Name: 小鼠原位膀胱肿瘤模型和肿瘤检测系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学习建立小鼠原位膀胱肿瘤模型的非手术方法，使用C57BL/6J雌性小鼠和MB49 PSA肿瘤细胞进行膀胱癌研究。该技术便于监测肿瘤生长并评估新型膀胱内治疗方案的疗效。

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本工作由新加坡国家医学研究委员会（NMRC/CIRG/1335/2012）授予Kesavan Esuvaranathan教授的资助项目提供经费支持。

所有动物实验均遵循新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）关于动物使用与操作的指南（方案编号 084/12）。
1. 培养 MB49-PSA 细胞 体外 以及前列腺特异性抗原（PSA）分泌的测定
<ol>
	<li>维持小鼠膀胱癌细胞 MB49-PSA15 在添加了10%胎牛血清的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中 (FBS）、2 mmol/L L-谷氨酰胺和0.05 mg/mL青霉素-链霉素，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2加入200 μg/mL潮霉素B以维持对分泌PSA细胞的选择压力。</li>
	<li>为测定PSA分泌，将1 × 10⁵个细胞接种于96孔板中6 6孔培养板中的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 48 小时。</li>
	<li>两天后，收集上清液用于PSA检测。
	<ol>
		<li>使用巴斯德吸管将上清液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>离心5分钟，250 × g，以去除漂浮的细胞和碎片。若前列腺特异性抗原（PSA）检测在另一天进行，将上清液置于1.5 mL微量离心管中，于-30 °C保存。若非如此，则立即进行下一步操作。</li>
		<li>使用人游离PSA ELISA试剂盒测定PSA浓度7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计数已接种的细胞。
	<ol>
		<li>使用巴斯德吸管，用 1 mL DMEM 轻柔地清洗细胞。吸去并彻底移除培养基。</li>
		<li>加入1 mL新鲜培养基，用细胞刮轻轻刮取，使细胞从孔中脱落。</li>
		<li>将细胞转移至微量离心管中，并充分重悬，以确保形成单细胞悬液。</li>
		<li>将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液等体积混合，用血细胞计数板计数未染色的活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以每毫升培养基中 PSA 的纳克数除以 10 来计算 PSA 表达量6 细胞。用于小鼠移植的MB49-PSA细胞的PSA表达量为80 - 120 ng/mL/106 细胞</li>
</ol>
2. 通过 ELISA 和实时 PCR 分析确定 PSA 检测的灵敏度
<ol>
	<li>在6孔培养板中，使用完全DMEM培养基接种MB49-PSA细胞，并加入不同数量的亲本MB49细胞，使亲本细胞数量最多为1 × 10⁶6 每孔细胞数（即， 100, 101, 102, 103, 104, 105，或106 MB49-PSA 细胞在含有 106, 105, 104, 103, 102, 101，或100 MB49细胞，分别）。</li>
	<li>一天后，按照步骤1.3所述收集上清液用于PSA检测。使用人游离PSA ELISA试剂盒测定PSA浓度7.</li>
	<li>从细胞中提取RNA。
	<ol>
		<li>直接在培养板中加入1 mL RNA提取试剂裂解细胞。</li>
		<li>室温孵育5分钟，将细胞裂解液转移至微量离心管中。加入0.2 mL氯仿，剧烈涡旋振荡样品15秒。室温孵育3分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。小心转移上层水相（0.5 mL）至新离心管中，避免扰动中间相。</li>
		<li>加入0.5 mL异丙醇。室温孵育10分钟。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟。完全去除上清液，勿扰动管底的RNA沉淀。</li>
		<li>用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀一次。在4 °C下以7,500 × g离心5分钟。彻底去除乙醇，将沉淀在空气中干燥10分钟。</li>
		<li>将RNA溶解于30 µL无核酸酶的水中。60 °C孵育5分钟以提高溶解度。</li>
		<li>通过紫外（UV）分光光度法在260 nm（A260）处测定吸光度来定量RNA。为评估RNA纯度，测量280 nm（A280）处的吸光度并计算A260/A280比值，该比值应高于1.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从2 µg RNA中反转录合成cDNA。
	<ol>
		<li>在冰上配制反应混合物，并转移至0.2 mL离心管中。</li>
		<li>短暂离心试管，使内容物沉降至管底，并消除气泡。</li>
		<li>将试管放入热循环仪中，按以下条件进行逆转录：37 °C 反应 60 分钟，随后 95 °C 反应 5 分钟。程序运行结束后，将 cDNA 样品置于 4 °C 保存。</li>
		<li>将样品在 -30 °C 下保存以实现长期储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对PSA和细胞质β-actin进行实时PCR分析。使用β-actin对样本进行归一化处理。在96孔板中，以100 ng逆转录RNA进行检测。所有样本均设三个复孔。进行40个循环，参数如下：50 °C保持2分钟，95 °C保持10分钟，95 °C变性15秒，60 °C保持1分钟。将最低检测限设定为循环阈值（CT）35；因此，CT值超过35的样本视为不可检测。</li>
</ol>
3. 维持 MB49-PSA 细胞系的致瘤性
注意：长期生长 体外 导致成瘤性丧失。为维持成瘤性，MB49-PSA细胞系至少每2年需在小鼠体内传代一次。
<ol>
	<li>细胞。
	<ol>
		<li>使用无菌细胞刮刀轻轻刮取指数生长期的细胞，收集细胞。取等体积的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板计数活细胞。若死亡细胞比例超过20%，则不得用于移植。</li>
		<li>根据所需活细胞数量（1 × 107 个细胞/mL）计算并转移至15 mL离心管中。在4 °C条件下以250 × g离心5分钟，弃去上清液。用不含血清的DMEM培养基重悬细胞沉淀。重复洗涤三次，以彻底去除移植前残留的胎牛血清（FBS）。</li>
		<li>将细胞悬液置于冰上，直至小鼠准备就绪进行移植。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肿瘤细胞接种于小鼠背部侧 flank 皮下。
	<ol>
		<li>通过腹腔注射麻醉剂混合物（氯胺酮75 mg/kg和美托咪啶1 mg/kg）对4至6周龄的C57BL6/J小鼠进行麻醉，注射剂量为每10 g体重0.1 mL。</li>
		<li>剃除右侧 flank 的毛发，暴露皮肤。</li>
		<li>用镊子提起皮肤，使其与下方肌肉分离，使用24 G针头将0.1 mL细胞悬液（含1 × 106 个细胞）注射至皮下。拔出针头时，捏住注射部位5至10秒，防止肿瘤细胞外漏。</li>
		<li>通过皮下注射阿替美唑（1 mg/kg），剂量为每10 g体重0.1 mL，使小鼠苏醒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔两天使用游标卡尺测量肿瘤直径，监测肿瘤生长情况。肿瘤体积按公式 v = (ab2)/2 计算，其中&#34;a&#34;为最长径，&#34;b&#34;为垂直宽度，单位均为mm。</li>
	<li>当肿瘤体积达到至少50 mm3（约7天后），使用CO2处死小鼠。在无菌条件下，使用无菌镊子和剪刀切除肿瘤组织，并置于DMEM培养基中。</li>
	<li>在6孔培养板中，使用无菌手术刀将肿瘤组织切成小块。用1 mL注射器活塞作为&#34;研杵&#34;进一步分散组织。</li>
	<li>加入3 mL完全DMEM培养基，将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。</li>
	<li>待细胞贴壁后（约1至2天），使用无菌巴斯德吸管轻轻吸除培养基、碎片及未贴壁细胞。用DMEM洗涤两次，注意避免扰动已贴壁细胞。</li>
	<li>加入1 mL DMEM培养基，用细胞刮刀刮取细胞。为筛选和扩增单克隆细胞，使用血细胞计数板计数细胞，并以每孔1个细胞的密度接种至96孔培养板中。在含200 μg/mL潮霉素B的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养细胞。</li>
	<li>每4至5天更换一次培养基和抗生素。持续观察细胞，直至其融合度达到约80–90%。通过吹打使细胞从孔中脱落，转移至24孔培养板中继续培养。</li>
	<li>当24孔培养板中的细胞达到完全融合时，用细胞刮刀刮下细胞，并接种至6孔培养板中。</li>
	<li>按照步骤1所述方法，对不同克隆进行PSA分泌水平的筛选。冻存PSA分泌量最高的克隆，并用于后续的小鼠实验。</li>
</ol>
4. 植入肿瘤
注意：每只小鼠在膀胱内接种 1 × 105 个 MB49-PSA 细胞，悬浮于 50 µL DMEM 无菌培养基中。由于导管存在死腔，务必额外准备一定体积的细胞悬液（每只小鼠至少多准备 100 µL）。另一种替代方法是采用 Kasman et al.5 所述的空气填充注射器，而非液体填充注射器。
<ol>
	<li>细胞。
	<ol>
		<li>移植前一天，当细胞融合度约为80%时，在37 °C、5% CO2条件下，以1:2的传代比例将MB49-PSA肿瘤细胞传代至含完全DMEM培养基（补充10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.05 mg/mL青霉素-链霉素和200 µg/mL潮霉素B）中。</li>
		<li>在实验当天，用无菌细胞刮刀轻轻刮取细胞以收获细胞。取等体积的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液混合，使用血细胞计数板计数活细胞。若死亡细胞比例超过20%，则不得用于移植。</li>
		<li>计算所需活细胞数量（2 × 106 个细胞/mL），并将细胞转移至15 mL离心管中。在4 °C下以250 × g离心5分钟，弃去上清液。用无血清DMEM培养基重悬细胞沉淀。为彻底去除胎牛血清残留，重复洗涤三次。</li>
		<li>将细胞悬液置于冰上，直至小鼠准备就绪进行移植。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让4至6周龄的雌性C57BL/6J小鼠在实验前适应环境一周。所有动物操作均须在生物安全柜中进行，以维持无菌条件。
	<ol>
		<li>称量每只小鼠体重，并按每10 g体重注射0.1 mL的剂量腹腔注射麻醉剂（75 mg/kg氯胺酮和1 mg/kg美托咪啶）。小鼠体重应在17至22 g之间。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉成功。</li>
		<li>为便于识别，使用耳标钳对耳朵进行标记。</li>
		<li>为维持水合状态，每1–2小时腹腔注射一次Hartmann's solution（复方乳酸钠溶液），剂量为每10 g体重0.1 mL。</li>
		<li>由于麻醉期间眨眼反射消失，眼睛容易干燥，因此需使用无菌棉签将无菌眼膏涂抹于双眼。必要时可重复涂抹。</li>
		<li>将小鼠仰卧置于加热垫（通过接触空气激活）上方的纸巾上，以维持体温，并用胶带固定后肢。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用手指轻压下腹部区域，将膀胱中的尿液收集至1.5 mL微量离心管中。该样本作为尿液PSA的基础值。</li>
	<li>用1 mL注射器吸取无菌聚-L-赖氨酸（PLL），连接24号静脉留置导管（拔除针芯）。在导管尖端涂抹润滑剂，使用镊子引导导管经尿道插入膀胱。当感到阻力时停止插入。注意：&#160;研究人员应与兽医人员讨论在膀胱内灌注过程中是否需要使用含麻醉成分的润滑凝胶，以及术后是否需使用镇痛药物。</li>
	<li>以每20秒10 µL的缓慢速度注入50 µL PLL，以避免发生膀胱输尿管反流18。导管保留在膀胱内20分钟，并使用堵头防止液体流出。</li>
	<li>20分钟后，拔出导管，并通过轻压下腹部排空膀胱内容物。使用一支空的1 mL注射器冲洗导管内残留液体。</li>
	<li>通过移液充分混匀MB49-PSA细胞，将其吸入1 mL注射器中。连接导管并涂抹润滑剂，以每20秒10 µL的缓慢速度注入50 µL含1 × 105 个细胞的悬液。随后在导管上重新安装堵头。对照组小鼠注入50 µL生理盐水。</li>
	<li>1小时后，拔除导管并排空膀胱内容物。解除后肢固定胶带，将小鼠置于俯卧位。按每10 g体重0.1 mL的剂量皮下注射拮抗剂（1 mg/kg阿替美唑）以复苏小鼠。</li>
	<li>持续监测小鼠直至出现自主运动，然后将其放回饲养笼中。</li>
	<li>完成肿瘤检测方案（第5、7或8节）后，使用CO2对小鼠实施安乐死。死后肿瘤检测方法见第6节。</li>
</ol>
5. 使用 ELISA 监测肿瘤生长
注意：通过检测小鼠尿液中前列腺特异性抗原（PSA）的分泌情况来监测肿瘤的存在与生长。&#160;研究人员应咨询兽医人员，了解肿瘤植入后动物健康与福利状况的监测以及人道终点的判定。
<ol>
	<li>收集小鼠尿液有两种方法。
	<ol>
		<li>将单只小鼠置于专门设计的代谢笼中，通过代谢笼分离尿液与粪便材料，过夜收集尿液。如果设备不具备冷藏功能，需在尿液收集管中加入蛋白酶抑制剂（100 µL），以防止前列腺特异性抗原（PSA）在过夜期间降解。然而，由于可用的代谢笼数量有限，该方法的应用受到限制。</li>
		<li>在无法使用代谢笼的情况下（例如在ABSL2级实验室内），可在小鼠麻醉后（如步骤4.2.1所述），用手指轻轻按压其下腹部区域，采集随机尿样。该操作通常在给予治疗前进行。根据我们的经验，麻醉后1小时通常可收集到至少150 µL尿液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集后的尿液应立即置于冰上。肿瘤植入后第二周起可能观察到血尿。严重溶血的样本可能影响ELISA检测结果，因此尿液必须在收集后立即置于冰上，并尽快处理。</li>
	<li>在4 °C条件下，以6,700 × g离心尿液管5分钟，以去除细胞或碎片。</li>
	<li>为校正小鼠间尿液排泄量的差异，将尿液分装至新管中，并在-30 °C保存，直至使用ELISA试剂盒7检测PSA以及使用检测试剂盒7检测肌酐。尽管小鼠本身不产生PSA，但使用ELISA检测时仍可检测到低水平的非特异性结合。要将样本判定为阳性，其阈值必须设定为高于正常小鼠值加3个标准差（SD）以上的水平15。</li>
</ol>
6. 使用实时 PCR 检测肿瘤的存在
<ol>
	<li>实验结束时，解剖小鼠腹腔并找到膀胱。切除膀胱并将其放入冻存管中，立即在液氮中冷冻。</li>
	<li>使用RNA提取试剂对组织进行匀浆，提取RNA。</li>
	<li>按照上述第2节所述方法，对PSA进行逆转录和实时PCR分析。</li>
</ol>
7. 使用荧光成像监测肿瘤生长
<ol>
	<li>用近红外荧光染料标记 1 × 107 个 MB49-PSA 细胞19。</li>
	<li>在第 4、7、11、14、18 和 21 天重新铺板并收集标记的细胞，通过流式细胞术检测细胞是否保持活力和荧光性20。</li>
	<li>按照上述第 4 节所述方法，将标记的 MB49-PSA 细胞植入小鼠膀胱中。</li>
	<li>每两天使用荧光成像系统监测肿瘤生长情况。</li>
	<li>成像当天，称量小鼠体重，并通过腹腔注射麻醉剂混合物（氯胺酮 75 mg/kg 和美托咪啶 1 mg/kg），按每 10 g 体重注射 0.1 mL 的剂量进行麻醉。</li>
	<li>剃除腹部区域毛发以暴露皮肤。</li>
	<li>将小鼠放入成像室，使用成像系统配套软件采集膀胱图像。</li>
	<li>通过皮下注射拮抗药物（阿替美唑 1 mg/kg），按每 10 g 体重注射 0.1 mL 的剂量使小鼠苏醒。</li>
</ol>
8. 使用高频超声成像监测肿瘤生长
<ol>
	<li>按照上述第4节所述方法在小鼠体内植入肿瘤。</li>
	<li>每两天使用超声成像监测一次肿瘤生长情况。</li>
	<li>成像当天，使用氯胺酮和美托咪啶的混合麻醉剂（剂量分别为75 mg/kg和1 mg/kg）对小鼠进行腹腔注射麻醉，每10 g体重注射0.1 mL。</li>
	<li>剃除腹部区域毛发，暴露皮肤。</li>
	<li>使用24号静脉导管向膀胱内注入100 μL无菌0.9%生理盐水。生理盐水可使膀胱扩张，从而在超声成像过程中提高可视性。</li>
	<li>将小鼠置于超声平台，并在下腹部涂抹导电凝胶。</li>
	<li>将手持探头轻放至皮肤表面，在成像平台上获取膀胱的B型超声图像21。</li>
	<li>通过皮下注射拮抗剂（阿替美唑，1 mg/kg）以逆转麻醉效果，每10 g体重注射0.1 mL。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该实验方案中最关键的步骤包括：1）成功维持细胞系的致瘤性；2）在将肿瘤细胞植入小鼠前确保可检测到前列腺特异性抗原（PSA）的分泌；3）制备单细胞悬液以进行植入，从而减少肿瘤大小的差异；4）以缓慢速率注入细胞，防止发生膀胱输尿管反流，避免肿瘤细胞植入肾脏。
长期传代后 体外MB49/MB49-PSA 细胞可能会丧失其致瘤性，表现为无法在小鼠体内形成肿瘤。这可能成为判断治疗后小鼠是否被治愈的一个混杂因素。当缺乏肿瘤时，无法区分经治疗治愈的小鼠、因肿瘤具有免疫原性而自发痊愈的小鼠，或原本就未形成肿瘤的小鼠（因细胞系本身失去致瘤能力）。为应对这一问题，可通过在小鼠体内传代、建立皮下肿瘤来重新激活细胞。若传代过于频繁，则可能产生过度侵袭性的肿瘤。因此，需谨慎把握细胞重新传代的时机。通常情况下，在开展重要实验系列之前，应复苏细胞系并将其皮下接种至小鼠体内，以确认其成瘤能力。随后需对肿瘤进行数周的监测，确保未出现自发消退现象。若观察到自发消退，则应执行步骤3中的方案。同样，在将 MB49-PSA 细胞用于肿瘤接种前，必须始终验证其产生 PSA 的能力。
<p class...

本方法的目的是建立小鼠原位膀胱肿瘤模型，并尽可能准确地监测移植的肿瘤，以避免在实验终点分析时将未成功移植肿瘤的小鼠误判为已治愈。总体而言，该方法将减少实验分析所需的小鼠数量，并提高治疗效果判定的准确性。
建立癌症原位模型非常重要，因为皮下接种肿瘤细胞无法模拟临床疾病的微环境，也无法支持治疗策略的开发。膀胱的结构特点允许将膀胱癌治疗药物直接灌注至膀胱内，从而产生最小的全身性影响。因此，能够模拟这种环境的动物模型（例如原位模型）对于评估新疗法至关重要。任何实验设计所得出的结论都取决于模型本身的局限性。
已开发出多种技术用于在小鼠体内建立原位膀胱肿瘤模型。这些技术依赖于破坏膀胱的糖胺聚糖层，从而使肿瘤细胞得以植入。其中一种方法是电灼法，该方法在膀胱壁上造成单个损伤点，导致肿瘤在膀胱内单一位置形成1,2。然而，电灼法的肿瘤植入成功率依赖于操作者，成功率范围为10–90%，且存在膀胱壁被穿孔的风险，可能导致肿瘤在腹腔内形成。化学灼烧法使用硝酸银破坏膀胱壁3。类似地，也曾使用酸性物质损伤膀胱壁4。此外，胰蛋白酶也被用于破坏膀胱组织5。这些方法可能导致膀胱内形成多个肿瘤。此外，若化学试剂与膀胱壁接触时间过长，存在造成膀胱严重损伤的风险。Ninalga 等建立的方法利用带正电荷的聚-L-赖氨酸（PLL）6分子包被膀胱壁，从而使带负电荷的肿瘤细胞能够黏附于膀胱的糖胺聚糖层。该方法通常导致膀胱内形成多个肿瘤，但肿瘤植入率可达80–100%4,7。从技术角度看，这也是最容易操作的方法。为确保所形成的肿瘤大小相对均匀，重要的是在植入前肿瘤细胞不应聚集成大的团块。
为了评估治疗效果，最好在肿瘤大小相近的小鼠中进行本研究。因此，一种能够在植入后尽快量化肿瘤大小的灵敏检测系统至关重要。目前已采用多种策略来评估肿瘤，包括磁共振成像（MRI）8-10、荧光成像11、生物发光成像12,13、超声成像14以及酶联免疫吸附测定（ELISA）15,16。MRI和超声成像无需对肿瘤细胞进行遗传修饰，但MRI需要高灵敏度设备和对比剂。基于荧光、发光和ELISA的检测方法则需要对肿瘤细胞进行改造，使其表达可被这些方法检测到的标记蛋白。对于生物发光检测，需加入底物以检测荧光素酶活性，因此增加了实验步骤和成本。生物发光和荧光检测均需要专用仪器。荧光蛋白的产生依赖于绿色荧光蛋白（GFP）的环化反应，该反应由分子氧催化完成，因此在肿瘤组织内部，由于氧气供应不均，GFP的表达可能不稳定，导致其作为标记物的可靠性较差17。另一种策略是改造小鼠膀胱癌细胞系MB49，使其分泌人前列腺特异性抗原（PSA）15,16作为替代标记物。这些标记物还可用于实验终点时确认肿瘤的存在，从而作为免疫组织化学的替代方法。本研究报道了PLL法进行原位肿瘤植入的技术，并比较了ELISA、荧光成像和超声成像三种肿瘤检测系统。

<table><tbody><tr><td>MB49-PSA 细胞</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>参考文献（Wu QH, 2004）</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养基</td><td>Biowest</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>南美胎牛血清（FBS）</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>南美胎牛血清（FBS），优级</td><td>Biowest</td><td>S181B</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>HyClone</td><td>SH30088.03&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biowest</td><td>X0550</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>游离 PSA（人）ELISA 试剂盒</td><td>Abnova</td><td>KA0209</td><td></td></tr><tr><td>用于 RNA 提取的 TRIzol 试剂&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>含 RNase 抑制剂的高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 通用 PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 &amp;ndash; 小鼠 Actb</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>Mm00607939_s1</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达检测 &amp;ndash; 人 KLK3</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>Hs00426859_g1</td></tr><tr><td>C57BL/6J 雌性小鼠</td><td>In Vivos</td><td></td><td>4–6 周龄</td></tr><tr><td>麻醉剂（75 mg/kg 氯胺酮和 1 mg/kg 美托咪啶）</td><td>本地药房</td><td></td><td></td></tr><tr><td>拮抗剂（1 mg/kg 阿替美唑）</td><td>本地药房</td><td></td><td></td></tr><tr><td>耳标钳</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72893-01</td><td></td></tr><tr><td>哈特曼溶液或复方乳酸钠溶液</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏 - Duratears 无菌眼用润滑软膏</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>暖热包 - HotHands 暖手器</td><td>Heatmax Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Certo 静脉留置针</td><td>B Braun</td><td>4251300</td><td>24 G x 3/4&amp;Prime;</td></tr><tr><td>Aquagel 润滑胶</td><td>本地药房</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液，0.01%</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Quantichrom 肌酐检测试剂盒</td><td>BioAssay Systems</td><td>DICT-50&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>荧光染料 - VivoTrack 680</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV12000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater-ICE 冷冻组织过渡溶液</td><td>Ambion</td><td>4427575</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7500 实时 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7500 软件 v2.3</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>代谢笼</td><td>Tecniplast&amp;nbsp;</td><td>12 个笼位的立式支架</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto I 系统&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件 v7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS SpectrumCT &lt;em&gt;活体&lt;/em&gt;成像系统&amp;nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 软件 v3.1</td><td>Caliper Life Sciences&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 成像系统&amp;nbsp;</td><td>VisualSonics&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种小鼠原位膀胱肿瘤模型及肿瘤检测系统

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

本方案描述了使用经改造可分泌人前列腺特异性抗原（PSA）的小鼠膀胱癌细胞系MB49，在雌性C57BL/6J小鼠中诱导膀胱肿瘤的建立方法，以及确认肿瘤植入的操作流程。简言之，采用注射类麻醉药物使小鼠麻醉，并使其呈仰卧位固定。排空膀胱内尿液后，使用24 G静脉导管以10 µL/20 s的速度缓慢灌注50 µL聚-L-赖氨酸（PLL）。通过封闭导管使PLL在膀胱内保留20分钟。随后拔除导管，并轻柔按压膀胱以排出PLL。接着以相同速度（10 µL/20 s）灌注小鼠膀胱癌细胞系（1 × 105 细胞/50 µL），并封闭导管以防止细胞悬液过早排出。1小时后，使用拮抗药物使小鼠苏醒，并排空膀胱。缓慢灌注至关重要，因其可减少膀胱输尿管反流，避免肿瘤在上尿路及肾脏中形成。细胞悬液应充分重悬，以减少细胞团块形成，否则可能导致植入后肿瘤大小不均。
该技术可高效诱导肿瘤形成。通过检测尿液中PSA的分泌来监测肿瘤生长。与超声或荧光成像相比，PSA标志物监测在检测膀胱内肿瘤存在方面更为可靠。若不进行治疗，小鼠体内的肿瘤通常在约3至4周内达到最大尺寸，对健康产生负面影响。通过监测肿瘤生长情况，可以区分真正被治愈的小鼠与未成功植入肿瘤的小鼠。若仅进行终点分析，后者可能被错误地认为已通过治疗实现治愈。

MB49细胞的PSA分泌量随培养基的不同而变化。MB49-PSA在DMEM培养基中培养，因为这能促进PSA的分泌增加。图1A). 为了确定PSA ELISA和实时PCR的灵敏度，将不同数量的MB49-PSA分泌细胞与MB49亲本细胞混合。PSA ELISA可检测到最低1 × 105 PSA 分泌细胞/1 × 106 细胞（图1B），而实时 PCR 分析可检测到每 1 × 10⁶ 个细胞中 100 个分泌 PSA 的细胞6 细胞（图 1C）。因此，实时PCR比ELISA更敏感，但仅能用于整个膀胱的检测，限制了其在终点分析中的应用。PLL法肿瘤植入会导致多个肿瘤（图2A)在膀胱中发育。使用代谢笼过夜收集尿液（图2B，上图）和随机尿样（图2B，下图）可用于ELISA法检测PSA。...

本方案描述了在雌性C57BL/6J小鼠中建立原位膀胱肿瘤并监测肿瘤生长的方法。

本方案描述了利用经修饰的小鼠膀胱癌细胞系MB49，在雌性C57BL/6J小鼠中诱导膀胱肿瘤的方法……

该非手术方法的总体目标是稳定地在小鼠体内建立易于监测的原位非肌层浸润性膀胱肿瘤，以便评估膀胱内治疗的效果。该方法有助于回答膀胱癌领域中的关键问题，例如新型膀胱内疗法的评估。该技术的主要优势在于易于在小鼠体内植入肿瘤并监测其生长，有助于准确评估治疗反应。在植入前一天，当细胞融合度达到约80%时，用完全DMEM培养基以1:2的比例传代MB49 PSA肿瘤细胞。在操作当天，收集并计数细胞，确保其处于良好的生长状态。取等体积的细胞悬液与4%台盼蓝混合，用血细胞计数板计数被染成蓝色的活细胞。细胞存活率应至少达到80%。随后，将细胞以每毫升200万个的密度重悬于15毫升离心管中，并用DMEM洗涤三次。然后将其保持低温，直至准备注射。一旦雌性小鼠被麻醉，需通过腹腔注射每10克体重1毫升的哈特曼溶液以补充水分。在麻醉期间，每隔一至两小时重复一次。接下来，将无菌眼膏涂抹于双眼，并根据需要重新涂抹。然后，将小鼠仰卧置于加热垫上的纸巾上，以维持其体温。接着，用胶带固定小鼠的后肢。现在对下腹部区域施加轻柔的压力，将尿液收集到 1.5 毫升离心管中，以测定尿液 PSA 的基础水平。接着，用无菌 PLL 装填一支 1 毫升注射器，并连接一根已移除针芯的 24 号静脉导管。在导管尖端涂抹润滑剂。然后，将导管插入尿道，并用镊子引导其进入膀胱。当感到阻力时停止推进。随后，以每20秒注入10微升的速度缓慢注入共50微升的PLL，以避免发生膀胱输尿管反流。现在将导管保留在膀胱内 20 分钟，并用塞子防止液体流出。20 分钟后，拔出导管，并通过轻柔按压下腹部排空膀胱内的任何内容物。然后，使用 1 毫升注射器将导管内残留的任何物质冲洗干净。现在用移液器充分混匀MB49 PSA细胞，并将其加入1 mL注射器中。连接导管并按之前方法进行润滑。将导管按之前方法插入膀胱。以每20秒缓慢推出10微升的速度开始注射细胞，随后等待1小时。1小时后，拔除导管并排空膀胱内所有内容物。然后，释放小鼠，将其置于仰卧位，并通过注射阿替美唑使其复苏。现在监测小鼠，直至其恢复胸卧位，随后将其放回原笼中。MB49细胞的PSA分泌被发现随培养基的不同而变化。使用DMEM培养基是因为其诱导的PSA分泌量最高。为了确定PSA ELISA的检测灵敏度，将不同数量的MB49 PSA分泌细胞与MB49亲本细胞混合。该检测方法每百万个细胞中至少可检测到10万个PSA分泌细胞。PLL法进行肿瘤植入会导致膀胱内形成多个肿瘤。可使用代谢笼收集过夜尿液，也可采集随机尿样，通过ELISA检测PSA水平。所有动物实验中，均记录小鼠体重作为健康状况的评估指标。每周监测尿液 PSA 水平以评估肿瘤生长情况。每只小鼠接受不同的治疗，导致肿瘤大小不同。植入后两周，采集膀胱组织并进行处理。肿瘤大小存在差异，而PSA测量结果可对此进行预测。观看本视频后，您应能充分理

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