利用软琼脂覆盖技术筛选细菌产生的抑制性化合物

本实验的总体目标是筛选一种细菌菌株产生的、对第二种细菌菌株具有抑制作用的物质。该方法有助于回答微生物学多个领域的科学问题，尤其在微生物生态学中，对于理解细菌间的拮抗相互作用具有重要价值。该技术的主要优势在于成本低廉、操作简便且结果易于解读。

在实验室中演示该实验步骤的学生是 Aretha。开始实验时，将一株丁香假单胞菌（P. syringae）单菌落接种至 3 毫升 KB 培养基（King's Medium B 肉汤）中，于培养箱中过夜培养。次日早晨，将该肉汤培养物按 1:100 的比例稀释至 3 毫升新鲜 KB 培养基中。

将培养物在室温下振荡培养三至四小时。确保培养物的浊度明显增加，然后加入丝裂霉素C。接着，将培养物在室温下振荡过夜培养。次日，使用台式微量离心机沉淀1至2毫升经丝裂霉素C诱导的培养物。

将上清液通过0.22微米孔径滤器过滤，以去除并灭菌培养上清液。向无菌上清液中加入氯化钠至终浓度为1摩尔，并加入聚乙二醇（PEG 8000）至终浓度为10%。反复倒置样品，直至氯化钠和PEG完全溶解。

将样品置于冰浴中孵育一小时。接着，离心样品。离心后，倾倒上清液，并通过反复吹打用缓冲液重新悬浮沉淀。

通过两次等体积氯仿萃取去除残留的聚乙二醇（PEG）。将氯仿与重悬的沉淀混合，涡旋振荡15秒，然后在20,000 × g下离心5分钟。

将上层水相转移至新的微量离心管中。重复此提取步骤两次，直至水相与有机相之间无可见的白色界面。在通风橱中让提取后的上清液中残留的氯仿挥发。

挑取一株丁香假单胞菌（P. syringae）的单菌落接种于3 mL KB培养基中，于室温下振荡培养过夜。次日早晨，将菌液按1:100的比例稀释至新鲜KB培养基中，在室温下振荡培养3至4小时。随后，通过高压灭菌将琼脂悬浮于超纯水中，制备无菌水琼脂。

使用前将熔融的软琼脂置于60摄氏度水浴中保温。用无菌刻度移液管将3毫升软琼脂转移至无菌培养管中。将培养管放回水浴中，以保持其熔融状态。

在倒入覆盖层之前，需让熔化的琼脂适当冷却，但不可使其凝固。接种前必须保持琼脂处于高温且完全熔融的状态。否则，覆盖层将呈现颗粒状外观，难以观察和判读。

在无菌操作台中，取100 µL测试菌株培养物接种至软琼脂中，涡旋混匀。手动轻轻旋转培养物10至15秒，然后将其倒入琼脂平板底部。倾斜平板并朝各个方向转动，确保软琼脂均匀覆盖底层琼脂表面。

盖上培养皿，静置 20 至 30 分钟使其凝固。在凝固过程中需小心，避免扰动培养皿。待其完全凝固后，取 2 到 5 微升上清液点加至覆盖层表面。

将平板在室温下孵育过夜。次日早晨观察并记录结果。采用此方法，两种丁香假单胞菌（P. syringae）菌株受到不同细菌素的抑制。

菌株A对高分子量的细菌素Tailocin敏感，但对另一种低分子量细菌素不敏感。相反，菌株B对Tailocin不敏感，但对低分子量细菌素敏感。Tailocin在经过PEG沉淀后可被有效回收，而低分子量的细菌素则不能。

通过比较稀释系列，可以将噬菌体介导的杀灭作用与其他非复制性抗菌物质区分开来。在噬菌体介导的澄清情况下，上清液稀释后会形成单个噬菌斑或澄清区，而细菌素介导的澄清则不会形成此类噬菌斑。该方法可作为初步筛选手段，用于鉴定抑制性物质，并可与后续的遗传操作相结合，以确定或验证该活性的来源。