利用软琼脂覆盖法筛选细菌产生的抑制性化合物

本实验的总体目标是筛选出由一种细菌菌株产生、并对第二种细菌菌株具有抑制作用的物质。该方法有助于回答微生物学多个领域的科学问题，尤其在微生物生态学中研究细菌间的拮抗相互作用方面具有重要价值。该技术的主要优势在于成本低廉、操作简便且结果易于解读。

演示该实验步骤的是实验室的学生 Aretha。实验开始时，将一株丁香假单胞菌（P. syringae）单菌落接种至 3 毫升 KB 液体培养基（King's Medium B broth）中，在适宜条件下过夜培养。次日早晨，将过夜培养的菌液按 1:100 的比例稀释，接种于 3 毫升新鲜 KB 液体培养基中。

将培养物在室温下振荡培养三至四小时。确保培养物的浊度明显增加，然后加入丝裂霉素C。接着，将培养物在室温下振荡过夜培养。次日，使用台式微量离心机沉淀1至2毫升经丝裂霉素C诱导的培养物。

将上清液通过0.22微米孔径滤器过滤，以去除并灭菌培养上清液。向无菌上清液中加入氯化钠至终浓度为1摩尔，并加入聚乙二醇（即PEG 8000）至终浓度为10%。反复倒置样品，直至氯化钠和PEG完全溶解。

将样品置于冰浴中孵育一小时。接着，离心样品。离心后，倾倒上清液，并通过反复移液将沉淀重悬于缓冲液中。

用等体积的氯仿进行两次连续萃取，以去除残留的 PEG。将氯仿与重悬沉淀物混合，涡旋振荡混合物 15 秒。然后在 20,000 × g 下离心混合物 5 分钟。

将上层水相转移至新的微量离心管中。重复此提取步骤两次，直至水相与有机相之间无可见的白色界面。在通风橱中让提取后的上清液中残留的氯仿挥发。

挑取一株丁香假单胞菌（P. syringae）的单菌落接种于3 mL KB培养基中，在室温下振荡培养过夜。次日早晨，将菌液按1:100的比例稀释至新鲜KB培养基中，在室温下振荡培养3至4小时。随后，通过高压灭菌将琼脂悬浮于超纯水中，制备无菌水琼脂培养基。

使用前将熔融的软琼脂置于60摄氏度水浴中保温。用无菌刻度吸管将3毫升软琼脂转移至无菌培养管中。将培养管放回水浴中，以保持其熔融状态。

在倾注覆盖层之前，需让熔化的琼脂适当冷却，但不可使其凝固。接种前必须保持琼脂处于高温且完全熔融的状态。否则，覆盖层将呈现颗粒状外观，难以观察和判读。

在无菌操作台中，取100微升测试菌株培养物接种至软琼脂中，涡旋混匀。手动旋转培养物10至15秒，然后将其倒入琼脂平板底部。倾斜平板并朝各个方向转动，确保软琼脂均匀覆盖底层琼脂。

盖上培养皿，静置 20 至 30 分钟使其凝固。在凝固过程中注意不要扰动培养皿。待其完全凝固后，将 2 至 5 微升上清液滴加到覆盖层上。

将平板在室温下孵育过夜。次日早晨观察并记录结果。采用此方法，两种丁香假单胞菌（P. syringae）菌株受到不同细菌素的抑制。

菌株A对高分子量的细菌素Tailocin敏感，但对另一种低分子量细菌素不敏感。相反，菌株B对Tailocin不敏感，但对低分子量细菌素敏感。Tailocin在PEG沉淀后可被有效回收，而低分子量细菌素则不能。

通过比较稀释系列，可以将噬菌体介导的杀灭作用与其他非复制性抗菌物质区分开来。在噬菌体介导的澄清情况下，上清液经稀释后会形成单个噬菌斑或澄清区，而细菌素介导的澄清则不会形成此类噬菌斑。该方法可作为初步筛选手段，用于鉴定抑制性物质，并可与后续的遗传操作相结合，以确定或验证该活性的来源。