使用GFP标记的TMEM184A构建体验证肝素受体身份

使用GFP标记构建体的总体目标是利用GFP作为抓手来确认先前未知蛋白质的身份。当缺乏特定酶活性用于验证时，该方法有助于对孤儿基因进行功能鉴定。该技术的主要优势在于，GFP标记使得同一构建体可用于多种类型的实验。

通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为转染并不总能实现强表达载体的有效表达，且细胞也不一定能成功复苏。我们最初产生该方法的想法，是在开始认识到仅依靠针对某种蛋白所制备的抗体来鉴定该蛋白时所面临的困难。首先，将目标细胞重悬于 1 毫升 HEPES 缓冲盐溶液电穿孔缓冲液中，并立即将细胞置于冰上。

加入足量的GFP-TMEM184A标记的质粒至细胞中，使DNA的终浓度达到每毫升20微克，并将约0.4毫升的细胞转移至预冷的电穿孔比色皿中。对细胞进行电穿孔处理。随后将转染后的细胞接种至组织培养皿中，并将培养皿置于细胞培养箱中孵育24至72小时。

转染步骤是该实验流程中最关键的一步，因为如果细胞无法存活或不能有效表达GFP标记的构建体，则后续大多数实验工作将无法顺利完成。在适当的实验时间点，向表达GFP质粒的细胞培养基中加入100 µg/mL的罗丹明肝素，避光孵育细胞，通过荧光显微镜观察直至达到理想的染色程度。随后，用PBS避光轻柔振荡洗涤数秒，再以4%多聚甲醛在室温下轻柔振荡固定15分钟。

为了评估GFP标记的罗丹明肝素共定位，使用共聚焦显微镜，采用适当的GFP和罗丹明激发光及衰减激光，对每次独立标记实验中的至少50个细胞进行成像。在合适的图像分析程序中检查图像，以确定每个细胞中罗丹明的分布和摄取情况，使用手绘工具在每张荧光图像中圈出细胞。利用测量工具确定每个圈选区域内的荧光强度，然后将荧光强度数据导出至电子表格，计算每个细胞的面积乘以强度值，并减去相同面积的背景值。

随后可对所有细胞的每细胞荧光强度取平均值，以获得具有统计学意义的数据。为促进GFP标记的TMEM184A向罗丹明标记的肝素发生荧光共振能量转移，首先将固定后的转染GFP-TMEM184A并用罗丹明标记肝素的细胞置于玻璃显微镜载玻片上。使用405纳米波长激发细胞以成像罗丹明的发射荧光，随后使用488纳米波长激发以成像GFP的发射荧光。

然后在561纳米波长下激发细胞，进行第二次罗丹明发射成像。为了进行罗丹明肝素摄取的活细胞成像，将100毫升处于融合状态的GFP-TMEM184A转染细胞培养物接种至635毫米的活细胞成像培养皿中，以获得接近融合的细胞。48小时后，用不含酚红的培养基替换上清液，并将一皿细胞转移至配备有37摄氏度加热载台的共聚焦显微镜上。

调节显微镜焦距，轻柔混匀后向细胞中加入浓度为100微克/毫升的罗丹明标记肝素。随后立即开始记录活细胞图像。若视野中未出现肝素摄取现象，可轻微移动培养皿，以寻找含有至少一个绿色囊泡（内含罗丹明标记）的细胞。

为体外评估肝素结合能力，使用200微升含0.2% CHAPS的PBS缓冲液，对一个黑色阿提万（Ativan）包被的96孔板和一个黑色未包被的96孔板进行冲洗，每孔震荡洗涤5分钟，共洗三次。最后一次洗涤后，向阿提万包被板中每个GFP检测组的孔内加入100微升生物素标记的抗GFP抗体（每孔60皮摩尔），每个样本设三个复孔。接着，在对照孔中仅加入缓冲液，并用板盖密封所有孔，于室温下震荡孵育2小时。

孵育结束后，用CHAPS PBS将所有孔清洗三次，方法如前所述，然后向阿普唑仑包被板的相应孔中加入100微升每孔5纳摩尔的GFP-TMEM184A或单独的GFP。在室温下振荡孵育1小时后，用新鲜的CHAPS PBS洗涤所有孔，并向阿普唑仑包被板中相应的检测孔中每孔加入100微升不同实验浓度的荧光素标记肝素，每个浓度设三个复孔。将浓度标准品分别加入阿普唑仑包被板和未包被板中，并将两块板在室温下振荡孵育10分钟，避光。

现在，使用酶标仪记录两块板中对照孔的初始肝素荧光发射信号，以及包被阿普唑仑的板中固定化GFP或GFP-TMEM184A孔的初始总荧光发射信号。然后将含有固定化GFP-TMEM184A或GFP孔中未结合的荧光肝素转移至未包被的黑色板中的对应孔中。立即在未包被的黑色板上读取荧光发射信号后，向已移除荧光素标记肝素的孔中重新加入100微升新鲜CHAPS PBS缓冲液，并读取这些孔的荧光发射信号，以获得在未包被板中被移除的未结合样品的荧光发射值。

当获得所有未结合的读数后，通过从总值中减去平均背景读数，利用总肝素发射值确认每个孔中加入的肝素浓度是否正确。然后绘制发射值与加入的总荧光素标记肝素量之间的关系图，以确定发射信号与肝素量之间的比例关系，并将经校正后的结合肝素量与加入的肝素量进行作图，分别展示GFP组和GFP-TMEM184A组三个重复孔的结果。转染后的时间长短会影响GFP-TMEM184A的分布，其在至少72小时内逐渐积累，随着时间推移，在核周区域的GFP信号更加明显。

在此代表性的血管细胞培养中，GFP 的染色模式与针对C端肽段产生的抗体的染色模式最为相似，这一结果合乎逻辑，因为GFP位于蛋白的C末端。使用荧光素-罗丹明-肝素配体也可用于随时间实时评估配体与受体的共定位情况。在转染了GFP-TMEM184A构建体的稳定敲低细胞中，肝素的摄取增加，导致这些细胞能够恢复内吞罗丹明标记肝素的能力，达到甚至超过野生型细胞的水平。

利用所示的质粒编码GFP tact系统，抗GFP抗体分离的GFP-TMEM184A构建体表现出特异性的三重肝素结合，而对照GFP则不结合任何肝素。使用抗GFP抗体进行简单的免疫荧光染色，还可根据抗体在未通透细胞中的可及性，提供有关GFP定位的信息，初步证明在质膜上表达的GFP位于细胞外。一旦掌握该技术，在培养24至48小时后即可获得优异的GFP-构建体表达效果。

在进行活体成像实验时，需要注意某些细胞可能不会表现出共定位的摄取现象，因此通常需要观察其他细胞。使用GFP配体进行结合实验时，GFP蛋白可能形成二聚体或更高阶的聚集体，特别是在含有去垢剂胶束的情况下，这会使实验变得复杂。总体而言，表达GFP标记的蛋白可促进多种实验的开展，从而确认先前未知蛋白的身份。