利用微尺度热泳技术绘制适配体在ATP上的结合位点

本实验的总体目标是利用微量热泳技术表征DNA适配体与小分子之间的相互作用，包括结合位点定位。该方法有助于解答有关分子相互作用基本结合参数的关键问题。该技术的主要优势在于其不受相互作用伙伴分子大小的限制，因而能够获得适配体与小分子之间难以检测的相互作用的质量控制数据。

尽管该方法可用于研究适配体与小分子之间的相互作用，也可应用于其他分子间相互作用，如药物-靶标或抗原/抗体相互作用。开始实验前，先用蒸馏水配制 Cy5 标记的 DNA DH25.42 适配体的 100 µM 储存液。然后，用结合缓冲液将适配体储存液稀释至 200 nmol/L。

将适配体工作溶液在90摄氏度下孵育两分钟。将溶液置于冰上冷却至室温。接下来，标记并准备好低吸附的200微升微量离心管，用于待测配体的16步连续稀释。

取20微升10毫摩尔的配体储备液和结合缓冲液加入第1管中。向第2至第16管中各加入10微升结合缓冲液。然后将10微升配体储备液从第1管转移至第2管，并用移液器充分混匀。

取10微升稀释后的混合液转移至第3管中，并充分混匀。以此方式继续进行系列稀释，必要时校正缓冲液稀释效应，完成时将第16管中多余的10微升弃去。向每份稀释液中加入10微升适配体工作溶液，并用移液器充分混匀。

将样品在室温下孵育五分钟。然后将每种混合物吸入一支干净的标准毛细管中，注意仅在毛细管的两端接触。将毛细管按浓度从高到低的顺序放入托盘架中。

启动 MST 设备并打开仪器控制软件。启用手动温度控制，将仪器温度设置为 25 摄氏度。当仪器达到设定温度后，插入毛细管托盘。

将LED通道设置为红色，用于Cy5标记的适配体。调节LED功率以获得500单位的荧光信号。然后进行毛细管扫描，获取毛细管位置并检查样本质量。

如果得到的峰呈 U 形或扁平状，则需在编码毛细管中制备新样品，以尽量减少粘附效应。在 MST 仪器软件中，填写第一根毛细管的配体浓度和稀释类型。通过点击并拖动，填写其余毛细管的浓度和稀释倍数。

输入适体在最终混合物中的浓度。确保实验方法设置为在激光关闭前检测荧光5秒，记录30秒的微量热泳动（MST）信号，然后在关闭激光后再次记录荧光5秒。将激光功率设置为20%。设置文件路径并保存实验文件。

然后开始进行微量热泳动（MST）测量。以这种方式至少获取三次测量数据。开始数据分析时，打开MST分析软件并加载实验文件。

选择 MST 作为分析类型。分析软件允许比较技术重复，即所有测量均来自同一组毛细管。也可将来自不同毛细管组的生物学重复添加到分析中。

单击第一次测量下方的信息按钮。检查 MST 谱线是否存在凸起或尖峰，以判断是否存在聚集或沉淀效应。然后检查毛细管扫描图和毛细管形状叠加图，观察是否存在扁平化或 U 形峰，以判断是否存在粘附或吸附效应。

由于MST可快速检测到聚集和吸收效应，该方法能够快速优化技术设置，以确保最佳的数据质量。通过毛细管扫描和初始荧光检查配体依赖性的荧光淬灭或增强效应。观察随时间变化的荧光信号，以识别光漂白或光增强的迹象。

在确认数据质量后，切换至剂量反应模式。在T跳跃MST分析策略中选择专家分析设置，然后选择Hill模型进行曲线拟合，以自动计算结合参数。

在比较结果菜单中，选择一种归一化类型。将归一化后的数据导出为电子表格或 PDF 文件。在本实验中，采用微量热泳动法（MST）研究了一条单链 DNA 适配体与一系列小分子配体之间的结合相互作用。

采用Hill方程对MST曲线进行拟合，并确定半最大效应浓度值。在针对ATP适配体进行的五次独立生物学重复实验中，ATP适配体相互作用显示出6至13个单位的负结合幅度，平均EC50值约为52.3微摩尔。每种配体的数据均被归一化为结合分子的分数，然后进行比较。

ADP、AMP 和 SAM 相对于 ATP 的 EC50 值表明，磷酸基团的数量对适配体结合行为的影响最多仅为轻微。去除核糖 C2 位的羟基对适配体结合亲和力也仅产生轻微影响。当缺乏配对基团或配对基团被替换为鸟嘌呤时，该适配体不发生结合。

适配体确实能够单独与腺嘌呤结合，进一步表明腺嘌呤基团是适配体的主要结合位点。一旦掌握，该技术可在数分钟至数小时内提供有关基本结合参数的关键信息。