映射的适体对ATP的结合部位使用MicroScale程序热泳
January 7th, 2017
MicroScale Thermophoresis （MST） 是一种表征适配体-靶标相互作用的灵敏技术。本手稿描述了一种表征适配体-小分子相互作用的 MST 方案。
本实验的总体目标是使用微量热泳表征 DNA 适配体小分子相互作用，包括结合位点映射。该方法有助于回答有关分子相互作用的基本结合参数的关键问题。该技术的主要优点是它独立于相互作用伴侣的大小，从而可以获得适配子和小分子之间具有挑战性的相互作用的质量控制数据。
虽然这种方法可以提供对适配体小分子相互作用的见解，但它也可以应用于其他分子相互作用，例如药物-靶标或抗原/抗体相互作用。要开始该程序，请在蒸馏水中制备 Cy5 标记的 DNA DH25.42 适配体的 100 微摩尔储备溶液。然后，用结合缓冲液将适配体储备溶液稀释至 200 纳摩尔。
将适配体工作溶液在 90 摄氏度下孵育 2 分钟。在冰上将溶液冷却至室温。接下来，标记并放置低结合力的 200 μL 微量离心管，对要测试的配体进行 16 步连续稀释。
将 20 微升 10 毫摩尔配体和结合缓冲液储备液移液到试管 1 中。将 10 μL 结合缓冲液移液到试管 2 至 16 中。然后将 10 微升配体原液从试管 1 转移到试管 2 中，并与移液管充分混合。
将 10 微升稀释的混合物转移到试管 3 中并充分混合。以这种方式继续连续稀释，如果需要，校正缓冲液稀释效果，完成后丢弃管 16 中多余的 10 微升。向每个稀释液中加入 10 微升适配体工作溶液，并与移液管充分混合。
在室温下孵育样品 5 分钟。然后将每种混合物吸入干净的标准毛细管中，确保只接触毛细管的末端。将毛细管按浓度降序放入托盘支架中。
启动 MST 设备并打开仪器控制软件。启用手动温度控制并将仪器温度设置为 25 摄氏度。仪器达到正确温度后，插入毛细管托盘。
将 Cy5 标记的适配体的 LED 通道设置为红色。设置 LED 功率以获得 500 个单位的荧光信号。然后进行毛细管扫描以获得毛细管位置并检查样品质量。
如果得到的峰是 U 形或扁平的，请在编码的毛细管中制备新样品，以最大限度地减少粘附效应。在 MST 仪器软件中，填写第一个毛细管的配体浓度和稀释类型。单击并拖动以填充其余毛细管的浓度和稀释度。
输入最终混合物中适配体的浓度。确保实验方法设置为检测荧光 5 秒，记录 MST 30 秒，然后在关闭激光器后记录荧光 5 秒。将激光功率设置为 20%设置文件路径并保存实验文件。
然后开始 MST 测量。以这种方式至少获得三个测量值。要开始数据分析，请打开 MST 分析软件并加载实验文件。
选择 MST 作为分析类型。分析软件允许比较所有测量值都来自同一组毛细管的技术重复。来自不同毛细管组的生物学重复序列也可以添加到分析中。
单击第一个测量下的信息按钮。检查 MST 迹线中是否有指示聚集或降水效应的凸起或尖峰。然后检查毛细管扫描和毛细管形状叠加层是否有指示粘附或吸收效应的扁平或 U 形峰。
由于在 MST 中可以快速检测到聚集体和吸收效应，因此该方法允许快速优化技术设置，以确保最佳数据质量。检查毛细管扫描和初始荧光中配体依赖性荧光猝灭或增强效应。检查荧光随时间的变化是否有照片漂白或照片增强的迹象。
验证数据质量后，切换到剂量反应模式。在 T Jump MST 评估策略中选择专家分析设置。然后选择山丘模型进行曲线拟合，自动计算绑定参数。
在 compare results 菜单中，选择规范化类型。将规范化数据导出为电子表格或 PDF 文件。在此过程中，MST 用于研究单链 DNA 适配体与所选小分子配体的结合相互作用。
MST 曲线与 hill 方程拟合，并确定半数最大有效浓度值。在适配体与 ATP 的 5 次独立生物学重复测量中，ATP 适配体相互作用显示负结合振幅为 6 至 13 个单位，平均 EC50 值约为 52.3 微摩尔。将每个配体的数据归一化为结合分子的分数，然后进行比较。
与 ATP 相比，ADP、AMP 和 SAM 的 EC50 值表明磷酸基团的数量对适配子结合行为的影响最多很小。去除 robo C2 羟基也显示出对适配体结合亲和力的影响很小。在没有配对组或配对组更改为鸟嘌呤的情况下，适配体不会结合。
适配体确实单独与腺嘌呤结合，进一步表明腺嘌呤基团是适配体的主要结合位点。一旦掌握，如果作得当，该技术可以在几分钟到几小时内提供有关基本结合参数的基本信息。
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概述
本研究提出了一种使用微尺度热迁移（MST）来表征DNA适配体-小分子相互作用的协议。MST是一种灵敏的技术，可用于分析分子相互作用的结合参数。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 分析化学
背景
- 微尺度热迁移（MST）用于研究分子相互作用。
- 该方法与相互作用伴侣的大小无关。
- MST可以为具有挑战性的适配体-小分子相互作用提供质量控制数据。
- 它还可以应用于其他相互作用，如药物-靶标或抗原/抗体。
研究目的
- 表征DNA适配体-小分子相互作用。
- 绘制适配体的结合位点。
- 确定分子相互作用的关键结合参数。
使用的方法
- 制备Cy5标记的DNA DH25.42适配体的100微摩尔库存溶液。
- 用结合缓冲液将适配体库存溶液稀释至200纳摩尔。
- 应用微尺度热迁移来分析相互作用。
- 收集数据并分析以评估结合参数。
主要结果
- 成功表征了适配体-小分子相互作用。
- 识别了结合位点和参数。
- 证明了MST对各种分子相互作用的适用性。
- 为具有挑战性的相互作用提供了质量控制数据。
结论
- MST是研究适配体-小分子相互作用的有价值工具。
- 该方法增强了对结合动力学的理解。
- 它可以扩展到其他类型的分子相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of aptamer-small molecule binding sites using MicroScale Thermophoresis (MST) addresses a critical need for precise target validation and mechanistic de-risking in early discovery. MST's sensitivity and independence from molecular size enable robust characterization of challenging interactions, supporting predictive confidence at key portfolio inflection points. This capability enhances the reliability of molecular interaction data for downstream screening and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of binding affinity and specificity for aptamer-target interactions.
- Supports mechanistic de-risking by mapping precise binding sites, clarifying molecular recognition.
- Facilitates functional target validation for novel or challenging molecular entities.
- Provides rapid feedback on binding parameters to inform portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated quantitative outputs for assay standardization and reproducibility.
- Prepares robust biological systems for reliable compound screening workflows.
- Enables scalability and platform reuse by supporting diverse buffer and sample conditions.
- Ensures high-quality data for compound evaluation through rapid detection of aggregation or absorption artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular interaction data with disease-relevant systems when aptamers are used as translational tools.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by providing consistent binding metrics.
- Supports risk-adjusted advancement decisions with quantitative, reproducible interaction data.
Pipeline & Workflow Integration
MST-based binding site mapping integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, enabling seamless data flow and decision-making.
- Discovery Biology: Provides hypothesis testing and pathway clarification by quantifying aptamer-ligand interactions.
- Screening: Offers reproducible, quantitative assay outputs for downstream screening readiness.
- Analytics: Generates EC50 and binding amplitude measurements to compare molecular conditions and optimize protocols.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when aptamers are leveraged in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes MST as a reusable platform for diverse molecular interaction studies beyond a single project.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for molecular interaction analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-quality binding data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust interaction metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical assay setup and data interpretation.
- Needs access to MST instrumentation and compatible analytical software.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample preparation and data quality control.
- May require adaptation of protocols for different aptamer or ligand systems.
- Sample aggregation or absorption artifacts must be rapidly identified and mitigated for optimal results.
