在出生后的小鼠听泡解剖:中耳骨骼和组织学分析的分离
January 4th, 2017
我们提出了一种方案，从出生后小鼠中分离出听觉大疱、荚膜和听小骨，以进行整个安装和组织学分析。
解剖程序的总体目标是分离听性大疱和胶囊，然后从出生后小鼠中分离单个听小骨，以进行各种整座和组织学分析。该方法可用于解决伤口生物学领域的关键问题，例如形态发生不良、软骨内骨化或矿物质代谢不良的机制。这种方法基于对解剖细节的深入了解。
一般来说，刚将小鼠作为生物系统的个体可能会很困难，因为他们对人类中耳的了解可能不适用于小鼠。演示该程序的是我实验室的技术人员 Ayako Sakamoto。首先将听觉大疱和囊膜以及周围的颅骨放入室温下含有磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 的标本培养皿中。
在双目解剖显微镜下，识别听囊周围的颅骨，如图所示。用一副镊子夹住周围的颅骨，用第二套镊子拉出基蝶骨和枕骨。然后用镊子轻轻地将顶骨和顶骨从胶囊中拉出，并在完全松开时取出。
接下来，将鳞状细胞从大疱和胶囊中拉出，轻轻梳理掉骨骼和软组织。接下来，握住外耳并翻转标本以露出内侧。接下来，将标本旋转 180 度，抓住胶囊并拉出剩余的软组织。
现在可以看到背嵴。在这个角度下，内耳道、弓下窝和前半规管中的面神经和前庭耳蜗神经清晰可见。当背嵴向解剖盘底部倾斜时，可以清楚地看到听觉大疱。
如果制剂略微倾斜，则在大疱内可以看到锤状骨。首先使用镊子将锤骨上方和鼓膜沟外侧的外耳道骨折。在第一个 facture 之前创建第二个 facture。
然后取出外耳道，使鼓膜可见。接下来，去除腹壁和后壁踝短突附近的部分鼓膜和鼓骨。现在应该暴露出锤骨、砧骨、镫骨和鼓膜张肌。
提起锤骨，用 27 号针的斜面边缘切开鼓膜张肌。请注意，踝柄牢固地附着在鼓膜上，就像在其他哺乳动物中看到的那样。通过破坏关节腺踝的前突，使踝骨从听骨关节的砧骨脱位。
使用镊子将锤骨与听觉大疱分离。去除听大疱的主要部分，露出砧骨和镫骨。然后使用 27 号针的斜面边缘切断短嵴处的砧后韧带。
使用镊子隔离砧骨。用 27 号针的斜面边缘切断镫骨附近的镫骨动脉。旋转样品，使圆形窗口位于底部。
然后将缝纫针插入镫骨的闭孔并提起镫骨。去除镫骨后，椭圆形的窗户开口应该清晰可见。使用 27 号针将镫从缝纫针上推开。
要开始组织包埋，首先用剪刀剪掉大疱前端的茎状突。通过切割部分可以看到锤骨和背嵴。将大疱和胶囊浸入 PBS 中的 1-2% 多聚甲醛中。
如果空气滞留在大疱中，请使用针头和注射器将其清除。将大疱和胶囊留在 4 摄氏度的固定剂中，在试管旋转器上过夜。第二天，在 PBS 中快速清洗大疱和胶囊。
然后立即浸入 4 摄氏度的液体冷冻包埋化合物中。在中耳和外耳水平的冷冻包埋化合物中形成气泡是很常见的。通过针头抽吸去除中耳的气泡。
对外耳中的气泡使用相同的技术。去除所有气泡后，根据要获得的切片类型确定组织的方向。然后可以在切片前将组织包埋在冷冻块中。
该图像显示了脱钙锤骨纵向石蜡切片的 H 和 E 染色，由字母 M 表示，以及 P14 小鼠的听大疱和荚膜。鼓膜由字母 TM 表示。该图显示了冷冻未脱钙锤骨纵切的钙骨标记，由字母 M 表示，以及 P21 小鼠的听大疱。钙绿信号显示锤状、大疱和关节囊中新的骨形成。
一旦掌握了这项技术，如果手术执行得当，可以在 10 分钟内分离出听觉大疱和胶囊。看完这个视频，你应该对小鼠听小骨和大疱的解剖方向有很好的了解，这在正文中有描述。
概览
本协议概述了从出生后小鼠中解剖听觉气囊、囊和小骨以进行整体和组织学分析的方法。它提供了一种详细的方法来探索伤口生物学中的关键问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 伤口生物学
背景
- 小鼠的听觉系统与人类有显著差异。
- 了解解剖结构对于成功解剖至关重要。
- 该方法有助于研究形态发生和骨化。
- 对于新接触小鼠模型的研究人员来说，这是必不可少的。
研究目的
- 分离听觉结构以进行分析。
- 调查不良形态发生的机制。
- 增强对软骨内骨化的理解。
使用的方法
- 在显微镜下进行解剖。
- 使用镊子操作头骨骨头和软组织。
- 使用甲醛将组织嵌入以进行保存。
- 通过切片和染色进行组织学分析。
主要结果
- 成功分离听觉气囊和小骨。
- 清晰地可视化解剖结构。
- 在组织学切片中展示新骨形成。
- 该程序可以在约十分钟内完成。
结论
- 该协议对于听觉结构解剖有效。
- 它提供了对小鼠听觉组件解剖学方向的洞察。
- 通过练习可以掌握该技术。
常见问题
Executive Industry Relevance
This dissection protocol enables precise isolation of murine auditory ossicles for histological and whole-mount analysis, supporting target validation in otic pathway research. By providing reproducible access to the malleus, incus, and stapes, the method facilitates mechanistic de-risking of genes involved in skeletal development and mineral metabolism. The approach enhances predictive confidence in preclinical models where altered bone metabolism impacts hearing function, informing portfolio decisions in auditory and craniofacial therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to endochondral ossification and morphogenesis of auditory ossicles.
- Operational Value: Provides a standardized procedure to isolate individual ossicles for downstream phenotypic analysis.
- Translational Value: Supports functional target validation by linking gene-deficient models to observable changes in ossicle structure.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates fixed and embedded tissues suitable for sectioning and staining, enabling quantitative histological readouts.
- Reproducibility: Consistent dissection under binocular microscopy allows for reliable sample preparation across experiments.
- Scalability: The ten-minute procedure duration supports medium-throughput isolation of ossicles from postnatal mice.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying pathological, developmental, and evolutionary aspects of the middle ear in mice.
- Translational Continuity: Enables analysis from discovery through preclinical validation by preserving tissue integrity for sectioning and imaging.
- Risk-Adjusted Advancement: Histological outputs such as calcium labeling help assess new bone formation, informing go/no-go decisions in ossification pathway targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, particularly for skeletal and otic pathway modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of ossicle morphology in genetic models.
- Screening: Produces assay-ready tissues with standardized orientation for longitudinal, horizontal, or frontal sectioning.
- Analytics: Facilitates quantitative measurements via histological staining (e.g., H&E, calcium labeling) to compare bone structure and mineralization across conditions.
- Translational Research: Connects early findings to preclinical continuity through preserved tissue architecture suitable for longitudinal analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for auditory ossicle isolation across multiple projects in otolaryngology and wound biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in bone development pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility in tissue preparation for histological and molecular analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing structural phenotypes linked to gene function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on ossicle morphology and mineralization outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine anatomy and dissection under binocular microscopy.
- Dependence on precision instrumentation including fine forceps, 27-gauge needles, and cryo-embedding compounds.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, embedding, and sectioning protocols for consistent results.
- Adaptation considerations include orientation of tissue for specific section planes (longitudinal, horizontal, frontal) based on analytical needs.
- Practical limitations include the small size of murine ossicles, requiring meticulous handling to avoid loss or damage during isolation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Isolation of Auditory Bulla and Capsule
2:25
Isolation of Auditory Ossciles: Malleaus, Incus and Stapes
4:25
Preparation for Embedding in Frozen Blocks (Kawamoto's Film Method)
6:16
Results: Histology of Paraffin and Frozen Sections
6:57
Conclusion
