实现。应采用相同的显微成像技术对两组细胞样本进行评估。</li>
</ol>
4. 罗丹明-肝素结合及其与转染GFP-TMEM184A细胞的共定位
<ol>
	<li>用100 µg/mL处理表达GFP-TMEM184A的细胞&#160;将罗丹明-肝素加入培养基中，使细胞孵育特定时间，对于A7r5细胞通常少于10分钟。按3.1和3.2步骤进行洗涤和固定。 
	注意：配体的最佳作用时间和浓度取决于细胞反应、配体的荧光强度以及所获得的图像强度。本实验采用该浓度的肝素，因为在其他检测中该浓度可引起超过50%的细胞反应。11该浓度可通过标准的荧光显微镜技术进行观察，因此无需提高浓度。用未标记的肝素稀释罗丹明标记的肝素会导致细胞内荧光信号降低，从而更难以成像和定量。</li>
	<li>为定量测定因转染GFP-TMEM184A导致的罗丹明-肝素结合，需制备未转染GFP-TMEM184A的相同细胞。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜，采用适当的GFP（488 nm激发）和罗丹明（543 nm激发）激发波长及相应的发射波长（GFP为500–530 nm，罗丹明为大于560 nm）对细胞进行成像，以确定共定位情况。从至少三次独立实验中获取至少50个细胞的图像，以进行统计分析。实验内应保持成像参数设置一致，并使用对照样品例如， 未处理的转染细胞，可用于标准化多个实验的数据分析。</li>
	<li>使用计算机程序分析图像，以确定每个细胞中相对的罗丹明结合/摄取量，从而定量分析结合情况。 
	注意：应使用TIF图像，因为它们便于分析，并且如果最初未以灰度格式保存，可在多种计算机程序中转换为灰度。本分析中使用了Image J（免费软件），该软件可测量图像中任意用户自定义区域的面积和像素强度。
	<ol>
		<li>使用手绘工具在荧光图像中圈选一个细胞，并利用测量工具确定该区域内的荧光强度。 
		注意：这些测量提供了计算用户自定义区域（整个细胞、细胞核）总强度所需的信息。 等等。）提供了一种比较具有不同几何形态细胞的方法。可报告背景区域的平均强度，从而便于收集背景强度用于分析。</li>
		<li>导出至电子表格，计算面积乘以强度的值，并减去相同面积的背景值。对每次实验中足够数量的细胞进行荧光强度/细胞的平均值计算，以获得统计学意义。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. GFP-TMEM184A 向罗丹明标记的肝素的能量荧光共振转移
<ol>
	<li>准备转染的细胞，并按照3.1步骤加入200 µg/mL&#160;罗丹明标记的配体进行孵育。注意，荧光配体的孵育时间取决于细胞类型。仅使用PFA固定，然后封片用于成像。</li>
	<li>首先，在405 nm激发，采集罗丹明发射信号（566 - 685 nm；FRET）；其次，在488 nm激发，采集GFP信号（成像范围493 - 530 nm）；第三，在561 nm激发，采集罗丹明信号（成像范围566 - 685 nm）。不含GFP-TMEM184A或不含罗丹明标记肝素的对照组至关重要。</li>
</ol>
6. 罗丹明-肝素摄取的活细胞成像
<ol>
	<li>将转染了GFP-TMEM184A的细胞接种至专用于活细胞成像的单个培养皿中，并按照方案3进行处理。 
	注意：所需细胞数量取决于细胞类型和期望的密度。为尽量减少细胞在悬浮状态下的时间，无需进行细胞计数。将一个100 mm培养皿中汇合的细胞接种至六个35 mm的活细胞成像培养皿中，以在48 h后获得接近汇合的细胞。</li>
	<li>48 h后，更换为不含酚红的培养基。</li>
	<li>将一皿细胞转移至配备加热载台的共聚焦显微镜上，以维持温度恒定，并调节显微镜焦距。</li>
	<li>用移液器将100 µg/mL&#160;罗丹明标记的肝素加入培养皿中，并轻轻混匀。</li>
	<li>立即开始连续拍摄活细胞图像。若视野区域内未观察到细胞对肝素的摄取，可轻微移动培养皿，以寻找含有至少一个携带罗丹明标记的绿色囊泡的细胞。 
	注意：成像时的激发光与发射光参数与肝素摄取实验方案（第5节）相同。图像采集间隔时间约为16 s。实验条件及显微镜性能通常决定了图像获取的速度。</li>
</ol>
7. 从培养细胞中分离GFP-TMEM184A和GFP
<ol>
	<li>移除培养基并用 PBS 洗涤后，向表达 GFP-TMEM184A 或 GFP（用于对照结合实验）的 150 mm 培养皿中加入 2 mL&#160;含蛋白酶抑制剂的 0.2% (w/v) CHAPS 1x PBS 溶液。用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞/CHAPS 溶液转移至冰上预冷的 15 mL&#160;聚丙烯管中，并通过轻弹管壁充分混匀。所有操作均需在明亮光线下进行，以确保 GFP 标签在后续结合实验中被充分漂白。</li>
	<li>为特异性结合 GFP-TMEM184A（或相应的 GFP 对照），向溶液中加入 2 µg/mL&#160;生物素标记的抗 GFP 抗体，并在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育过夜。</li>
	<li>向至少 5 mL 0.2% CHAPS/PBS 中加入 500 µL&#160;链霉亲和素-琼脂糖珠，以约 600 × g 离心 3 至 5 分钟，弃去上清液。用新鲜的 CHAPS/PBS 重复洗涤两次。将珠子加入抗体与细胞混合液中，在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育过夜，使珠子与结合了 GFP 或 GFP-TMEM184A 的生物素化抗 GFP 抗体结合。</li>
	<li>通过离心（同步骤 7.3）沉淀珠子，并弃去未结合物质。加入至少 5 mL&#160;含蛋白酶抑制剂的 0.2% CHAPS/PBS 进行洗涤。重复洗涤和离心至少三次，以有效去除所有未结合的蛋白质。</li>
	<li>最后一次洗涤液弃尽后，将珠子与 1 mL&#160;PBS 中含 0.2 M 甘氨酸和 0.2% CHAPS（用 HCl 调节 pH 至 2.0）的溶液在冰上孵育 3 分钟，以解离抗体与 GFP 的结合（从而释放游离的 GFP-TMEM184A 或游离的 GFP）。每 30 秒轻弹管壁混匀一次。</li>
	<li>以约 600 × g 离心，将含有纯化蛋白的上清液转移至新的 15 mL&#160;离心管中，并立即加入 5 mL&#160;1 M 碳酸氢钠进行中和（使 pH 升至 7）。</li>
	<li>使用截留分子量为 10,000 道尔顿的离心浓缩管对样品进行浓缩（采用供应商推荐的离心速度）。当体积浓缩至约 0.5 mL 时，加入 0.2% CHAPS/PBS。继续浓缩并反复添加 0.2% CHAPS/PBS，直至累计加入的 0.2% CHAPS/PBS 体积达到起始样品体积的十倍以上。</li>
	<li>为估算所分离的 GFP 或 GFP 标签蛋白的含量，测定 280 nm 处的吸光度，并与用相同缓冲液配制的牛血清白蛋白或其他对照蛋白的标准曲线进行比较。 
	注意：由于消光系数不同，该浓度仅为估算值，但可提供近似的蛋白浓度，有助于在不浪费样品的情况下进行后续分析。可通过微凯氏定氮法（micro-Lowry 蛋白测定法）确定准确的蛋白浓度，注意标准蛋白必须用与样品相同的缓冲液配制。可通过 Western 印迹法（使用抗 GFP 抗体检测）将分离蛋白的条带与预测的分子量进行比较，以进一步分析分离蛋白。或者，使用 TMEM184A 抗体应出现与预期构建体大小相符的条带；但如果样品中存在二聚体（或更高阶的寡聚体），也可能同时出现野生型 TMEM184A 的条带。通过将分离样品的总蛋白染色结果与起始材料等分试样的总蛋白染色结果进行比较，可大致评估纯度。</li>
</ol>
8. 体外 肝素结合实验
<ol>
	<li>用200 µL洗涤液清洗黑色链霉亲和素包被的96孔板&#160;0.2% CHAPS/PBS 溶液振荡洗涤三次，每次5分钟。使用相同的洗涤程序准备一个相同的黑色未包被96孔板。根据实验设计，规划好实验样本的加样布局（每样本设三个复孔）。包括标准肝素浓度孔、缓冲液对照孔，以及不含肝素的GFP样本孔，以确认GFP的漂白情况。 
	注意：如果目标蛋白的优化分离或配体相互作用缓冲液有所不同，则所有板的制备和洗涤步骤均应使用相应的优化缓冲系统进行。</li>
	<li>加入 100 µL&#160;向链霉亲和素包被板中需要结合GFP的所有孔加入每孔60 pmol的生物素化抗GFP抗体。该抗体用量足以刚好饱和各孔中的高亲和力链霉亲和素。
	<ol>
		<li>仅向用于对照目的的孔中加入缓冲液（无需 GFP 或 GFP-TMEM184A 结合）。用板盖密封各孔，防止蒸发。室温下振荡孵育 2 小时。 
		注意：加入孔板的体积和孵育时间均基于试剂供应商的建议。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 200 µL 0.2% CHAPS/PBS 将所有孔洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>加入 100 µL&#160;每孔加入5 nmol的GFP-TMEM184A或GFP至链霉亲和素包被板的相应孔中，于室温振荡孵育1小时。按步骤8.3再次洗涤。 
	注意：选择该蛋白浓度是为了确保所有位点均被过量的GFP或GFP-TMEM184A饱和。这一点至关重要，以保证每个孔中结合的蛋白量相同。较低浓度的蛋白也可能实现位点饱和，可通过将不同浓度的蛋白与酶标板孵育后，检测未结合蛋白的残留量，并比较未结合蛋白与配体结合实验的结果，来验证这一可能性。</li>
	<li>制备不同浓度的荧光素标记肝素， 例如，10、25、50、75、100、200 µg/mL，溶于0.2% CHAPS/PBS中。此后所有操作均需避光进行。 
	注意：在配制浓度之前，应针对特定的蛋白靶标确定其他配体的具体浓度。最低浓度应能在酶标仪中被检测到。因此，首先需确定所用缓冲体系中可被准确检测的浓度范围，再进一步确定获得可测量结合信号所需的浓度范围。荧光素标记肝素的浓度应低于10 µg/mL&#160;在所采用的缓冲条件下，该物质在酶标仪中未能持续稳定地被检测到。类似地，尽管在其他检测中使用的罗丹明-肝素可在酶标仪中被观察到，但在适用于结合反应的缓冲条件及所需浓度下，使用该荧光标记物时，标准品的荧光读数差异无法稳定重现。</li>
	<li>加入 100 µL&#160;将荧光素-肝素加入链霉亲和素包被板中的相应检测孔，以及链霉亲和素包被板和未包被板中的浓度标准孔。室温振荡孵育10分钟。将酶标板避光保存（或用铝箔覆盖）。</li>
	<li>使用酶标仪，记录两块板中对照孔内肝素的初始荧光发射信号，以及链霉亲和素包被板中固定化GFP-TMEM184A或GFP孔的初始荧光（总）发射信号。如有必要，调整仪器增益，以确保在最低和最高浓度之间能够检测到荧光标记的肝素。 
	注意：确保酶标仪从上方读取孔板，并且如果可调节，应在孔内最佳位置进行读数。在本研究中，最佳读数位置位于孔深约75%处。酶标仪配套资料应提供针对该设备在黑色孔板中检测结合样品时的特定读数建议。</li>
	<li>从固定有GFP-TMEM184A或GFP的孔中去除未结合的荧光标记肝素，并将内容物转移至未包被的黑色板中的相应孔中。立即检测荧光发射信号。</li>
	<li>加入 100 µL&#160;将新鲜的0.2% CHAPS/PBS重新加入已去除荧光素-肝素的孔中，并检测荧光发射。</li>
	<li>重复步骤 8.8 - 8.9，共 3 次。 
	注意：这些来自包被板的读数表示仍留在GFP或GFP-TMEM184A孔中的荧光素标记肝素。若在第三次未结合样本中检测到显著荧光信号，应增加一次洗涤步骤。若每次洗涤后仍有荧光持续被去除，则提示配体结合可能为低亲和力，应重新评估结合条件。最终读数即为结合态肝素的读数。</li>
	<li>记录未结合样本在未包被板中的荧光发射值，获得每次洗涤后的数值。这些是 &#34;未结合的&#34; 读数。</li>
	<li>使用8.7中获得的总肝素释放量值，确认每孔中添加的肝素水平是否正确。从各数值中减去平均背景读数。 
	注意：未添加任何荧光素-肝素的孔位作为空白对照，用于扣除抗体、GFP 和缓冲液产生的背景信号。对空白对照的重复孔取平均值，得到背景值。从结合与未结合组的读数中减去平均背景值，以获得实际值。</li>
	<li>利用荧光素-肝素总添加量与发射光强度的关系图，确定发射光强度与肝素量之间的标度关系。 
	注意：单独抗体或抗体与抗原结合均会导致一定程度的荧光淬灭。因此，总肝素含量的测定依据为8.7中注明的所添加肝素总量。</li>
	<li>绘制GFP-TMEM184A组和GFP组三个重复样本的校正后结合肝素量相对于添加肝素量的曲线图。</li>
	<li>通过累加特定浓度下所有洗涤步骤中未结合读数来确定游离配体。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所报告的实验方案旨在为确认TMEM184A作为血管细胞中肝素受体的身份提供确证性证据1。基因敲低技术通常被用作确认新蛋白鉴定的一种手段。然而，敲低后出现的某些功能丧失通常不足以证明候选蛋白确实是正确的受体（或其他功能性蛋白）。同样重要的是，必须有证据表明该候选蛋白确实表现出预期的功能。使用带有GFP标签的新型基因构建体，可进行功能获得实验，并可通过GFP亲和性实现对标签蛋白的分离。本方案中采用的电穿孔技术实现了极高的转染效率（超过80%的细胞表达了该构建体）。然而，如果无法使用或不希望使用电穿孔，也可采用其他转染方法。选择GFP标签构建体来验证新蛋白功能具有多个优势。首先，GFP可作为转染和基因表达的报告分子，若缺乏该蛋白表达的细胞系，还可通过GFP监测过表达情况。其次，GFP标签提供了一种不依赖配体亲和性或针对肽段的抗体即可纯化蛋白的工具。第三，GFP标签可用于分析复杂的免疫荧光定位，通过使用针对目标蛋白序列中独特肽段的抗体进行染色，判断实际的基因产物是否具有相似的亚细胞定位。
利用基因构建体进行功能获得性实验已被用于多种目的，...

通过亲和力为基础的分离方案结合部分序列测定，常用于鉴定具有新功能的候选蛋白质。近期新鉴定出的蛋白质实例包括跨膜蛋白184A（TMEM184A），该蛋白是通过肝素亲和相互作用鉴定出的一种肝素受体。1，以及TgPH1，一种可结合磷脂酰肌醇PI(3,5)P₂的pleckstrin同源结构域蛋白22其他新蛋白质的鉴定涉及对肽段进行直接序列分析，例如由Vit所采用的方法。 等 利用跨膜肽段鉴定先前未表征基因的蛋白质产物3同样，可通过生物信息学方法搜索已知的蛋白质家族来鉴定新的蛋白质序列，例如鉴定新的4TM蛋白。4水通道蛋白家族基因序列的分析也促成了具有新功能的新成员的发现5鉴定后，通常下一步是分析蛋白质功能，有时可通过特定的蛋白质功能检测方法进行分析，例如水通道蛋白的情况。
在可能的情况下，可利用特定的酶学或其他类似方法来检测新发现蛋白质的功能 体外 功能检测。由于许多新蛋白质的功能依赖于仅在完整细胞或生物体内发生的复杂相互作用， 体外 检测方法并不总是有效的。然而，该 体内 检测方法的设计必须依赖于基因序列。在细胞培养和/或简单模式生物中，基因敲低可为蛋白质/功能的鉴定提供支持性证据6。在如上所述鉴定出新蛋白后，通常仅通过敲低蛋白来验证其功能是不够的，还需设计 体内 依赖基因序列的功能分析对于新蛋白质的表征具有重要意义。
最近通过亲和层析和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）1，7 鉴定出 TMEM184A 是一种肝素受体（可调节血管平滑肌细胞的增殖及内皮细胞的炎症反应），这一发现为在基因敲低实验结果与鉴定结论一致的基础上开发一系列功能验证实验提供了契机。近期一篇综述确认，肝素可特异性地与多种生长因子、其受体、细胞外基质成分、细胞黏附受体及其他蛋白质相互作用8。在血管系统中，肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（其含有结构与肝素相似的硫酸乙酰肝素链）可与数百种蛋白质相互作用9。为了在功能上验证 TMEM184A 参与肝素的摄取与结合，研究人员开发了基于 TMEM184A 基因构建体的技术。本报告介绍了一系列基于 GFP-TMEM184A 构建体的实验方法，可用于确认 TMEM184A 作为肝素受体的身份。

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A 载体</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记的肝素</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>荧光素标记的肝素</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA，无甲醇）</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech，可通过 Fisher Scientific 购买</td><td>Fisher 编号 PI28908</td><td>需在通风橱中使用</td></tr><tr><td>Reacti-bind 链霉亲和素包被板（链霉亲和素包被的黑色 96 孔板）</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech，通过 Fisher Scientific 提供</td><td>Fisher 编号 PI15510</td><td>注意保质期</td></tr><tr><td>黑色 96 孔板</td><td>Corning Life Sciences 塑料制品，通过 Fisher Scientific 购买</td><td>Fisher 编号 064432</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 血管平滑肌细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>可转换至 MEM 培养基中培养&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>BAOEC 牛主动脉内皮细胞</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>初始培养按推荐方法进行，后续可转换至 MEM 培养基继续培养&lt;sup&gt;1,7&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>BAOSMC 牛主动脉平滑肌细胞</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>初始培养按推荐方法进行，后续可转换至 MEM 培养基继续培养&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>RAOEC 大鼠主动脉内皮细胞</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td><td>初始培养按推荐方法进行，后续可转换至 MEM 培养基继续培养&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>生物素标记的抗 GFP 抗体</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech，通过 Fisher Scientific 提供</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被的磁珠</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>可从 Bio-Rad 购得</td><td></td><td>可在实验室自行配制，pH 值为 6.8</td></tr><tr><td>靶向 TMEM184A N 末端的抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>目前唯一已知的靶向 TMEM184A N 末端区域的抗体。</td></tr><tr><td>靶向 TMEM184A C 末端的抗体</td><td>购自 ProSci Inc, Poway, CA&amp;nbsp;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>在 &lt;strong&gt;图 1&lt;/strong&gt; 中使用</td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>在 &lt;strong&gt;图 5&lt;/strong&gt; 中使用</td></tr><tr><td>TRITC 或 Cy3 标记的二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152（驴抗兔，TRITC）&lt;br/&gt; 715 165 150（驴抗小鼠，Cy3）</td><td>具有最小交叉反应性，以减少非特异性染色。</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>购自 Sigma</td><td>C5849</td><td>请注意，该特定货号已停产。&amp;nbsp; 供应商将提供替代产品信息。</td></tr><tr><td>活细胞成像用 35 mm 培养皿</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &amp;ndash; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>配备 63X 油镜的 LSM 510 Meta</td><td>用于 &lt;strong&gt;图 1、图 2 和图 3&lt;/strong&gt; 的图像采集和活细胞成像</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>配备 60X 油镜的 C2+ 共聚焦系统</td><td>用于 &lt;strong&gt;图 5&lt;/strong&gt; 的图像采集</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>配备 63X 油镜的 Zeiss LSM 880</td><td>用于 &lt;strong&gt;图 2C&lt;/strong&gt; 的图像采集</td></tr><tr><td>电穿孔设备</td><td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell 系统</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔杯</td><td>可从 MidSci 购得</td><td>EC2L</td><td>也可从设备供应商处获得</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&amp;reg; m200 Pro 酶标仪</td><td>读数时检测孔中心区域而非表面。</td></tr><tr><td>用于测量染色强度的计算机程序</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/&lt;br/&gt; 程序和相关信息可在线获取</td><td>可使用任何合适的软件。更多细节请参见 https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞培养用胰蛋白酶溶液</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>以 10 倍浓缩液形式购买</td></tr></tbody></table>

使用gfp标记的tmem184a构建体验证肝素受体身份

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

通过基于亲和力的分离方法和生物信息学分析鉴定出新蛋白质后，这些蛋白质通常尚未得到充分表征。针对预测序列内特定肽段的抗体可用于部分定位实验，但往往无法排除抗体与其他分子发生非特异性相互作用的可能性。这一现状促使我们开发一系列依赖于蛋白质序列的检测方法。具体而言，我们获得并使用了一种在目标蛋白的C末端融合了绿色荧光蛋白（GFP）编码序列的表达载体来实现这些目的。最初设计并实施了用于表征蛋白质定位、配体亲和性及功能获得的实验，以确证TMEM184A为肝素受体1。此外，该表达载体还可用于研究膜拓扑结构问题以及蛋白质与配体之间相互作用的细节。本报告介绍了一系列基于在血管细胞中表达的GFP-TMEM184A融合蛋白的实验方案，这些方法可轻松适用于其他新发现的蛋白质。

理论上，任何DNA质粒转染细胞均可通过脂质体转染试剂实现，但已有文献报道表明，采用电穿孔法将GFP质粒转染入内皮细胞的效率更高12。本方案通常可在所用的原代内皮细胞和血管平滑肌细胞中实现超过80%的GFP质粒表达。所使用的质粒构建基于一种 commercially available system，可实现该质粒的快速构建与递送。该质粒的主要设计目的聚焦于定位问题，因此确保其正确靶向细胞膜，同时实现高效的真核蛋白表达及持续的质粒表达是首要考虑因素。其他设计考量还包括：针对不同亚细胞定位的蛋白或C末端位于折叠区域的蛋白，GFP的插入位置可能需要调整；是否需要移除GFP（例如引入蛋白酶切割位点）；以及是否添加第二个亲和标签。后者可为GFP融合蛋白的纯化提供替代方法，并有助于在结合实验中将其稳定固定于载体表面。为验证不同商业抗体针对TMEM184A的染色模式，将表达GFP-TMEM184A的血管细胞与使用商业抗体染色的相同细胞进行比较。转染后的时间长短会影响GFP-TMEM184A的分布，其表达呈现随时间累积的趋势，至少持续72小时...

采用一种编码C端带有GFP标签的TMEM184A的表达载体，用于真核表达，该载体被应用于相关实验，以验证TMEM184A在血管细胞中作为肝素受体的身份。

使用GFP标记的TMEM184A构建体验证肝素受体身份

当通过亲和纯化结合生物信息学分析鉴定出新蛋白质时，这些蛋白质通常尚未得到充分表征。抗体……

使用GFP标记构建体的总体目标是利用GFP作为抓手来确认先前未知蛋白质的身份。当缺乏特定酶活性用于验证时，该方法有助于对孤儿基因进行功能鉴定。该技术的主要优势在于，GFP标记使得同一构建体可用于多种类型的实验。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为转染并不总能实现强表达载体的有效表达，且细胞也不一定能成功复苏。我们最初产生该方法的想法，是在开始认识到仅依靠针对某种蛋白所制备的抗体来鉴定该蛋白时所面临的困难。首先，将目标细胞重悬于 1 毫升 HEPES 缓冲盐溶液电穿孔缓冲液中，并立即将细胞置于冰上。加入足量的GFP-TMEM184A标记的质粒至细胞中，使DNA的终浓度达到每毫升20微克，并将约0.4毫升的细胞转移至预冷的电穿孔比色皿中。对细胞进行电穿孔处理。随后将转染后的细胞接种至组织培养皿中，并将培养皿置于细胞培养箱中孵育24至72小时。转染步骤是该实验流程中最关键的一步，因为如果细胞无法存活或不能有效表达GFP标记的构建体，则后续大多数实验工作将无法顺利完成。在适当的实验时间点，向表达GFP质粒的细胞培养基中加入100 µg/mL的罗丹明肝素，避光孵育细胞，通过荧光显微镜观察直至达到理想的染色程度。随后，用PBS避光轻柔振荡洗涤数秒，再以4%多聚甲醛在室温下轻柔振荡固定15分钟。为了评估GFP标记的罗丹明肝素共定位，使用共聚焦显微镜，采用适当的GFP和罗丹明激发光及衰减激光，对每次独立标记实验中的至少50个细胞进行成像。在合适的图像分析程序中检查图像，以确定每个细胞中罗丹明的分布和摄取情况，使用手绘工具在每张荧光图像中圈出细胞。利用测量工具确定每个圈选区域内的荧光强度，然后将荧光强度数据导出至电子表格，计算每个细胞的面积乘以强度值，并减去相同面积的背景值。随后可对所有细胞的每细胞荧光强度取平均值，以获得具有统计学意义的数据。为促进GFP标记的TMEM184A向罗丹明标记的肝素发生荧光共振能量转移，首先将固定后的转染GFP-TMEM184A并用罗丹明标记肝素的细胞置于玻璃显微镜载玻片上。使用405纳米波长激发细胞以成像罗丹明的发射荧光，随后使用488纳米波长激发以成像GFP的发射荧光。然后在561纳米波长下激发细胞，进行第二次罗丹明发射成像。为了进行罗丹明肝素摄取的活细胞成像，将100毫升处于融合状态的GFP-TMEM184A转染细胞培养物接种至635毫米的活细胞成像培养皿中，以获得接近融合的细胞。48小时后，用不含酚红的培养基替换上清液，并将一皿细胞转移至配备有37摄氏度加热载台的共聚焦显微镜上。调节显微镜焦距，轻柔混匀后向细胞中加入浓度为100微克/毫升的罗丹明标记肝素。随后立即开始记录活细胞图像。若视野中未出现肝素摄取现象，可轻微移动培养皿，以寻找含有至少一个绿色囊泡（内含罗丹明标记）的细胞。为体外评估肝素结合能力，使用200微升含0.2% CHAPS的PBS缓冲液，对一个黑色阿提万（Ativan）包被的96孔板和一个黑色未包被的96孔板进行冲洗，每孔震荡洗涤5分钟，共洗三次。最后一次洗涤后，向阿提万包被板中每个GFP检测组的孔内加入100微升生物素标记的抗GFP抗体（每孔60皮摩尔），每个样本设三个复孔。接着，在对照孔中仅加入缓冲液，并用板盖密封所有孔，于室温下震荡孵育2小时。孵育结束后，用CHAPS PBS将所有孔清洗三次，方法如前所述，然后向阿普唑仑包被板的相应孔中加入100微升每孔5纳摩尔的GFP-TMEM184A或单独的GFP。在室温下振荡孵育1小时后，用新鲜的CHAPS PBS洗涤所有孔，并向阿普唑仑包被板中相应的检测孔中每孔加入100微升不同实验浓度的荧光素标记肝素，每个浓度设三个复孔。将浓度标准品分别加入阿普唑仑包被板和未包被板中，并将两块板在室温下振荡孵育10分钟，避光。现在，使用酶标仪记录两块板中对照孔的初始肝素荧光发射信号，以及包被阿普唑仑的板中固定化GFP或GFP-TMEM184A孔的初始总荧光发射信号。然后将含有固定化GFP-TMEM184A或GFP孔中未结合的荧光肝素转移至未包被的黑色板中的对应孔中。立即在未包被的黑色板上读取荧光发射信号后，向已移除荧光素标记肝素的孔中重新加入100微升新鲜CHAPS PBS缓冲液，并读取这些孔的荧光发射信号，以获得在未包被板中被移除的未结合样品的荧光发射值。当获得所有未结合的读数后，通过从总值中减去平均背景读数，利用总肝素发射值确认每个孔中加入的肝素浓度是否正确。然后绘制发射值与加入的总荧光素标记肝素量之间的关系图，以确定发射信号与肝素量之间的比例关系，并将经校正后的结合肝素量与加入的肝素量进行作图，分别展示GFP组和GFP-TMEM184A组三个重复孔的结果。转染后的时间长短会影响GFP-TMEM184A的分布，其在至少72小时内逐渐积累，随着时间推移，在核周区域的GFP信号更加明显。在此代表性的血管细胞培养中，GFP 的染色模式与针对C端肽段产生的抗体的染色模式最为相似，这一结果合乎逻辑，因为GFP位于蛋白的C末端。使用荧光素-罗丹明-肝素配体也可用于随时间实时评估配体与受体的共定位情况。在转染了GFP-TMEM184A构建体的稳定敲低细胞中，肝素的摄取增加，导致这些细胞能够恢复内吞罗丹明标记肝素的能力，达到甚至超过野生型细胞的水平。利用所示的质粒编码GFP tact系统，抗GFP抗体分离的GFP-TMEM184A构建体表现出特异性的三重肝素结合，而对照GFP则不结合任何肝素。使用抗GFP抗体进行简单的免疫荧光染色，还可根据抗体在未通透细胞中的可及性，提供有关GFP定位的信息，初步证明在质膜上表达的GFP位于细胞外。一旦掌握该技术，在培养24至48小时后即可获得优异的GFP-构建体表达效果。在进行活体成像实验时，需要注意某些细胞可能不会表现出共定位的摄取现象，因此通常需要观察其他细胞。使用GFP配体进行结合实验时，GFP蛋白可能形成二聚体或更高阶的聚集体，特别是在含有去垢剂胶束的情况下，这会使实验变得复杂。总体而言，表达GFP标记的蛋白可促进多种实验的开展，从而确认先前未知蛋白的身份。

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

用GFP标记TMEM184A构建肝素受体身份确认

来源： Tang, N., et al. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体. J. Vis. Exp.

克隆分离及PCR筛选保留靶基因的GFP切除型重组疱疹病毒

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

本文展示了使用荧光Alexa染料标记的α-银环蛇毒素来检测海马神经元中GABA...

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一种通过抗体饲喂法研究分离原代海马神经元培养中谷氨酸受体转运的方法

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关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida...

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

了解利用GFP标记TMEM184A构建体确认肝素受体身份的方法。该技术通过电穿孔转染和荧光共定位分析，为孤儿基因功能鉴定提供可靠工具，适用于血管细胞生物学研究。

使用GFP标记的TMEM184A构建体验证肝素受体身份

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