Name: 使用中性毛细管单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 学习毛细管区带电泳技术用于单克隆抗体的理化异质性分析。本方案详细讲解样品制备、系统设置及数据处理步骤，帮助分析化学实验室人员提升操作技能并确保检测结果的可靠性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者感谢Wiley授权在本教程中使用以下出版物中的概念。Carlos E. Espinosa-de la Garza、Francisco C. Perdomo-Abúndez、Jesús Padilla-Calderón、Jaime M. Uribe-Wiechers、Néstor O. Pérez、Luis F. Flores-Ortiz、Emilio Medina-Rivero：《毛细管区带电泳法分析重组单克隆抗体》。《电泳》。2013年。第34卷。1133-1140页。版权© Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA。本研究由墨西哥国家科学技术委员会（CONACyT）资助，项目编号230551。

1. 溶液的配制
<ol>
	<li>制备BGE溶液。
	<ol>
		<li>配制100 ml溶液，其中含0.05% (m/v) 羟丙基甲基纤维素（HPMC）、200 mM ε-氨基正己酸（EACA）和30 mM醋酸锂。 
		注意：由于HPMC是一种黏弹性聚合物，应先将粉末倒入玻璃烧杯中，加入80 mL水，最后放入搅拌子。随后按常规方法加入其余试剂。操作醋酸锂时需佩戴护目镜，因其可能引起眼部刺激。</li>
		<li>用50% (v/v) 乙酸将pH值调节至4.8 ± 0.1。静置溶液5分钟，必要时再次调节pH。</li>
		<li>加水定容至100 ml容量瓶中的最终体积。</li>
		<li>使用孔径为0.2 µm的亲水性膜过滤。</li>
		<li>2–8 °C下保存，最多可保存7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备内标溶液。
	<ol>
		<li>配制1 mL含1% (m/v) 组胺的溶液。</li>
		<li>使用孔径为0.2 µm的亲水性膜过滤。</li>
		<li>2–8 °C下保存，最多可保存1天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>用Tris缓冲液（50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷，pH 8.0）将单克隆抗体样品稀释至终浓度为1 mg/ml，制备180 µl的稀释样品。</li>
	<li>加入20 µl的1%（m/v）组胺溶液。</li>
	<li>混匀后在1,000 × g离心5秒。</li>
	<li>将微量离心管放入通用管中。</li>
	<li>将样品转移至微量离心管中，并盖紧通用管。加样时应向上 dispensing，以避免引入气泡。</li>
	<li>在2–8 °C条件下保存，最长可存放1天。</li>
	<li>将装有含样品溶液的微量离心管的通用管放入样品进样盘中。</li>
</ol>
3. CE 系统的准备。
<ol>
	<li>毛细管电泳系统清洗。 
	注意：为避免因灰尘和碎屑积聚导致的漏电，应至少每周进行一次该操作。然而，具体频率需根据应用情况而定（例如，使用黏度较高或盐浓度较高的背景电解质（BGE）、黏度较高的样品时，电极和开盖杠杆可能需要更频繁地清洗，以防止交叉污染和样品残留。
	<ol>
		<li>关闭毛细管电泳仪的电源开关并打开前门。</li>
		<li>用沾水的无纺布擦拭样品盖、样品固定系统（样品和缓冲液托盘）、卡盒盖、夹紧杆、接口块和电极的表面。再用沾乙醇的无纺布重复擦拭，并在使用前晾干。</li>
		<li>用水彻底冲洗开口杠杆，用无纺布擦拭其表面。再用蘸有乙醇的擦拭布重复操作，安装前晾干。</li>
		<li>使用沾水的超细纤维布小心清洁光纤电缆的两端，然后用沾有乙醇的布重复上述操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试剂盒组装
	<ol>
		<li>移除一支新的中性毛细管（50 µm 内径）从包装中取出。</li>
		<li>将毛细管保护套管的一端用胶带固定在工作台上。解开缠绕部分，拉直毛细管，并从套管中抽出。</li>
		<li>在工作台表面贴一条胶带或纸条，并按以下尺寸标注刻度：至检测器的距离（30 cm）、毛细管窗口（0.2 cm）以及至出口端的距离（10 cm）（即，总长度40.2 cm，有效长度30.0 cm。</li>
		<li>将毛细管窗口与参照纸上0.2 cm刻度标记对齐。用胶带固定毛细管，并在测量标记外侧2 mm处标记毛细管两端。</li>
		<li>使用裂解刀的平整边缘，在毛细管入口端（远离窗口的一端）以单次直线动作切割保护帽。
		<ol>
			<li>将毛细管末端浸入装有水并盖紧盖子的通用样品瓶中，以避免毛细管内壁涂层受到永久性损伤。每次毛细管末端暴露在环境中超过1分钟时，均需重复此操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将毛细管的入口端插入卡盒的出口侧。</li>
		<li>根据需要前后推动毛细管，使其穿过卡盒，直至毛细管窗口与卡盒窗口居中对齐。</li>
		<li>插入光圈插头（100 µm x 200 µm) 加入到试剂盒窗口中。 
		注意：使用白色光源照射时，需确认光线能透过窗口。若透过的光线呈棕褐色，则应相应调整。</li>
		<li>将毛细管插入预先制备的冷却液管路中，毛细管总长度为40.2 cm（两端依次配有预安装的管螺母、卡套和O形圈）。</li>
		<li>根据需要将毛细管穿过冷却液管，直至毛细管出现在管的另一侧。</li>
		<li>将冷却液管路末端插入盒的出口侧并拧紧管路螺母。</li>
		<li>将毛细管的进样端插入卡盒的进样侧。</li>
		<li>根据需要将毛细管推入并拉出 cartridge，直至毛细管出现在 cartridge 的入口端。</li>
		<li>将冷却液管路的末端插入盒的进液口一侧，并拧紧管路螺母。</li>
		<li>使用裂解刀的平整边缘，从毛细管出口端（靠近窗口的一端）单次直线切割保护帽。</li>
		<li>将密封固定夹安装到毛细管两端，并按压至卡入到位。目视检查毛细管两端。若两端不平整，请重复上述操作。</li>
		<li>将毛细管长度模板放置在工作台边缘。</li>
		<li>将 cartridge 倒置贴合于毛细管长度模板上，使毛细管两端与模板上的参考线对齐。如果毛细管测量标记（见 3.2.4）未与参考线对齐，应进行相应调整。</li>
		<li>将毛细管紧贴毛细管长度模板，使用切割石的齐平边缘在模板参考线以下2 mm处切断毛细管两端。</li>
		<li>用放大镜目视检查毛细管两端。若毛细管端面不光滑，使用裂解石的软面进行抛光处理。</li>
		<li>使用O形圈安装工具将光圈O形圈插入光圈塞孔中。</li>
		<li>将装有水并盖好盖子的通用小瓶插入弹匣套管中，并立即将弹匣放入套管，使毛细管末端插入小瓶内。短期和长期储存时，保持在 2-8 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓冲液托盘的制备。
	<ol>
		<li>将带盖通用小瓶装满并放入缓冲液入口和出口托盘中（图1）。根据待分析样品的数量，在第2、3、4和5道中重复放置小瓶位置，每六次样品进样设置一个通道。 
		注意：避免润湿瓶盖，以防电流泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="电泳缓冲液槽设置；进样和出样槽，标注的行列，化学试剂分布。" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：缓冲液进样槽和出样槽中通用瓶的位置及液面高度。 液面高度：1/1 = 1400 µL，3/4 = 1300 µL，1/2 = 1000 µL。缩写：W = 水，HCl = 0.1 M 盐酸。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>毛细管电泳系统组件组装。
	<ol>
		<li>安装紫外检测器。</li>
		<li>将开口杠杆向上压入接口模块中进行安装。</li>
		<li>安装光纤电缆。将对应端插入夹紧杆，并在握住两端的同时顺时针旋转。将另一端连接至紫外检测器。 
		注意：在此操作过程中需小心处理光纤电缆，弯曲可能导致其断裂。</li>
		<li>将样品盘和缓冲液盘放入样品承载系统，并卡入到位。</li>
		<li>将毛细管盒插入接口模块中，同时在两端按压夹紧杆，并拧紧旋钮。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 仪器方法设置
<ol>
	<li>根据以下参数和表1创建仪器的平衡、运行和关机方法：电压，最大值：30.0 kV；电流，最大值：300.0 µA；色谱柱温度：20.0 °C；样品储存温度：10.0 °C；紫外检测器初始条件：波长：214 nm；数据采集速率：4 Hz；滤光：正常；峰宽（点）：16–25；吸光度信号：直接。 
	注意：可将数据采集速率提高至最高25 Hz，以改善窄分离区域的覆盖度。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="8">活化方法时间程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间 (min)</td>
			<td>事件</td>
			<td>数值</td>
			<td>持续时间</td>
			<td>进样瓶</td>
			<td>出样瓶</td>
			<td>摘要</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>1.0 min</td>
			<td>BI:C1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向</td>
			<td>HCl 0.1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>2.0 min</td>
			<td>BI:B1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向</td>
			<td>水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>10.0 min</td>
			<td>BI:E1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向</td>
			<td>BGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.00</td>
			<td>分离 - 电压</td>
			<td>15.0 KV</td>
			<td>10.0 min</td>
			<td>BI:D1</td>
			<td>BO:D1</td>
			<td>0.17 分钟斜坡，正常极性</td>
			<td>分离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.00</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2758 mbar</td>
			<td>10.0 min</td>
			<td>BI:E1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向</td>
			<td>BGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20.01</td>
			<td>等待</td>
			<td>-</td>
			<td>0.0 min</td>
			<td>BI:A1</td>
			<td>BO:A1</td>
			<td>-</td>
			<td>冲洗针尖</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">运行方法时间程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间 (min)</td>
			<td>事件</td>
			<td>数值</td>
			<td>持续时间</td>
			<td>进样瓶</td>
			<td>出样瓶</td>
			<td>摘要</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>1.0 min</td>
			<td>BI:C1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向，进/出样瓶递增6</td>
			<td>HCl 0.1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>2.0 min</td>
			<td>BI:B1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向，进/出样瓶递增6</td>
			<td>水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>4.0 min</td>
			<td>BI:E1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向，进/出样瓶递增6</td>
			<td>BGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>进样 - 压力</td>
			<td>34 mbar</td>
			<td>20.0 sec</td>
			<td>SI:A1</td>
			<td>BO:B1</td>
			<td>覆盖，正向</td>
			<td>样品进样</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>等待</td>
			<td>-</td>
			<td>0.4 min</td>
			<td>BI:A1</td>
			<td>BO:A1</td>
			<td>进/出样瓶递增6</td>
			<td>清洗针尖</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>分离 - 电压</td>
			<td>15.0 KV</td>
			<td>30.0 min</td>
			<td>BI:D1</td>
			<td>BO:D1</td>
			<td>0.17 分钟斜坡，正常极性，进/出样瓶递增6</td>
			<td>样品分离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>自动归零</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30.01</td>
			<td>停止数据采集</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30.02</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>2.0 min</td>
			<td>BI:B1</td>
			<td>BO:C1</td>
			<td>正向，进/出样瓶递增6</td>
			<td>水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32.03</td>
			<td>等待</td>
			<td>-</td>
			<td>0.0 min</td>
			<td>BI:A1</td>
			<td>BO:A1</td>
			<td>进/出样瓶递增6</td>
			<td>冲洗针尖</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32.04</td>
			<td>结束</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>结束</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="8">关机方法时间程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>时间 (min)</td>
			<td>事件</td>
			<td>数值</td>
			<td>持续时间</td>
			<td>进样瓶</td>
			<td>出样瓶</td>
			<td>摘要</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>1.0 min</td>
			<td>BI:E6</td>
			<td>BO:E6</td>
			<td>正向</td>
			<td>HCl 0.1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>冲洗 - 压力</td>
			<td>2068 mbar</td>
			<td>6.0 min</td>
			<td>BI:F6</td>
			<td>BO:F6</td>
			<td>正向</td>
			<td>水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>光源 - 关闭</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>等待</td>
			<td>-</td>
			<td>0.0 min</td>
			<td>BI:A1</td>
			<td>BO:A1</td>
			<td>-</td>
			<td>冲洗针尖</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：运行条件、运行时间和关机程序。
5. 数据采集与处理
<ol>
	<li>设置样品程序。
	<ol>
		<li>使用活化仪器方法对毛细管进行活化程序设置。当毛细管首次使用时，设置活化程序重复四次；其他情况下仅设置重复两次活化程序。</li>
		<li>使用运行仪器方法对需分析的样品进行程序设置。</li>
		<li>使用关机仪器方法对毛细管进行储存程序设置，并重复第3.2.22节中所述操作步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行实验。</li>
	<li>导出电泳图谱。</li>
	<li>通过电泳图谱曲线的垂直切线积分法，计算碱性、主峰及酸性异构体的迁移时间和百分含量。</li>
</ol>

<ol><li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li>
<li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li>
<li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li>
<li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic%2C+Electrophoretic%2C+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+identity%2C+charge+variants%2C+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li>
<li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li>
<li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li>
<li>Štěpánová, S., Kašička, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li>
<li>Altria, K. D. Troubleshooting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltria%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Vol+52.+Capillary+Electrophoresis+Guidebook%3A+Principles%2C+Operation+and+Applications%22">Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications</a>. Altria, K. D. , Chapter 10 (1996).</li>
<li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li>
<li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li>
</ol>

作者 Carlos E. Espinosa-de la Garza、Rodolfo D. Salazar-Flores、Néstor O. Pérez、Luis F. Flores-Ortiz 和 Emilio Medina-Rivero 是 Probiomed S.A. de C.V. 的员工，该公司正在开发、生产和销售生物类似药产品。所有作者均参与了 Probiomed 生物类似药产品的研发工作。

在本教程中，我们强调了在进行单克隆抗体（mAbs）毛细管区带电泳（CZE）分析时遵循正确操作规范的重要性，以提高实验成功的可能性。然而，当CZE被常规使用时，问题不可避免地会出现12。
为获得最佳结果，必须遵循实验方案中各处包含的注意事项，这些提示有助于分析人员克服困难步骤并进行故障排除。在特定条件下获得最佳分离效果的关键因素之一是背景电解质（BGE）溶液的正确配制。该过程需要严格控制缓冲剂的离子强度、非缓冲添加剂的浓度以及pH值。总体而言，毛细管电泳（CE）系统需要精心操作和注重细节。如果忽略与系统清洗或组装相关的任何步骤，系统可能很容易受损。
本方法采用中性毛细管。与未处理的熔融石英毛细管不同，中性毛细管可减少蛋白质在毛细管内壁上的吸附，从而提高分离效率、准确性和重复性9。然而，其使用受限于可进行的进样次数。根据我们的经验，可在不影响分离分辨率的情况下完成120至150次进样，此后因内壁涂层逐渐降解而达到使用寿命。一旦毛细管达到此限值，即需更换新的毛细管。
<p clas...

单克隆抗体（mAbs）是一类生物治疗性蛋白质，因其能够作用于多种慢性及退行性疾病而日益受到关注1。与其他生物分子类似，mAbs 在其生命周期的各个阶段（即从生物合成到最终产品）都容易发生多种理化修饰。这些修饰包括但不限于：脱酰胺、糖基化、氧化、环化、异构化、聚集以及蛋白水解切割2。因此，需要具备分辨内在异构体能力的分析技术，以监测 mAbs 的异质性和稳定性，从而建立质量标准。
毛细管电泳（CE）是一种在窄径熔融石英管内进行的高性能分离技术（&#181;m范围）内填充背景电解质（BGE）。在施加电场（最高30,000 V）后，带电分子向带相反电荷的电极迁移即，电驱动分离）。毛细管电泳（CE）中高电压的使用可实现快速分析并提高效率，优于传统的凝胶电泳。毛细管区带电泳（CZE）是一种基于CE的技术，已在生物制药行业 routinely 用于产品质量评估3-9. 与其他模式的毛细管电泳（CE）不同例如毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦）或基于色谱的方法相比，CZE 可在不使用变性剂或固相界面的情况下进行，从而实现对单克隆抗体固有异质性的分析，且更接近其天然状态10. mAb 异构体的 CZE 分离在涂覆有亲水性聚合物的熔融石英毛细管（中性毛细管）内进行，基于各组分不同的电泳迁移率，后者由电荷、质量、大小和形状（或流体动力学体积）决定11单克隆抗体（mAb）组分在迁移并通过检测窗口时被检测到，该过程由214 nm波长的紫外（UV）吸光度检测器感知。4.
该分析技术的成功实施取决于在实验前和实验过程中对细节的充分关注。若不如此操作，将增加分析的成本和时间，最终导致持续的失败与挫败感。
本文提供了一份逐步指南，通过详细说明溶液和样品的制备、毛细管电泳（CE）系统的准备、仪器方法的设置、数据采集及数据处理，以成功实现利用毛细管区带电泳（CZE）分析单克隆抗体（mAb）异质性。本教程以一种重组全人源抗肿瘤坏死因子α（anti-TNFα）单克隆抗体作为蛋白模型；但通过简单的调整，该方案可轻松适用于其他蛋白的分析。此外，本文还提出多项建议以减少潜在问题的发生。建议读者严格遵循本方案操作，以提高实验成功的可能性。

<table><tbody><tr><td>冰醋酸</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACS级盐酸</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>组胺二盐酸盐</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(羟丙基)甲基纤维素&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>醋酸锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-氨基己酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris缓冲液，50.0 mM，&amp;nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus 药物分析系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP 中性毛细管&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>微量小瓶，200 &amp;micro;l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>通用瓶盖</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>通用小瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>光学电缆，紫外/可见光</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见光检测模块</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>空白盒装配工具包</td><td>Beckman Coulter</td><td>144738</td><td></td></tr></tbody></table>

使用中性毛细管进行单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

生物治疗用蛋白质，例如单克隆抗体（mAbs），是治疗慢性退行性疾病可行的替代方案。这些蛋白质的生物活性取决于其理化性质。已有文献报道采用色谱和毛细管电泳等高效技术来分析单克隆抗体的理化异质性。目前，毛细管区带电泳（CZE）技术已成为分析生物大分子最具分辨力和灵敏度的方法之一。此外，CZE中的电驱动分离基于物质的广延性质，其优势在于能够接近蛋白质天然状态进行分析。然而，该技术在常规分析中的成功应用，依赖于分析人员在样品和系统制备关键步骤中的操作技能。本教程旨在详细说明成功实施单克隆抗体CZE分析的各个步骤。此外，本方案也可用于提升蛋白质分析化学实验室相关人员的技术能力与操作水平。

图2 显示了200 mM EACA、30 mM 醋酸锂、pH 4.8的BGE中抗TNFα单克隆抗体样本（用Tris缓冲液（50 mM，pH 8.0）稀释）的典型电流曲线。如图所示，在整个分析过程中电流保持稳定，可在30至 35 µA. 图3 显示了空白样品的CZE电泳图，其中检测到的峰对应于组胺内标物。组胺的迁移时间预期为3.7至4.1 min。 图4 显示了抗TNFα单克隆抗体的CZE电泳图。可以看出，主峰前后均伴有强度较小的峰。由于分离是在正常极性条件下进行的即从正极到负极，分析结果显示碱性亚型（带正电荷的单克隆抗体变体）比主亚型迁移更快，而酸性亚型（带负电荷的单克隆抗体变体）迁移更慢。
<img alt="电泳电流随时间变化图，30分钟迁移期间电流（µA）的稳定性。" src="/files/ftp_upload/55082/5...

本文介绍了一种全面的毛细管区带电泳方案，用于评估单克隆抗体作为质量属性的内在理化异质性。

生物治疗性蛋白质，例如单克隆抗体（mAbs），是治疗慢性退行性疾病可行的替代方案。

如今，毛细管电泳技术已成为分析单克隆抗体等生物大分子最具分辨力和灵敏度的技术之一。然而，该技术的成功实施依赖于分析人员在样品和系统制备等关键步骤中所具备的知识与操作技能。本教程旨在详细介绍如何成功开展分析，内容涵盖溶液与样品的制备、毛细管电泳系统的准备、仪器方法的设置，以及数据的判读与处理。总体而言，本方案可用于分析化学实验室准备工作中相关人员技能的培养与提升。称取适量 HPMC，使其在 100 毫升溶液中的终浓度为 0.05%。由于 HPMC 是一种基础的弹性聚合物，第一步应将称好的粉末倒入玻璃烧杯中，缓慢加入 80 毫升水，以充分分散粉末。然后，用水冲洗润湿托盘以去除粉末残留。按常规加入剩余试剂并搅拌溶液。用50%的乙酸将pH值调节至4.8。静置溶液5分钟使其稳定。随后根据需要调节pH值。加水定容至100毫升。将制备好的BG溶液通过中性滤膜过滤，倒入玻璃瓶中。最后，正确标记玻璃瓶，并置于冷藏条件下保存。为制备样品，首先在1.5毫升离心管中加入162 µL微量缓冲液。然后加入18 µL先前配制的MAP样品，浓度为10 mg/mL。第三步，加入20 µL先前配制的1%组胺溶液，使最终样品体积达到200 µL。下一步，将样品处理5秒。离心5秒。吸出样品的全部体积，并向上 dispensing 至微量小瓶中，以避免引入气泡。最后，盖上瓶盖并冷藏保存。按下电源开关关闭毛细管电泳仪，并打开前门。在接口块下方放置一块新的移动擦拭垫。使用洗瓶通过接口块用水冲洗电极。让水从孔中滴落，并彻底干燥接口块。使用擦拭纸小心地从电极上去除多余的水分。在此操作过程中，注意不要触碰电极。将擦拭纸从样品固定系统中取出。使用新的、蘸水的无尘擦拭布清洁样品托盘的表面，以及缓冲液托盘的表面。将缓冲液托盘向上滑动，抬起样品固定系统，并用擦拭布清洁其表面。将缓冲液托盘移回原位。随后彻底清洁接口块，清洁夹紧杆和紫外灯外壳。最后，务必在使用前测试系统。用洗瓶中的水冲洗开口杠杆，并用一块新的无绒布彻底清洁其表面，以去除灰尘和积聚的盐分。最后，在安装前务必先进行测试。使用沾水的微纤维布清洁光纤电缆的两端，并确认两端之间的光输出情况。从包装中取出一个新的中性毛细管。将毛细管保护套管的一端取至工作台。解开并拉直塑料套管，小心地将毛细管从套管中抽出。在工作台上用一张纸标出以下尺寸刻度。将毛细管窗口与厘米刻度的零点对齐，具体操作如下：随后用胶带将毛细管两端固定在工作台上。在刻度标记外侧两毫米处标记毛细管两端。剪去远离窗口一端毛细管的保护帽。将毛细管末端浸入装有水的毛细管电泳小瓶中，以避免毛细管内壁涂层受到永久性损伤。从瓶中取出毛细管，并小心地将此端插入卡盒的出口侧。当毛细管从另一侧露出后，轻轻拉出所需长度，使毛细管的检测窗口与卡盒的窗口居中对齐，如下所示。此后，将滤芯翻转，将孔径塞插入滤芯窗口，按压至卡入到位。操

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用中性毛细管单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

本视频介绍了一种利用DsRed-2F5-表位或DFE配体纯化2F5单克隆抗体的亲和层析技术。纯化的2F5单克隆抗体是免疫治疗中的重要药物。...

基于DFE的亲和层析：利用高离子强度洗脱条件从粗样品中纯化2F5单克隆抗体的技术

本视频演示了一种从抗体生产细胞培养所获得的培养上清液中纯化单克隆抗体的技术。该过程采用交联琼脂糖珠基质，其上偶联了蛋白A，可将上清液中的抗体固定在琼脂糖珠上，从而有效分离杂质。通过加入低pH的洗脱缓冲液，可削弱蛋白A与抗体之间的相互作用，便于收集含抗体的组分。...

一种用于纯化单克隆抗体的亲和层析技术

本视频演示了一种毛细管电泳免疫分析方案，用于检测人血小板中与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的蛋白质生物标志物。通过基于分子大小对血小板蛋白进行分离，随后进行化学发光检测，从而确认ALS生物标志物蛋白的存在。...

一种用于蛋白质生物标志物检测的毛细管电泳免疫分析法

与使用蛋白A琼脂糖珠填充柱的传统亲和层析相比，蛋白A膜吸附剂可显著加快实验室规模的抗体及其他表达Fc片段蛋白的分离纯化。 采用适当的分析与定量方法可进一步加速蛋白质处理过程，使分离与表征在一天工作时间内完成，而非20多个工作小时。...

利用蛋白A膜吸附剂和简化的操作流程分离与表征表达人源Fc嵌合蛋白

介绍了一种基于毛细管的免疫分析方法，利用商业平台从总蛋白样品中检测目标蛋白。此外，针对细胞培养模型系统，优化了曝光时间、蛋白浓度和抗体稀释度等分析参数。...

基于自动化毛细管电泳免疫分析方法的实验步骤与关键优化策略

毛细管等电聚焦是一种基于抗体的超灵敏、高通量技术，能够从极微量的生物样品中对蛋白质及其亚型进行详细表征。以下描述了一种自动化和机器人化检测与定量特定蛋白质及其亚型的实验方案。...

通过毛细管等电聚焦方法对蛋白质及其亚型进行高灵敏度定量检测

本文详细描述了从自动化微载体生物反应器收获的细胞培养液（HCCF）中纯化单克隆抗体并进行后续分析的实验方案。同时介绍了如何利用分析方法测定关键质量属性（CQAs），以及如何最大限度地利用有限的样品体积以获取关键信息。...

利用自动化微型生物反应器系统从中国仓鼠卵巢细胞中纯化和分析单克隆抗体

本文介绍了一种采用无鞘流多孔尖端接口设计的毛细管电泳-质谱联用技术对生物样品进行代谢谱分析的实验方案。...

无鞘液毛细管电泳-质谱联用技术用于生物样本的代谢谱分析

本文介绍了一种简单快速的实验方案，通过非变性PAGE结合Western印迹分析，检测人细胞裂解液中动力蛋白样GTP酶MxA蛋白的寡聚状态。...

利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对人源MxA多亚基蛋白复合物的表征

本方案描述了在哺乳动物表达系统中生产治疗性抗体的方法。所述方法包括载体DNA的制备、人胚胎肾293细胞系的稳定转染和无血清适应、大规模培养体系的建立，以及利用亲和层析进行纯化。...

治疗性抗体的小规模生产与纯化

学习毛细管区带电泳技术用于单克隆抗体的理化异质性分析。本方案详细讲解样品制备、系统设置及数据处理步骤，帮助分析化学实验室人员提升操作技能并确保检测结果的可靠性。

使用中性毛细管进行单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

探索更多视频