Name: 一个单一的鼠标骨骼肌的相邻区Cryosectioning的基因表达和组织学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习小鼠骨骼肌冷冻切片技术，实现组织学与分子数据的关联分析。该方法可从相邻切片获取高质量RNA，用于研究肌肉再生和基因递送效果。

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Madison Grant、Steven Foltz、Halie Zastre 和 Junna Luan 提供了技术协助。本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所，资助编号为 AR065077。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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</ol>

作者声明其不存在任何竞争性经济利益。

为使本方法获得最佳结果，在组织冷冻保存过程中应将包埋树脂限制在肌肉的下三分之一或下半部分，因为过量的树脂会减慢 pooled cryosections 的收集速度，并可能增加RNA提取过程中包埋树脂的污染。此外，在针头匀浆过程中需格外小心，以最大化产量并尽量减少针头堵塞的可能性。可通过使用带锁扣的Luer-Lok注射器对本方案进行改进，以防针头堵塞后因需高压通液而导致样品损失。也可额外增加一步使用25或26号针头的匀浆操作，以获得更细的组织悬液，进一步提高RNA得率。虽然可用氯仿替代BCP，但不推荐这样做，因为BCP毒性较低，且在RNA有机提取过程中可减少水相中基因组DNA的污染12。同样不建议将pooled cryosections的切片厚度增加至超过30 μm，否则匀浆效率会降低。
如果RNA得率低于预期水平，可采用多种策略来提高回收率，例如：i) 增加起始材料的毫克量以提高可能的得率；ii) 将切片厚度减少至30 μm以下，以改善组织的机械均质化；iii) 延长样品在有机提取试剂中的孵育时间和针头均质化时间，以增强组织的机械和化学裂解；iv) 如果仍有组...

该技术的目标是从单个小体积骨骼肌组织样本中获取可用于多种不同实验分析（如组织学和基因表达分析）的材料。显微镜相关应用对样本保存方法最为敏感，因此必须严格控制保存过程，以限制在冷冻保存期间冰晶伪影的形成。因此，本方法开发采用胫骨前肌（TA）作为起始材料，将其部分浸入包埋树脂后，置于经液氮冷却至-140 °C的2-甲基丁烷浴中快速冷冻，所得样本可同时用于免疫荧光显微镜检测和基因表达分析。
在基于肌肉内注射的实验中，使用相同来源材料以适应多种技术方法尤为重要，因为左右两侧肌肉分别代表不同的实验条件，一侧为实验组，另一侧为对照组。例如，在肌肉再生研究中，通常向一侧肌肉注射毒素以引起广泛的组织损伤，而对侧肌肉则注射载体作为对照1。类似地，针对肌肉疾病的基因治疗研究通常首先通过肌肉内注射来验证基因治疗载体的效果，并与对侧肌肉注射的空载体、无关载体或载体对照进行比较2。因此，不可能将每块胫前肌（TA肌肉）用于不同的实验用途。
解决此问题的常用策略包括：i) 每次实验使用不同的肌群，ii) 使用额外的小鼠，或 iii) 每次实验从肌肉上切下一小块。然而，不同肌群之间存在显著差异，使得来自不同实验的数据难以比较；而增加动物数量会提高成本，若存在其他替代方案，则这种做法难以被合理化。在许多情况下，将肌肉解剖后分割成小块以用于不同实验是最佳选择。然而，这些肌肉组织块通常过小，无法在液氮中进行研磨或使用机械研磨技术实现有效匀浆2-5。由于肌肉是一种结构高度致密的组织，富含细胞外基质和收缩蛋白，机械匀浆不充分将导致后续DNA、RNA或蛋白质的得率较低。本文详述的方法可使来自同一块肌肉组织的少量样本用于多种实验应用，结合冷冻切片和针头吹打技术，可改善机械匀浆效果，从而提高RNA得率。

<table><tbody><tr><td>软木塞</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>使用锋利刀片切成小方块。</td></tr><tr><td>塑料盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>用于在冷冻过程中定位肌肉组织。</td></tr><tr><td>低温温度计</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>注意：危险化学品。应储存在易燃物品柜中。</td></tr><tr><td>包埋介质：&quot;cryomatrix&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>其他包埋介质可替代 cryomatrix 使用。</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 配一次性刀片架</td><td>任何正常工作的冷冻切片机均可满足本实验方案要求。</td></tr><tr><td>一次性冷冻切片机刀片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>应根据所用冷冻切片机选择合适的刀片或刀具。</td></tr><tr><td>RNase 去污染溶液：&quot;RNase Zap&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>用于操作冷冻切片。可在普通美术用品商店购得。</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>RNA 有机提取试剂：TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>注意：TRIzol 为危险化学品。注意：仅推荐使用有机提取试剂从骨骼肌中提取 RNA。</td></tr><tr><td>18 号针头</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>22 号针头</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>26 号针头</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>可选。可用于 RNA 提取方案中的第三次样本匀浆步骤。</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>对于极高价值样本，建议使用鲁尔锁式注射器（&lt;i&gt;例如&lt;/i&gt;，VWR BD309628）。</td></tr><tr><td>1-溴-3-氯戊烷（BCP）</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>用于配制 DEPC 水中的 70% 乙醇：200 证明酒精</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>将 35 ml 200 证明酒精与 15 ml DEPC 水混合。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于配制 DEPC 水中的 70% 乙醇：DEPC 处理水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>将 35 ml 200 证明酒精与 15 ml DEPC 水混合。</td></tr><tr><td>RNA 纯化试剂盒：PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>RNA 制备的最后步骤。</td></tr><tr><td>DNase/RNase-free 水&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td>也可使用 DEPC 处理水。</td></tr><tr><td>分光光度计：Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>在进行下游应用前，用此酶处理纯化的 RNA 以去除任何 DNA 污染。</td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>用于免疫荧光实验方案的 PBS。</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>根据制造商说明复溶正常驴血清原液，然后将一份等分试样稀释至 5% 用于免疫荧光。&amp;nbsp; 也可使用正常山羊血清。</td></tr><tr><td>eMHC 抗体</td><td>University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白 VI 抗体</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>水性封片剂：Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>仅使用专为荧光应用设计并具有抗淬灭特性的封片剂。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>用于免疫荧光实验方案结束时的封片</td></tr><tr><td>图像分析软件：ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express 或更高级产品</td><td>免费软件 ImageJ 也可用于手动计数。具有分割功能的更高级软件可能实现部分自动化；&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，ImageProPremier。</td></tr><tr><td>合并与映射切片图像：Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>心脏毒素</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 已停产。其他心脏毒素选项包括 EMD Millipore #217503；American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618；或 Ge Script # RP17303；但这些尚未经过验证。</td></tr><tr><td>逆转录试剂盒：Superscript III First-strand synthesis system</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>可使用任何经过验证的高质量逆转录试剂。</td></tr><tr><td>标准 PCR：GoTaq Flexi 聚合酶系统</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>可使用任何经过验证的高质量 Taq 聚合酶系统。如果 PCR 后续应用涉及 DNA 测序，则应改用高保真 PCR 系统。</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>在未使用专用 qPCR 预混液时用于 qPCR。需与 SuperROX（适用于 Applied Biosystems 仪器）以及 GoTaq Flexi 聚合酶和缓冲液配合使用。</td></tr><tr><td>ROX：SuperROX，15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX 在 PCR 反应中更稳定，因此作为 qPCR 被动参比染料优于 ROX（羧基-X-罗丹明）。适用于 Applied Biosystems 仪器的 qPCR。</td></tr><tr><td>实时 PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

通过该方法，可连续收集冷冻切片，从而在同一小鼠骨骼肌的相邻区域同时进行组织学显微观察以及RNA富集用于基因表达分析。通常，小体积骨骼肌样本难以实现充分的匀浆，因为缓冲液体积可能过小而无法有效进行研磨；然而，若机械破碎不充分，肌肉致密的组织结构会限制缓冲液试剂的渗透，最终导致RNA得率较低。按照本方案操作，可收集并汇集30 μm的切片，利用冷冻切片及后续的针头匀浆对肌肉组织进行机械破碎，增大组织暴露表面积，促进缓冲液渗透。该技术的主要局限在于需要使用冷冻切片机，且通量相对较低。然而，通过汇集少量肌肉冷冻切片，仍可获得高质量的RNA，因此该方法适用于多种不同骨骼肌及其他组织。此外，该技术可在单块骨骼肌的相邻区域实现匹配分析（例如，组织病理学与基因表达分析），使得不同应用间的检测结果可直接比较，从而降低实验不确定性，并减少为获取少量组织用于多项检测而必需的重复动物实验。

肌肉冷冻切片RNA质量高，且产量足以满足大多数应用需求
使用来自8只对照小鼠的胫骨前肌（TA）肌肉组织（19.4至41 mg）制备的16个骨骼肌RNA样品的分析结果如表1所示。在再生实验中，分别制备了左侧（L）和右侧（R）TA肌肉，通过沿肌肉纵向注射25 μl生理盐水或10 μM 心肌毒素以诱导肌肉损伤，注射后3天收集肌肉组织，实验方法参照先前报道1。如表1所示，在这些代表性样品中，冷冻切片肌肉RNA的A260/280比值通常接近2或更高。“纯”RNA的A260/280比值为2.0，一般认为比值在1.8至2.2之间即为合格，因此这些冷冻切片RNA样品的纯度极佳9。每个样品的总RNA回收量通常超过10 μg，每毫克起始组织可获得0.18至超过1 μg的总RNA，足以满足大多数下游应用的需求。值得注意的是，注射毒素后3天的TA肌肉所提取的RNA浓度、总...

收集连续的冷冻切片，以实现组织学应用，并利用单个小鼠骨骼肌的相邻区域富集RNA，用于基因表达检测。从20 - 30 mg pooled冷冻切片中可获得高质量RNA，并可在不同应用之间直接比较检测结果。

通过该方法，连续收集冷冻切片，以便同时进行组织学显微观察以及RNA富集用于基因分析。

本实验的总体目标是实现对单个组织相邻切片进行组织学和分子参数分析。通过该方法，我们能够回答骨骼肌生物学及疾病领域中的一些关键问题，例如，肌肉损伤后的再生效应如何，以及通过肌肉内注射进行病毒介导的基因递送会产生哪些效应？该方法的优点在于，可以从单个组织中直接关联组织学和分子数据，从而实现更有效的数据分析，并更充分地利用实验组织。在完成解剖前5分钟，冷却冷冻保存浴。当组织样本准备包埋时，首先将包埋树脂涂抹在组织的下三分之一至一半处，即肌肉与软木塞接触的区域。操作应整齐，以减少树脂对后续步骤的干扰。随后，立即将软木塞放入冷却至负140摄氏度的2-甲基丁烷浴中。每批次最多包含八份组织样本。在浴液中，搅拌组织30秒，同时刮擦烧杯底部，以防止组织塞在溶液中冻结。30秒后，使用金属工具从2-甲基丁烷中取出一份组织塞。然后迅速移去支撑的盖玻片，将多余的2-甲基丁烷吸回到浴槽中，再将组织塞子投入外层的液氮浴中。待所有组织转移至液氮后，将其移入容器，并于负80摄氏度保存。在准备好冷冻切片机并安装组织样本后，使用粗调和微调控制装置将样本推进至刀片处，使其接触刀片。此时将切片厚度的累计值重置为零。接下来，将冷冻切片机设置为修片模式，切片厚度设为 30 微米。切至所需组织深度，将之前的组织部分切除并丢弃。为了高效收集用于RNA提取的冷冻切片，首先打开收集管并将其放置在刀架附近。然后，使用预先冷却的洁净毛刷拾取每个切片，并转移至收集管中。从400至4,000微米组织深度获取的30微米小鼠胫骨前肌连续切片通常可得到25至50毫克肌肉组织。若冷冻切片周围包埋有树脂，请锁紧手刹，并使用刀片将树脂小块削除，直至肌肉顶部仅残留一层薄薄的树脂。削除树脂时，刀片始终应朝远离肌肉的方向倾斜切割。包埋树脂的薄层不会显著影响后续的RNA提取。如果存在较厚的包埋树脂，应在将冷冻切片移入收集管之前，使用刷子将其从肌肉组织上轻轻去除。在切片过程中，当需要组织学切片时，使用冷冻切片机的控制装置将切片厚度重置为7微米。然后，切去并弃除四到七个切片，以获得一致且平整的组织表面，并记录此组织深度。现在，切出一个良好的切片，并将其放置在刀片载体表面进行定位。使用室温的显微镜载玻片捞取该切片，随后将载玻片放回室温环境中。收集所有目标切片，然后记录最终的组织深度。切片完成后，迅速称量合并的冷冻切片重量，用于RNA提取。立即将离心管放回冷冻切片机腔室，以保持切片温度接近负20摄氏度。首先迅速将汇集的冷冻切片转移至冰上，并按每50毫克冷冻切片加入约1毫升有机RNA提取试剂。试剂添加得越快，RNA降解程度越低。接下来，使用带18号针头的1毫升注射器，通过反复吸取溶液并将其推注到管壁上，对冷冻切片进行匀浆处理，注意避免产生过多气泡。使用针尖将结块的组织分散开。每抽吸五次后，将样本短暂放回冰上以保持低温。待组织匀浆后，换用22号针头，再轻轻吹打五次，小心地对样本进行进一步处理。然后将样品放回冰上。重复此过程三到四次，以获得高度分散的组织匀浆。最后一次匀浆完成后，在室温下孵育5分钟，以破坏分子复合物。接下来，在通风橱中，每毫升RNA提取试剂中加入0.1毫升BCP。然后剧烈振荡试管15秒。切勿使用涡旋振荡器。然后，将样品在室温下孵育两到三分钟。短暂孵育后，在4°C条件下以12,000g离心15分钟。随后，小心收集含有RNA的澄清上层液体。将其转移至一个洁净的离心管中，并加入等体积用深海海水配制的70%乙醇。短暂涡旋振荡离心管后，在室温下孵育10分钟，随后按照文字实验方案继续操作。小鼠胫骨前肌的骨骼肌RNA样品由此制备而成。三天前，部分肌肉注射了10微摩尔的心脏毒素，另一些肌肉则注射了生理盐水。这些样本的RNA纯度和得率均非常理想。在毒素损伤后，胫骨前肌的RNA得率显著更高。组织完整性和RNA产量可能影响这一观察结果。通过使用一微升在负20摄氏度下保存18个月的RNA，评估所制备RNA质量的稳定性。在RNA质量较高的样本中，清晰可见明显的18S和28S核糖体RNA条带。七微米厚的切片经染色以显示胚胎型肌球蛋白重链的表达，呈红色。为检测再生纤维，对胶原蛋白六型进行染色，呈绿色，用于勾勒肌纤维轮廓，并使用DAPY染色（蓝色）以观察细胞核。当毒素注射效果不佳时，损伤区域显得极轻微。成功的毒素注射会导致目标肌肉区域受累范围显著扩大。损伤程度可作为RNA分析的纳入标准。一旦掌握技术，单个组织的RNA提取与组织学切片制备可在半小时内完成。完成此操作步骤后，可进一步采用其他组织学或免疫荧光染色方法，以回答多种多样的科学问题。 pooled cryosections 也可用于收集 DNA 或蛋白质。

cryosectioning-contiguous-regions-single-mouse-skeletal-muscle-for

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个单一的鼠标骨骼肌的相邻区Cryosectioning的基因表达和组织学分析

对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。...

一种无需激光捕获显微切割的小鼠脑区精细分离方法，用于总RNA提取及后续的高通量测序与基因表达谱分析

本视频介绍了快速冷冻肌肉组织并获取其薄切片的操作步骤。该技术有助于研究结肠癌小鼠模型中与癌症相关的恶病质。...

肌肉组织切片的速冻方法：一种获取快速冷冻小鼠肌肉组织超薄切片的实验方案

在多种情况下，神经肌肉接头（NMJ）会发生改变，有时可能导致突触功能障碍。本报告描述了基于荧光显微镜的方法，用于量化此类结构变化。...

神经肌肉接头：利用共聚焦荧光显微镜测量突触大小、碎片化程度及突触蛋白密度的变化

本文展示了冷冻、包埋、冷冻切片及染色肌肉活检组织的最高效方法，以避免产生冷冻假象。...

用于组织学分析的肌肉冷冻切片制备中的注意事项

本文介绍一种简单的方法，用于分离空间位置不同的鼠结肠上皮表面细胞与 underlying crypt-base...

小鼠结肠黏膜显微解剖的冷冻切片法

本文介绍一种可同时对多只动物的脑组织进行冷冻切片的实验方案，作为替代单个处理脑组织的省时方法。该方法可降低免疫组织化学染色过程中的变异性和减少冷冻切片及成像所需的时间。...

同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片

已建立一种激光捕获显微切割（LCM）方案，用于从骨细胞中获取足量且高质量的RNA，以进行基因表达分析。本研究主要针对小鼠股骨切片。然而，此处报道的LCM方案也可用于研究任何硬组织细胞中的基因表达。...

一种可从新鲜冷冻小鼠骨组织中获得高质量RNA的激光捕获显微切割方案

本方案描述了利用激光显微切割技术从新鲜冷冻的小鼠胚胎切片中分离软骨和骨组织的方法。通过焦宁Y染色可快速可视化软骨和骨组织，并可精确采集，以获得高质量的RNA用于转录组分析。...

激光捕获显微切割小鼠胚胎软骨与骨骼用于基因表达分析

本文介绍了一种快速、动手操作的逐步实验方案，用于小鼠脑组织的取出以及从新鲜脑组织中分离特定脑区。在许多神经科学研究实验室中，获取脑区用于分子分析已成为常规操作。这些脑区在分离后立即冷冻，以获得高质量的转录组数据，用于系统水平的分析。...

小鼠脑组织功能区与解剖区域的显微解剖

越来越多的证据表明，过量的脂质在骨骼肌内的积聚会导致脂毒性并引发糖尿病。本文提供了一套完整的实验方案，包括组织处理、Bodipy...

骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

学习小鼠骨骼肌冷冻切片技术，实现组织学与分子数据的关联分析。该方法可从相邻切片获取高质量RNA，用于研究肌肉再生和基因递送效果。

单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

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